Део 1 Превентивни ефекти фенилетанол гликозида из Цистанцхе Тубулоса на фиброзу јетре индуковану албумином говеђег серума код пацова

Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Апстрактан

Позадина:Цистанцхе тубулоса је традиционални кинески биљни лек који се широко користи за регулисање имунитета.Фенил етанол гликозиди из цистанцхе(ЦПхГ) из ове биљке су првенствено ефикасни материјали. Циљ ове студије је био да се процени превентивни и терапеутски ефекат ЦПхГ на фиброзу јетре изазвану БСА код пацова и сродне молекуларне механизме који укључују звездасте ћелије јетре. Биејиаранган (БЈРГ), још један традиционални кинески биљни лек, коришћен је као позитивна контрола. Методе: У ин виво експериментима, 75 СД пацова је насумично подељено у 6 група: нормални (третирани дестилованом водом), модел (третирани БСА), позитивни лек (третирани БСА плус БЈРГ 60{{29} } мг/кг/дан), и групе третиране БСА плус ЦПхГ (125, 250 и 500 мг/кг/дан). Индекси јетре и слезине, нивои аспартат аминотрансферазе (АСТ), аланин аминотрансферазе (АЛТ), хексадеценске киселине (ХА), ламинина (ЛН), проколагена типа ИИИ (ПЦИИИ), колагена типа ИВ (ИВ-Ц), хидроксипролина ( Хип) и трансформишући фактор раста 1 (ТГФ- 1) мерени су у јетри пацова. Хистопатолошке оцене за фиброзу јетре су процењене за сваку групу коришћењем Х&Е и Массон-овог трихромног бојења. Експресија ТГФ- 1, колагена И (Цол-И) и колагена ИИИ (Цол-ИИИ) одређена је методом имунохистохемијског бојења. Ови ефекти су даље процењени ин витро одређивањем нивоа експресије НФ-κБ п65 и Цол-И квантитативним ПЦР анализама у реалном времену. Експресија Цол-И протеина је такође испитана Вестерн блоттингом. Резултати: Све дозне групе (125, 250 и 500 мг/кг/дан) ЦПхГс значајно су смањиле индекс јетре и слезине, смањиле АЛТ, АСТ, ХА, ЛН, ПЦИИИ, ИВ-Ц серумске нивое, Садржај ТГФ- 1 (П < 0,01,="" п="">< 0,01="" и="" п="">< 0,01)="" и="" садржај="" хип.="" цпхг="" су="" такође="" значајно="" ублажили="" отицање="" ћелија="" јетре="" и="" ефикасно="" спречили="" некрозу="" хепатоцита="" и="" инфилтрацију="" инфламаторних="" ћелија.="" имунохистохемијски="" резултати="" су="" показали="" да="" цпхг="" значајно="" смањују="" експресију="" тгф-="" 1="" (п="">< 0,01,="" п="">< 0,01="" и="" п="">< 0,01),="" цол-и="" и="" цол-иии.="" ин="" витро="" ефекти="" цпхг="" (100,="" 75,="" 50="" и="" 25="" уг/мл)="" на="" хсц-т6="" показали="" су="" да="" цпхг="" значајно="" смањују="" експресију="" мрнк="" нф-κб="" п65="" и="" цол-и,="" а="" цпхг="" такође="" смањују="" експресију="" цол-и="" протеина.="" закључци:="" цпхг="" имају="" значајан="" ефекат="" анти-хепатичне="" фиброзе="" и="" могу="" се="" користити="" као="" хепатопротективни="" агенси="" за="" лечење="" фиброзе="">

Кључне речи: фиброза јетре, Цистанцхе тубулоса, Фенилетанол гликозид, Хемокин БСА, Превенција и терапија.

Позадина

Фиброза јетре је одговор на зарастање рана на тешку повреду јетре која се јавља у патогенези хроничног хепатитиса изазваног различитим факторима. Ови фактори су вирусна инфекција, злоупотреба алкохола, холестаза, метаболичке и аутоимуне болести [1–3]. Прогресивна акумулација екстрацелуларног матрикса (ЕЦМ) и смањено ремоделирање ремете нормалну архитектуру јетре, што доводи до фиброзе јетре [4]. Фиброза јетре је критична код хроничне болести јетре и често се развија у иреверзибилну цирозу и карциногенезу. Тренутно не постоје методе или ефикасни лекови за лечење фиброзе јетре. Због тога је хитно потребно пронаћи лек против фиброзе јетре који ће ублажити прогресију повреде јетре до фиброзе и рака.Цистанцхе тубулосаВ (из фамилије Оробанцхацеае) је паразитска биљка која се широко узгаја у јужном региону Синђанга у Кини [5]. Људи га обично користе за јачање бубрега, исхрану крви, опуштање црева и одлагање старења. Званично је наведен у кинеској фармакопеји [6]. Ц. тубулоса садржи различите активне компоненте. Ови укључујуФенил етанол гликозиди из цистанцхе(ЦПхГс), иридоиди и полисахариди. Као једна од многих активних компоненти уЦ. тубулоса, ЦПхГ су показали убедљиве антиоксидативне, анти-уморне, неуропротективне и антиинфламаторне ефекте у ин виво и ин витро студијама [7]. Последњих година је пријављено да ЦПхГс(Фенил етанол гликозиди из цистанцхе) имају хепатопротективно дејство. Потенцијални механизми који леже у основи ових ефеката су уклањање слободних радикала, заштита хепатичних мембрана, имунорегулација, инхибиција апоптозе, инхибиција експресије ХБсАг и ХБеАг и инхибиција репликације ХБВ ДНК и други [8–11]. Међутим, неколико студија у литератури бави се ефектом графике против јетрене фиброзе. Стога је ова студија имала за циљ да истражи ефекат ГПхЦ на анти-хепатичну фиброзу коришћењем модела јетрене фиброзе индуковане албумином говеђег серума (БСА) код пацова. Сродни молекуларни механизми су испитивани у ХСЦ-Т6 ћелијама.

Методе

Хемикалије и реагенси

Хидроксипролински комплет (алкална хидролиза) (Лот: 20140616) је купљен од Института за биоинжењеринг у Нањинг Јианцхенг (Кина). Пацов ТГФ- 1 сендвич ЕЛИСА сетови (Лот: 238240615) су купљени од Лианке Биотецх Цо., Лтд. (Кина). Зечје антитело на колаген И (лот: 140619), антитело на зечји анти-колаген ИИИ (лот: 980788 В) и зечје анти-ТГФ- 1 антитело (лот: 140619) обезбедила је компанија Беијинг Биосинтхесис Биотецхнологи Цо., ЛТД (Кина). У пакету са нормалним овчијим серумом (радна течност) (Партија: ВП141214), ПВ-6000 (Партија: ВК141225) и ДАБ комплет (Партија: К136621Д) купљени су од Зхонгсхан Голден Бридге Биотецх Цо., Лтд. (Кина) . Детекција примарних антитела је обављена коришћењем 2. раствора антитела (Алк-Пхос. Коњуговани, Анти-зечји) и 2. раствора антитела (Алк-Пхос. Коњуговани, Анти-миш) (партија: 272387) купљеног од компаније Инвитроген (САД). ). Говеђи серум албумин (БСА) (Лот: СЛБГ8239В) је купљен од Сигме (САД). Пре употребе, БСА је припремљен на 18 г/Л у нормалном физиолошком раствору, бактерије су уклоњене филтрацијом, а БСА чуван на 4 степена. Фројндов некомплетан адјуванс који садржи 1 г липида из овчије длаке (Лот: АФ0220ЛА14, Схангхаи иуан ие Био-Тецхнологи Цо., Лтд. (Кина,)) помешан је са 2 г течног парафина (Лот: 20130815, Тиањин Фуиу Фине. Лтд. (Кина), стерилисан у парном аутоклаву и чуван на 4 степена. Позитивни лек БЈРГ је добијен као Биејиаранган таблете од Иннер Монголиа Фуруи Медицал Сциенце Цо., Лтд. (Кина). Залихе лекова БЈРГ су припремљене растварањем БЈРГ таблете у дестилованој води у концентрацији од 600 мг/кг.

Биљни материјали

Ц. тубулоса(породица Оробанцхацеае) купљена је из региона Минфенг у Синђангу у Кини. Материјал је потврдио истраживач Јун Зхао, Кључна лабораторија за ујгурску медицину, Институт Материа Медица из Синђианга. Узорци ваучера депоновани су у Институт Материа Медица у Синђијангу.

Припрема ЦПхГ(Фенил етанол гликозиди из цистанцхе)

Осушени и исечени ризомиЦ. тубулоса(60 кг) су узастопно екстраховани под рефлуксом три пута са 70 процената етанола, а растварач је уклоњен да би се добио етанолни екстракт. Етанолни екстракти су пречишћени коришћењем АБ-8 смоле да би се добили фенил етанол гликозиди (ЦПхГс). Основни раствори ЦПхГ-а који се користе за различите дозне групе у студијама на животињама (500 мг/кг, 250 мг/кг и 125 мг/кг, респективно) растворени су у 0,5 процената (5 г/Л) карбоксиметил целулозе (натријумова со).

Квантификација ЦПхГ(Фенил етанол гликозиди из цистанцхе)

Садржај две компоненте (ехинакозида и актеозида) у ЦПхГ је одређен ХПЛЦ користећи претходно објављену методу (Зханг ет ал. 2004) [12]. ХПЛЦ је изведен коришћењем Схимадзу ЛЦ-10А ХПЛЦ опремљеног УВ детектором. ХПЛЦ колона је била Пхеноменек Гемини ОДС колона (250 × 4,6 мм, 5 μм). Изократска мобилна фаза се састојала од метанол-ацетонитрил-1 процената сирћетне киселине (15:10:75, в/в/в). Елуирање је трајало 40 мин, а брзина протока је одржавана на 0,6 мЛ/мин. Температура колоне је одржавана константном на 30 степени. УВ детекција је била на 334 нм.

Животиње и ћелијска линија ХСЦ-Т6

[Граде СПФ] здрави одрасли мужјаци Спрагуе-Давлеи (СД) пацова (180–220 г) купљени су од Центра за животиње Медицинског универзитета Синђианг, број лиценце: СЦКСК (ново) 2011–0004. Пацови су храњени храном без специфичних патогена (СПФ). Све процедуре везане за експерименте на животињама одобрио је Комитет за етику животиња Прве придружене болнице Медицинског универзитета Синђианг. Пацови су смештени у кавезе у контролисаним условима околине (25 степени и циклус светлости/мрака од 12 сати) и имали су слободан приступ стандардној храни за пацове и води из чесме. Пацови су аклиматизовани пре третмана. Бесмртна звездаста ћелија јетре пацова, ХСЦ-Т6, добијена је од Вухан Процелл Гене Биотецхнологи Цо., ЛТД. (Вухан, Кина). ХСЦ-Т6 ћелије су узгајане у Дулбеццо-овом модификованом орловом медијуму (висока глукоза) (ДМЕМ, Пекинг, Кина) са додатком 10 посто феталног говеђег серума (Гибцо, Јужна Америка), 100 ИУ/мл пеницилина и 100 уг/мл стрептомицина (Беијинг , Кина) у влажном инкубатору на 37 степени са 5 процената ЦО2.

Повреда јетре изазвана БСА и лечење

Седамдесет пет СД пацова је насумично подељено у шест група: нормални (третирани дестилованом водом), модел (третирани БСА), позитивни лек (третирани БСА плус БЈРГ 600 мг/кг/дан) и третирани БСА плус ЦПхГ(Фенил етанол гликозиди из цистанцхе)(125, 250, 5{{20}}0 мг/кг/дан) групе. Групе које су третиране БСА плус ЦПхГ (125, 250, 500 мг/кг/дан) имале су 13 пацова у свакој групи, а друга група је имала 12 пацова у свакој групи. Модел повреде јетре изазван БСА подељен је на примарну сензибилизацију праћену имунолошким нападом) [13]. Осим нормалне групе, другим групама су даване више субкутаних ињекција са 0,5 мл (9 мг/мл) БСА Фреундовог непотпуног адјуванса 1., 15., 22., 29. и 36. дана за примарну сензибилизацију. Седам дана након пете ињекције, крв је добијена кроз ретинални венски плексус пацова и тестирана на антитела на албумин у серуму. БСА антитело у серуму пацова детектовано је методом дифузије двоструког агара. Нападна ињекција је изведена давањем 0,4 мл БСА у нормалном физиолошком раствору кроз каудалну вену код пацова позитивних на БСА антитела два пута недељно по десет пута. Концентрације и времена ињекција су били 5.00, 5.50, 6.00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 и 10.00 г/Л на дан 46, дан 50, дан 53, дан 57, дан 60, дан 64, дан 67, дан 71, дан 74 и дан 78, респективно. У нормалној групи, нормални физиолошки раствор је коришћен за имунолошке примарне (сензибилизација) и секундарне (напад) ињекције уместо БСА, а остали услови су били исти као у моделној групи. Нормалној групи је орално давана дестилована вода у дози од 10 мл/кг/дан. Групи модела је орално давано 10 мл/кг/дан 0,5% раствора ЦМЦ-На. Позитивној групи лека је орално давана 600 мг/кг/дан БЈРГ. БСА третирани плус ЦПхГ (125,

Групе од 250 и 500 мг/кг/дан) орално су даване 125, 250 и 500 мг/кг/дан ЦПхГс(Фенил етанол гликозиди из цистанцхе), редом. Дневно дозирање пацова је настављено две недеље након последње ињекције. Након експерименталног периода, пацови су гладни 12 сати пре 10 процената хлорал хидрата, а затим су одмах еутаназирани. Узорци серума су сакупљени од сваког пацова и одмах коришћени. Јетра су сакупљена у две сврхе: (1) очување у течном азоту за Хип комплете и (2) фиксација у 10 процената формалдехида за хистолошка и имунохистохемијска испитивања. Целокупно трајање студија на животињама било је 93 дана.

Индекси јетре и слезине

Јетра и слезина су сециране лапаротомијом и испране нормалним физиолошким раствором од 4 степена. Након апсорбовања вишка воде филтер папиром, јетра и слезина су измерене да би се израчунали одговарајући индекси: Релативна тежина органа=маса органа (г)/појединачна телесна маса (г) × 100 процената [14].

Експерименти са ћелијама

ХСЦ-Т6 ћелије су постављене у плочу са 96-бунарићима. У почетку, ћелије су култивисане са ДМЕМ који садржи 10 проценат ФБС током 48 х. Медијум је затим замењен са ДМЕМ без ФБС да би се ћелије изгладњиле 12 х. Ћелије су затим култивисане са ДМЕМ који је садржао 5,0 нг/мЛ ТГФ- 1 (без ФБС) током 24 х. Коначно, различите концентрације ЦПхГ(Фенил етанол гликозиди из цистанцхе)(100 уг/мл, 50 уг/мл и 25 уг/мл), актеозид (6 уг/мл, 3 уг/мл и 1,5 уг/мл) и ехинакозид (500 уг/мл, 250 уг/мл и 125 уг/мл) изведени су на плочи у четвороструким бунарчићима и инкубирани 48 х.

ПЦР анализа у реалном времену

Ниво експресије мРНК НФ-κБ, п65 и колагена И одређен је ПЦР-ом у реалном времену. Да би се одредила експресија мРНК у ХСЦ-Т6 ћелијама, ћелије (4 × 105 ћелија) су засејане у плоче са шест јажица са 3 мЛ ДМЕМ са 10 процената ФБС и инкубиране преко ноћи на 37 степени и 5 процената ЦО2, након чега је медиј ћелијске културе су промењени у ДМЕМ без серума. Следеће, ЦПхГс(Фенил етанол гликозиди из цистанцхе)(100 уг/мл, 50 уг/мл и 25 уг/мл), актеозид (6 уг/мл, 3 уг/мл и 1,5 уг/мл) и ехинакозид (500 уг/мл , 250 уг/мл и 125 уг/мл). После 48 х инкубације са ЦПхГ или мономерним композицијама, укупна РНК је екстрахована коришћењем ТРИзол реагенса (Инвитроген, САД) и снажно мешана са хлороформом током 15 с. После седења на собној температури током 3 минута, лизат је центрифугиран на 12,000 × г током 15 минута на 4 степена. РНК у воденој фази је преципитирана са изопропанолом, а горња водена фаза је пребачена у нову микроцентрифугалну епрувету. РНК је преципитирана додавањем 0,75 процената етанола, након чега је епрувета за микроцентрифугу и центрифугирана на 12,000 × г на 4 степена не више од 5 минута. Супернатант је уклоњен и РНК је сушена на собној температури 5-10 мин. Специфични сетови прајмера (Сангон, Шангај, Кина) који су коришћени за амплификацију -актина пацова [ГенБанк: НМ_031144.3], Цоллаген И [ГенБанк: НМ_ 053304.1] и НФ -κБ п65 [ГенБанк: НМ_199267.2] гени су дизајнирани коришћењем Батцх Пример 3. Предњи (фв) и реверзни (рв) прајмери ​​су били следећи: Колаген И (фв: ГГА ГАГ АГЦ АТГ АЦЦ ГАТ ГГ , рв: ГГГ АЦТ ТЦТ ТГА ГГТ ТГЦ ЦА), НФ-κБ п65 (фв: ЦАТ АЦГ ЦТГ АЦЦ ЦТА ГЦЦ ТГ, рв: ТТТ ЦТТ ЦАА ТЦЦ ГГТ ГГЦ ГА), -актин (фв: ТАА ГГЦ ЦАА ЦЦГ ТГА ААА ГАТ Г, рв: АГА ГГЦ АТА ЦАГ ГГА ЦАА ЦАЦ А). Резултати су нормализовани на мРНА гена за одржавање -актина као интерне контроле и представљени су као релативни нивои мРНК. Реакције су изведене са 8 μЛ иК СИБР Греен Супермик-а, 1 μЛ 10 пМ пара прајмера, 8,5 μЛ дестиловане воде и 2,5 μЛ цДНК. Свака ланчана реакција полимеразе је изведена под следећим условима: 95 степени у трајању од 3 минута, затим 40 циклуса од 10 с на 95 степени, 30 с на 55 степени и 10 с на 55 степени - 95 степени за продужење, након чега следи једно мерење флуоресценције . Коначни резултати су описани релативним вредностима (2-ΔΔЦт). Прорачун и анализа су обављени помоћу иК5 ПЦР система за детекцију у реалном времену.

Вестерн блот анализа

Нивои експресије протеина колагена И (Абцам, Кембриџ, УК, арт бр.: аб34710) одређивани су Вестерн блотингом [са -актином (Лот: 60008-1-лг; Протеинтецх, Кина) као кућном контролом. Екстракти целих ћелија су припремљени коришћењем радиоимунопреципитационог теста (РИПА) (Тхермо Сциентифиц, САД) пуфера са 1 процентним коктелом инхибитора протеазе (Тхермо Сциентифиц, САД) и 1 проценат коктела инхибитора Халт фосфатазе (Тхермо Сциентифиц, САД). Концентрација протеина је мерена и квантификована Брадфордовом методом [18]. Протеин (10–50 уг) је одвојен на 10% СДС-ПАГЕ гелу и пребачен на ПВДФ мембране (Миллипоре, САД). Мембране су блокиране 1 х на собној температури са 5 процената БСА, а примарна антитела (антитело против колагена И, разблажење 1:200 или мишје мАб од -актина, 1:5000 разблаживање) су инкубирана на 4 степена преко ноћи. Одговарајући Алк-Пхос. коњугована секундарна антитела су инкубирана на собној температури. Коначно, мембране су три пута испране са 1 × Трис-ХЦл физиолошким раствором са 0,1 процентом Твеен 20, а сигнали су скенирани и визуелизовани помоћу ГЕЛ ДОЦ КСР Имагинг Систем (Био-Рад). Денситометријска анализа је извршена на протеинима од интереса и нормализована на -актин помоћу софтвера ГЕЛ ДОЦ Имаге Студио (Био-Рад). -актин је коришћен као интерна контрола.

Статистичка анализа

Схапиро-Вилков тест нормалности и Левенов тест хомогености варијансе примењени су да би се потврдила нормалност и Иоу ет ал. ДАРУ Јоурнал оф Пхармацеутицал Сциенцес (2015) 23:52 Страна 4 од 13хомогености варијансе. Анализа варијансе (АНОВА) праћена Тукеијевим пост хоц тестом коришћена је за идентификацију статистичких разлика нехомогених, нормално распоређених података. Крускал-Волисов непараметарски тест је коришћен за анализу података који нису нормално распоређени или хомогени. Резултати су изражени као средња вредност ± СД. Значај је постављен на П < 0.05.="" сви="" подаци="" су="" анализирани="" софтвером="" спсс="" 16.0="" (медицал="" университи="">

Резултати

Квантитативно одређивање ЦПхГ

ЦПхГ у Ц. тубулоса садрже два гликозида фенилетил алкохола, ехинакозид и актеозид, а њихов садржај у ЦПхГс је утврђен ХПЛЦ анализом (слика 1) на 42,71 ± 0.42 одсто и 14,27 ± {{7 }}.18 процената, респективно.

Индекси јетре и слезине

Као што је приказано у табели 1, индекси јетре и слезине групе модела су значајно повишени [П < 0.01,="" п="">< 0,05].="" индекси="" јетре="" и="" слезине="" позитивног="" лека="" бјрг="" и="" цпхгс="" у="" различитим="" дозним="" групама="" су="" значајно="" смањени="" у="" поређењу="" са="" моделном="" групом="" [пливер="0.004," пливер="0.003," пливер="0." 004,="" пливер="0.005;" псплеен="0.017," псплеен="0.027," псплеен="0.024," псплеен="0.070," респективно].="" индекси="" јетре="" и="" слезине="" били="" су="" нижи="" од="" оних="" у="" групи="">

Ефекти ЦПхГ на активности АЛТ, АСТ и маркере фиброзе јетре

У овој студији, нивои хепатичких ензима АСТ и АЛТ у серуму су значајно повећани у групи модела, одражавајући хепатоцелуларно оштећење код пацова са фиброзом јетре изазване БСА. Међутим, експерименти.

показао да третман са БЈРГ (600 мг/кг) и ЦПхГс (125, 250 и 5{{10}}0 мг/кг) значајно смањен АСТ [ПАСТ < 0.0{{60}}1,="" прошло="">< 0.001,="" прошло="">< 0,001,="" прошло="">< 0,001="" ,="" респективно]="" и="" нивои="" алт="" [палт="0.117," палт="0.139," палт="0.189," палт="0.255," респективно]="" код="" пацова="" са="" фиброзом="" јетре="" .="" (табела="" 2).="" нивои="" ха,="" лн,="" пц="" и="" ив-ц="" код="" пацова="" модела="" су="" значајно="" повећани="" [пха="">< 0,001,="" плн="">< 0,001,="" ппциии="0.002," пив-ц="">< 0,001,="" респективно].="" у="" поређењу="" са="" групом="" модела,="" нивои="" ха="" [пха="0.009," пха="0.007," пха="0.009," пха="0.023," респективно],="" лн="" [плн="0.011," п="" лн="0.004," п="" лн="0.026," п="" лн="0.069," респективно],="" пц="" иии="" [п="" пциии="" {="" {47}}.006,="" п="" пциии="0.067," п="" пциии="0.136," п="" пциии="0.296," респективно]="" и="" ив-ц="" [п="" ив-ц="">< 0,001,="" п="" ив-ц="">< 0,001,="" п="" ив-ц="">< 0,001,="" п="" ив-ц="">< 0,001,="" респективно]="" код="" пацова="" су="" значајно="" смањени="" бјрг="" (600="" мг/кг)="" и="" цпхг="" у="" различитим="" групама="" доза="" (125,="" 250="" и="" 500="" мг/кг)="" (табела="" 3).="" садржај="" хип="" и="" тгф-="" 1="" садржај="" колагена="" је="" такође="" откривен="" мерењем="" нивоа="" хип="" у="" ткиву="" јетре.="" као="" што="" је="" приказано="" у="" табели="" 4,="" средња="" вредност="">ниво у групи модела био је значајно виши од нормалне групе, али је значајно смањен у групи са БЈРГ и различитим групама доза ЦПхГс. Хепатична концентрација ТГФ{{0}} групе модела код пацова је значајно повећана [П < 0.001].="" у="" поређењу="" са="" моделном="" групом,="" нивои="" тгф-="" 1="" позитивног="" лека="" и="" различитих="" група="" доза="" цпхгс="" су="" значајно="" смањени="" [п="" тгф-="" 1="">< 0.001,="" п="" тгф-="" 1="">< 0,001,="" п="" тгф-="" 1="">< 0,001,="" птгф-="" 1="">< 0,001,="" респективно].="" резултати="" су="" сумирани="" у="" табели="">

Хистопатолошки преглед

Посматрања нормалних делова ткива јетре обојених Х&Е и Массоновим трихромом показују различите хепатичне лобуле и јетрене синусоиде. Структура ткива јетре код пацова модела је поремећена, а ткиво јетре и јетрени синусоиди замењени су великом количином везивног ткива. Међутим, нормалнија цитоархитектура и мање везивног ткива откривени су у групи третмана од оних у групи модела.

Х&Е бојење

У нормалној групи, уочен је структурни интегритет хепатичног лобула без абнормалних порталних подручја и јетрених синусоида. Јетрене врпце су биле уредно распоређене, а језгро је округло и јасно. Језгра се налазе у центру ћелије, са обилном цитоплазмом. Само подручје портала има малу количину фиброзног ткива (слика 2а). У групи модела лобуларна структура је била озбиљно оштећена. Ћелије јетре су показале благу воденасту дегенерацију, углавном балончасту дегенерацију и/или масну дегенерацију. Уочено је и формирање инфламаторне ћелијске инфилтрације, екстензивна хиперплазија фиброзног ткива, формирање великог броја фиброзног септума, подељених лобула и значајна пролиферација ћелија јетре. Ова запажања су потврдила успех успостављања животињског модела хепатичне фиброзе са оштећењем имунитета пацова (слика 2б). У поређењу са моделном групом, дошло је до смањења инфилтрације инфламаторних ћелија у различитим ЦПхГ. Такође је примећено мање некрозе и масне дегенерације ћелија јетре, као и ублажавање фиброзе. ЦПхГ су значајно ублажили патологију фиброзе јетре изазване БСА код пацова, ублажили отицање ћелија јетре и ефикасно спречили некрозу хепатоцита и инфилтрацију инфламаторних ћелија, што сугерише да ЦПхГ имају заштитни ефекат на фиброзу јетре индуковану БСА. (Слика 2ц–ф). Массоново трихромно бојење У нормалној групи ткиво јетре је било нормално. Подручје портала јетре показало је мали број плавих колагених влакана, а ткиво јетре је било нормално структурирано (слика 3а). У поређењу са ткивом јетре нормалне групе, фиброзно ткиво је пролиферисало централни лист и проширило се у паренхим јетре. Колагенска влакна проширена и повезана и

обавијала цео лобулу и окружила централну вену. Ови ефекти, заједно са фиброзом хепатоцита, лобуларним структурним оштећењем, перипорталном фиброзом и формирањем псеудолобула (слика 3б) пружили су доказ да је модел успостављен. У поређењу са моделном групом, колагена влакна у позитивној контролној групи била су благо проширена напоље од подручја периферног портала (слика 3ц). У поређењу са моделном групом, колагенска влакна у различитим групама дозе ЦПхГс су значајно смањена, пролиферација влакана је инхибирана, а пролиферација фиброзног ткива унутар паренхима јетре значајно смањена. Ови резултати сугеришу да ЦПхГ штите пацове од фиброзе јетре изазване БСА (Слика 3д-ф).

Имунохистохемијско бојење

Важно је да експресија колагена типа И и колагена типа ИИИ играју суштинску улогу у развоју фиброзе јетре, а њихово стварање и таложење у ткиву јетре може послужити као важна детерминанта ефикасности анти-хепатичне фиброзе. Резултати су сумирани у табели 5

Колаген типа И

Нормална група је изразила колаген типа И углавном у крвним судовима и порталној области. Група модела је имала високо изражену васкуларну фиброзу колагена типа И у области портала. У простору Диссеа, бојење колагена типа И примећено је у пругама или као неједнака дистрибуција. Влакнасте преграде обложене колагеном формирају псеудолобуле. У овим експериментима формирано је мање влакнастих септа за БЈРЈ (600 мг/кг) и различите дозне групе ЦПхГс (125, 250 и 500 мг/кг) [ПЦол И=0.002, ПЦол И {{ 6}}.001, ПЦол И=0.023 и П Цол И=0.044, респективно]. Семиквантитативни резултати су открили да је експресија њиховог колагена типа И била значајно нижа у поређењу са моделном групом (слика 4).

Колаген тип ИИИ

Колаген тип ИИИ је био слабо изражен у нормалној групи, а периферна подручја око порталних и хепатичних вена су показивала малу количину фино жуте боје уместо непрекидних влакана (слика 5а). У групи модела, колагена влакна су показала широке и дебеле врпце, што указује на јаку експресију, углавном лоцирана у областима портала и фиброзног ткива (слика 5б). Колагенска влакна БЈРЈ (600 мг/кг) и различите дозне групе ЦПхГ (125, 250 и 500 мг/кг) била су филаментозна и распоређена око централне вене и порталних подручја. У поређењу са моделном групом, колагенска влакна су значајно смањена, бојење је било бледо и танко, а имунохистохемијско бојење је било слабо позитивно (Слика 5ц–ф). Ови семи-квантитативни резултати показују да позитивно изражене ћелије у позитивним и различитим дозама групама [ПЦол ИИИ=0.015, ПЦол ИИИ=0.001, ПЦол ИИИ=0.010, и П Цол ИИИ=0.037, респективно] су се разликовали од оних у групи модела.

ТГФ- 1

Било је мало експресије ТГИФ{{0}} у нормалним ћелијама јетре пацова. Експресија је била ограничена на мали број интерстицијских ћелија (слика 6а). У групи модела, експресија ТГФ- 1 је била широко распрострањена у подручју портала, фиброзним просторима, звездастим ћелијама јетре, инфламаторним ћелијама, синусоидном зиду и цитоплазми. Одређено подручје портала показало је изразито позитивну експресију са браонкасто-жутим бојењем (слика 6б). Постојала је мала количина експресије у подручју портала и фиброзних септа БЈРЈ (600 мг/кг) и различитих дозних група ЦПхГ (125, 250 и 500 мг/кг). Степен позитивног бојења у овим групама је значајно смањен у поређењу са моделом групе. Бојење у интерстицијалним ћелијама у фиброзним септама и цитоплазми инфламаторних ћелија је смањено (слика 6ц–ф). Семи-квантитативни резултати су открили да БЈРЈ и различите дозне групе ЦПхГ [П ​​ТГФ- 1=0.001, П ТГФ- 1 < 0,001,="" п="" тгф-="" 1="0.009," птгф-="" 1="0" .004,="" респективно]="" били="" су="" значајни="" у="" поређењу="" са="" моделном="" групом.="" као="" што="" је="" раније="" поменуто="" у="" чланку,="" тгф-="" 1="" је="" важан="" цитокин="" у="" патофизиологији="">

фиброзе, стимулишући производњу екстрацелуларног матрикса [19]. Показали смо да се ниво ТГФ- 1 повећао у групи модела на начин који је у складу са озбиљношћу фиброзе јетре. Нивои експресије ТГФ- 1 у јетри били су у складу са нивоима ТГФ- 1 у серуму. Ово указује да ЦПхГ могу значајно смањити фиброзу јетре услед експресије ТГФ- 1 учешћем у синтези и деградацији ЕЦМ. Експресија колагена типа И, колагена типа ИИИ и ТГФ- 1 може открити патолошки процес фиброзе јетре. Њихови нивои експресије у третираним групама су значајно смањени и илустровали су да ЦПхГ могу побољшати активност колагеназе, одржавајући динамичку равнотежу синтезе и деградације јетрених ЕЦМ, одлажући и спречавајући на тај начин формирање фиброзе јетре.