Део 1: Мапирање епигеномске и транскриптомске међусобне игре током формирања памћења и опозива у ансамблу хипокампалног енграма

За више информација:ali.ma@wecistanche.com

Молимо кликните овде до 2. дела

Асаф Марцо1,2,*, Хируи С. Мехарена1,2, Висхну Дилееп1,2, Равикиран М. Рају1,4, Јосе Давила- Велдерраин3, Ами Зханг2, Цхиннаккаруппан Адаиккан1,2, Јенние З. Иоунг1,2, Фан Гао1, Манолис Келлис3,5, Ли-Хуеи Тсаи1,2,5,*

1Пицовер Институте фор Леарнинг андМеморија, Массацхусеттс Институте оф Тецхнологи, Цамбридге, Массацхусеттс, САД.

2Одељење за мозак и когнитивне науке, Масачусетски институт за технологију, Кембриџ, Масачусетс, САД.

3 Лабораторија за рачунарске науке и вештачку интелигенцију, Масачусетски институт за технологију, Кембриџ, Масачусетс, САД.

4Одељење за медицину новорођенчади, Бостонска дечија болница, Харвардска медицинска школа, Бостон, Масачусетс, САД.

5Броад институт Харварда и МИТ-а, Кембриџ, Масачусетс, САД.

Кликните да бистеЦистанцхе витамин схоп и Цистанцхе за памћење

Апстрактан

Епигеном и тродимензионална (3Д)-геномска архитектура се појављују као кључни фактори у динамичкој регулацији различитих транскрипционих програма потребних за неуронске функције. Овде користимо систем означавања који зависи од активности код мишева да одредимо епигенетско стање, архитектуру 3Д генома и транскрипциони пејзаж ћелија енграма током животног векамеморијаформирање и опозив. Наши налази то откривајумеморијакодирање доводи до епигенетског прајминг догађаја, обележеног повећаном доступношћу појачивача без одговарајућих транскрипционих промена.Меморијаконсолидација затим резултира просторном реорганизацијом великих сегмената хроматина и интеракцијама промотера и појачивача. Коначно, са реактивацијом, енграмски неурони користе подскуп деново-дуголетних интеракција, где су припремљени појачивачи доведени у контакт са својим одговарајућим промотерима да би се регулисали гени укључени у локално превођење протеина у синаптичким одељцима. Заједно, наш рад разјашњава свеобухватну транскрипцију и Корисници могу да виде, одштампају, копирају и преузимају текст и податке о садржају у таквим документима, за академско истраживање, увек подложни пуним Услови коришћења: хттп://ввв.натуре. цом/аутхорс/едиториал_полициес/лиценсе.хтмл#термс

*Кореспонденција са: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.

Доприноси аутора:

АМ и Л.-ХТ су осмислили и дизајнирали пројекат. АМ и АЗ су извели експерименте понашања, ИСХ, имунобојење и МАРИС анализу. ЦА је извршио ињекцију вируса и имунобојење. АМ и ХСМ су извели АТАЦ-сек експерименте. АМ и АЗ су извели експерименте нуклеарне РНК секвенце. АМ, ХСМ и ВД су извели пц-Хи-Ц и Хи-Ц експерименте. АМ, ХСМ, ВД, РМР и ЈДВ су извршили АТАЦ-сек анализу. АМ, РМР, ХСМ, ВД и ФГ су извршили анализу нуклеарне РНК секвенце. АМ, ВД, ХСМ и РМР су извршили пц-Хи-Ц и Хи-Ц анализу. Сви аутори су помогли у тумачењу података. АМ, ХСМ, ВД, РМР, ЈЗИ, МК и ЛХТ су написали рукопис уз доприносе свих аутора. ЛХТ је обезбедио алате и надгледао пројекат.

Такмичарски интереси:

Аутори изјављују да не постоје конкурентни интереси.

епигеномски пејзаж током животног векамеморијаформирање и опозив у ансамблу хипокампалног енграма.

Формирање и очување дуготрајне меморије зависи од координисане експресије гена и синтезе синаптичких протеина1. Ови молекуларни процеси делују унутар специфичне популације неурона, која се назива енграмске ћелије2–4. Недавни приступи који користе изражавање репортера зависно од активности пружили су оквир за истраживање ансамбла енграма5–8, али молекуларни механизми који управљајумеморијаскладиштење и преузимање остају слабо схваћени. Конкретно, епигенетске модификације и 3Д-геномска архитектура се појављују као кључни фактор у динамичкој регулацији експресије гена9–17, и постоји све веће уважавање њиховог значаја у неуронској функцији, развоју и болести14, 16, 18

Овде смо користили модел миша са циљаном рекомбинацијом у активним популацијама (ТРАП) 5,6, у којем су активирани неурони који експримирају протеин повезан са цитоскелетом регулисаним активношћу, (Арц) ген, трајно означени на индуцибилан начин. Активирани неурони токоммеморијакодирање, консолидација и опозив су сортирани и подвргнути секвенцирању нуклеарне РНК (нРНА-сек), тесту за хроматин приступачан за транспозазу коришћењем секвенцирања (АТАЦ-сек) и хватању конформације хромозома (Хи-Ц). Наши подаци то показујумеморијакодирање доводи до повећања доступности хроматина у целом геному, без очекиваних промена у експресији гена. Штавише, показујемо да је касна фаза консолидације меморије била повезана са поновном локализацијом великих сегмената хроматина (под-компартмента) из неактивног у пермисивно окружење, и реорганизацијом пејзажа интеракције промотор-појачивач. Коначно, реактивација неурона токоммеморијаопозив је повезан са интеракцијама деновопромотера и појачивача, користећи велики подскуп појачивача који су били припремљени токоммеморијакодирање. Ове интеракције промотера и појачивача су повезане са снажном променом у експресији гена укључених у локалну синтезу протеина и синаптичку морфогенезу.

Резултати

Временска и просторна идентификација активираних и реактивираних енграмских ћелија

Праћење неуронске активности током времена био је један од главних изазова приликом проучавања енграмских ћелија, пошто се маркери за неуронску активност, познати као непосредни рани гени (ИЕГ), враћају на почетну линију убрзо након индукције1,2. Да бисмо превазишли ово ограничење, искористили смо предност модела ТРАП5,6, који захтева два трансгена, један који експримира ЦреЕРТ2 из промотора Арц зависног од активности и један који омогућава експресију репортера жутог флуоресцентног протеина (еИФП) у Цре- зависан начин. Примена тамоксифена (ТАМ) ТРАП мишевима доводи до трајне ознаке еИФП у активираним неуронима лука. Без ТАМ-а, ЦреЕРТ2 се задржава у цитоплазми и еИФП није изражен (Проширени подаци, слика 1а). ТРАП мишеви су били подвргнути класичној Павловској парадигми контекстуалног условљавања страха (ЦФЦ) (слика 1а), методи која се обично користи за проучавање аверзивних сећања19. Отприлике 1,5–2 сата након излагања ФС, сакупљени су мозгови да би се идентификовали и) РНА везујући протеин фок-1 хомолог 3 (Рбфок3) такође познат као НеуН плус и еИФП плус означени неурони који су активирани током почетног излагања (активирано -рано), који се може разликовати од ии) НеуН плус /еИФП- неактивираних неурона базалног стања (Басал) (слика 1а). Након пет дана, у недостатку преузимања, прикупили смо иии) НеуН плус /еИФП плус неуроне који су означени на дан тренинга, што означава дуготрајнемеморијаконсолидација (Активирано-касно). У а

различита кохорта, мишеви су поново изложени условљеном стимулусу и накнадна експресија ендогеног АРЦ протеина је анализирана 1,5-2 сата након поновног излагања. Ово је омогућило идентификацију ив) двоструко позитивних НеуН плус /еИФП плус / ендогених неурона Арц плус енграма који су активирани током тренинга и поново активирани токоммеморијаопозив (поновно активиран). Приметно је да се рекомбинација ДНК можда неће у потпуности десити 1,5–2 х након ФС, приметили смо високу ко-локализацију (у просеку од 84 процента) између ендогеног Арц протеина и Арц:еИФП репортера (Проширени подаци, слика 1б), који је такође био у складу са претходним извештајима20.

За потврдумеморијакодирање и опозив током ЦФЦ, понашање замрзавања је забележено током тренинга и поновног излагања знаковима који изазивају страх (Проширени подаци, слика 1ц). У складу са претходним публикацијама6,20, наши подаци су показали значајно повећање броја еИФП плус (активираних раних и касних) неурона у хипокампусу, у поређењу са мишевима који су остали наивни на ЦФЦ у свом кућном кавезу (Ф (2, 70)=240.3, П<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">

Формирање меморије је повезано са повећаном доступношћу хроматина, претежно на појачивачима

Да бисмо боље разумели молекуларне силе које управљају различитим транскрипционим програмима, измерили смо промене доступности хроматина широм генома у различитим фазамамеморија. Хипокампална ткива су спојена и изолована језгра (проширени подаци, слика 2а, додатна табела 1) су подвргнута припреми АТАЦ-сек библиотеке. Анализа диференцијално доступних региона (ДАР) (Диффбинд, ДЕСек2 режим) између свих популација (слика 2а) открила је да се већина промена у стању хроматина дешава током ране фазе формирања меморије, где 7,862 региона широм генома добијају приступачност (Басал вс. Еарли, Додатна табела 2). Насупрот томе, приметили смо релативно минималне промене у стању хроматина при преласку са Активирано-рано на Активирано-касно (582 ДАР-а) и између Активирано-касно и Реактивираних неурона (725 ДАР-а), са 48% преклапања између њих (Проширени подаци, Слика 2б). ). Занимљиво је да смо идентификовали велики проценат (52 процента) стабилно добијених ДАР-ова који су постали доступнији у Активирано-раном и остали доступни иу Активирано-касном и Реактивираном неуронима (Слика 2б,ц; Додатна табела 2). Занимљиво је да су и ране промене (Басал вс. Еарли) и стабилно добијене ДАР обогаћене за интергенске регионе, касне промене хроматина (Еарли вс. лате и Лате вс. Реацтиватед) су углавном обогаћене за промоторска места, (Слика 2д).

Функционални увид је дат проценом како су ДАР-ови обележени различитим модификацијама хистона. Прво смо користили ЦхромХММ да успоставимо модел стања хроматина из две независне студије које су користиле масивно ткиво хипокампуса пре и после шока стопала 21,22. Затим смо извршили анализу обогаћивања (уочено преко очекиване дистрибуције) ДАР-ова за ова различита стања и открили да су ране промене хроматина и стабилни ДАР-ови обогаћени за ознаке појачивача (слика 2е; проширени подаци слика 2ц, додатна табела 3) .

Ови резултати су у складу са претходним публикацијама, показујући да стимулација примарне неуронске културе индукује продужену активност појачивача12,23. Затим смо анализирали преклапање појединачних стабилних локуса са Х3К4ме1 и Х3К27ац21. Ове две хистонске ознаке оцртавају различите популације појачивача, који могу бити или 'примирани' (само Х3К4ме1), 'активни' (Х3К4ме1 и Х3К27ац) или 'латентни' (без ознака)18. Стабилни пикови су показали дистрибуцију и на примјеним и на активним појачивачима (проширени подаци, слика 2д), при чему се предвиђало да ће 47 процената ових места бити 'латентно' (без преклапања између ДАР-а и хистонских ознака21 добијених 1 сат након ФС). Да бисмо потврдили наш модел, извршили смо имунопреципитацију хроматина (ЦхИП) за хистонске маркере Х3К4ме1 и Х3К27ац, након чега је уследио кПЦР. Четири одабрана места су изабрана из наше претпостављене анализе моделирања појачивача (Проширени подаци, слика 2д; Енханцер 1 – предвиђени примирани, Енханцер 2- предвиђени активни, Енханцер 3 и 4 – предвиђени латентни). У складу са нашим моделом, идентификовали смо два „латентна“ локуса у базалном стању (појачивачи 3 и 4) који су се трансформисали у „активно“ стање токоммеморијаформирање (сл. 2ф). Штавише, утврђено је да је наводни појачивач 1 био 'примиран' у базалном стању и постао активан, где је дошло до значајног стабилног повећања маркера Х3К27ац током касне фазе и опозива (слика 2ф). Заједно, ови подаци указују на то да је репертоар новодоступних појачивача проширен у потенцираним енграмским неуронима, где су латентни или примирани региони добили ознаке Х3К4ме1 и Х3К27ац и тако постали активни појачивачи.

Да бисмо разумели функционалну улогу приступачних региона промотера и појачивача, извршили смо анализу обогаћивања мотива (додатна табела 4). Наши подаци показују да је већина (70 одсто) мотива на доступним промотерима подједнако обогаћена и идентификована у свим фазамамеморија(Проширени подаци, слика 2е). Насупрот томе, већина места појачивача показала је различите обрасце мотива везивања фактора транскрипције (ТФ) у различитим меморијским фазама. Занимљиво је да су свеприсутно изражени мотиви из Јун прото-онкогена, подјединице транскрипционог фактора Ап-1 (тј. Јун-Ап1) и породице регулаторног фактора Кс (Рфк) ТФ, значајно обогаћени тек након почетне фазе кодирање (Проширени подаци слика 2е). Раније је објављено да комплекс Јун-Ап1 игра централну улогу у селекцији појачивача и да може деловати као пионирски ТФ за дефинисање места појачивача током развоја мозга и неуронске активности12,24. Ови налази су у складу са нашим подацима који су показали висок проценат латентних/примираних локуса у базалном стању (слика 2ф, проширени подаци, слика 2ц,д). Стога се чини да неуронска активност може покренути везивање Јун-Ап1 за латентне појачиваче, који затим регрутују модификаторе хроматина који активирају латентне појачиваче. Слично томе, обогаћивање мотива фактора транскрипције Јин Јанг 1 (Ии1) само у појачивачима из раних и касних стања, сугерише да је организација промотера-појачивача активан процесмеморијаформирање, пошто је недавно објављено да Ии1 олакшава формирање ових дуготрајних интеракција25. Збирно, ови подаци сугеришу да је почетна фаза одмеморијаформирање мења пејзаж приступачности хроматина у активираним неуронима, при чему се дуготрајне стабилне промене дешавају претежно унутар региона појачивача.

Динамичке промене у просторној нуклеарној архитектури и доступности хроматина током иницијалногмеморијаформирање одговара повећању учесталости интеракција промотер-појачивач токоммеморијаповрат

Нуклеарна 3Д архитектура се појављује као кључни фактор у динамичкој регулацији експресије гена, у многим неуронским функцијама26–28. Стога смо били заинтересовани да оцртамо прецизне промене које се дешавају у просторној организацији хроматина токоммеморијаформирање и консолидација. Произвели смо Хи-Ц податке из базалног стања и еИФП плус означених неурона (рано и касно, додатна табела 5). Хроматин је подељен у два просторно различита субнуклеарна одељка, 'А' и 'Б', који одговарају транскрипционо активном и неактивном хроматину, респективно15, 16,26. Рани докази сугеришу да неуронска активност и екстринзична сигнализација могу изазвати реорганизацију 3Д-хроматинске архитектуре14,27,28. Наша анализа стања компартмента 15, 16, 26 (Слика 3а–ц) открила је поновну локализацију великих сегмената хроматина из неактивног (Б) у пермисивно окружење (А) (и обрнуто) током почетне и касне фаземеморијаформирање (212 сегмената пребачено са А на Б, 127 са Б на А, просечна величина од ~436Кбп). Занимљиво је да је 52 процента региона у раној фази који су прешли са Б на А задржало то стање у касној фази (тј. остало у стању А, слика 3б,ц; Додатна табела 6). Штавише, скоро сви ови региони су се преклапали са добијеним ДАР-овима из наше АТАЦ-сек анализе, потврђујући прелазак под-компартмента из неактивног у пермисивно окружење (слика 3д). Ови подаци указују на то да се неки локуси подвргавају пребацивању под-компартмента у различитим меморијским фазама, и стога могу допринети дугорочним променама у својствима и функцији неурона након почетне активације.

Док су наши Хи-Ц подаци сугерисали реорганизацију великих размера, остало је нејасно да ли је ова преоријентација омогућила интеракцију нових репертоара промотера-појачивача и фино подешавање различитих транскрипционих програма (слика 3е). Користећи Хи-Ц технику хватања промотера (пц-ХиЦ), проучавали смо прецизне промене које се дешавају у интеракцијама промотера и појачивача током процесамеморијаформирање и опозив. За ову студију користили смо прилагођене „мамце“ који циљају ~5000 промотера29. У складу са претходним публикацијама29, открили смо ~19.000 (по групи) значајних интеракција промотера-појачивача (67,5 процената) и промотера-промотера (46,2 процената) (проширени подаци, слика 3а,б).

Пошто промотори у мозгу сисара могу бити под контролом вишеструких регулаторних елемената14,30,31, анализирали смо преклапање између свих појачивача у интеракцији и њихових одговарајућих промотера. То смо открили током свакемеморијафази, исти промотери чешће ступају у интеракцију са различитим подскупом појачивача (тј. јединствени, базални – 3243, рани - 7602, касни - 7028, реактивирани – 7244; слика 4а,б; проширени подаци, сл. 3ц; Додатна табела 7). Овај резултат је у складу са претходним публикацијама које показују да су вишеструки појачивачи који окружују неколико гена (ц-Фос и Арц) кључни за њихову активацију и да је њихова учесталост интеракције са одговарајућим промотерима промењена као одговор на различите деполаризационе агенсе у култивисаним неуронима31. Такође смо идентификовали мањи подскуп интеракција у којима су промотери били у интеракцији са истим појачивачима у различитиммеморијафазе (тј. уобичајене, ~31 проценат свих интеракција; Додатна табела 7). Штавише, реактивирани неурони су дали значајно јаче резултате интеракције (према прорачуну Чикага, слика 4б; проширени подаци слика 3д). Стога, иако је број јединствених интеракција био сличан у раним, касним и реактивираним стањима, јачи резултати интеракције указују на то да се специфичне интеракције промотера-појачивача дешавају чешће током памћења.

поврат. Овај појам је даље потврђен експериментима 3Ц, са прајмерима дизајнираним да мере учесталост интеракције између одабраног појачивача (Е) и генских промотера (П) који кодирају за еукариотски фактор иницијације транслације 3 подјединицу Д (Еиф3д) или глутаматни рецептор, јонотропни, каинатни 3 (Грик3) (слика 4ц). Наши подаци су показали да су реактивирани неурони имали значајно повећање учесталости интеракције између Еиф3д промотера и одабраног појачивача, у поређењу са другим популацијама (слика 4ц). Заједно, ови подаци указују на то да се интеракције промотер-појачивач дешавају чешће токоммеморијаповрат.

Затим смо питали да ли динамичке интеракције дугог домета идентификоване преко пц-ХиЦ одговарају регионима хроматина који постају доступнији, као што је одређено преко АТАЦ-секв. Ово би потврдило да повећана доступност има функционалну последицу у стварању нових интеракција промотер-појачивач. Да бисмо то постигли, упоредили смо преклапање између појачивача у интеракцији у свакој ћелијској популацији са ДАР-овима (уочено) или насумични скуп приступачних геномских локуса (очекивано). Наша анализа је открила значајно преклапање између оба добијена ДАР-а у Активираним раним неуронима и стабилно добијених ДАР-а са појачивачима у интеракцији, у свим популацијама ћелија (Сви Пс < 0.0001,="" проширени="" подаци,="" слика="" 3е).="" насупрот="" томе,="" промене="" у="" доступности="" хроматина="" које="" су="" се="" десиле="" током="" касне="">меморијаконсолидација и реактивација се нису значајно преклапале са појачивачима у интеракцији (Проширени подаци, слика 3е). Заједно, ови резултати указују на то да је добијање приступачности током меморијског кодирања почетни догађај и ови припремљени локуси учествују у де-ново функционалним интеракцијама промотера-појачивача током каснијих фазамеморијаформација. Овај динамични пејзаж је илустрован визуелизацијом геномских региона око еукариотског гена иницијације транслације 5 подјединице А (Еиф5а) (слика 4д). Ова привремена молекуларна дисекција животног века енграма наглашава како је координисано припремање епигенетског стања ћелије токоммеморијакодирање и консолидација олакшава дуготрајне интеракције током реактивације.