Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Кликните овде за први део

Молимо кликните овде до 3. дела

Цистанцхе може побољшати памћење

Имајући у виду ове налазе, затим смо испитали да ли је експресија миР-466ф-3п хипокампуса повећана код мишева након просторног учења имеморијаформирање је такође утицало на морфологију неурона ин виво. Значајно је да смо открили да је просечна густина кичме неурона хипокампуса код ГЛН мишева већа од оне код ПЛН мишева, што је откривено Голгијевом импрегнацијом пирамидалног

Слика 3. Ефекти промене нивоа миР-466ф-3п експресије хипокампуса на МВМ перформансе миша

(А) Експериментални временски оквир задатка МВМ, анализа експресије или електрофизиолошко мерење мозга миша након ињекције лентивируса.

(Б) Леви панели: експресија дсРед у хипокампусу миша. Репрезентативне ИФ слике хипокампуса са малим и великим увећањем од мишева инфицираних рекомбинантним лентивирусима који изражавају само дсРед као контролу (лева колона слика) или миР-466ф-3п плус дсРед (десно колона слика). Уоквирене области на горње две слике су увећане и приказане испод. Скала шипки, 100 мм. Испрекидане линије означавају границе ДГ. Језгра су обојена ДАПИ. ГЦЛ, слој ћелија гранула; МЛ, молекуларни слој. Десни хистограм, релативни нивои експресије миР-466ф-3п у хипокампусу миша инфицираног лентивирусом који експримира контролу или миР-466ф-3п, као што је анализирано РТ-кПЦР ( н=16 по групи).

(Ц) МВМ перформансе мишева инфицираних различитим рекомбинантним лентивирусима, упакованих уз употребу пет различитих плазмида који експримирају само дсРед, миР-466ф-3п, мут-миР-466ф{ {5}}п, и миР/СЦР-спужве, респективно, у њихов хипокампус (н=13, 26, 16, 19 и 11 по групи, респективно). Лева табла: избегавајте кашњење током тренинга. Десни панел: индивидуално кашњење за бекство на 6. сесији.

Подаци приказани у (Б) су представљени као средња вредност ± СД, а подаци приказани у (Ц) су представљени као средња вредност ± СЕМ. Статистичка значајност је процењена неупареним т тестом (Б), двосмерним АНОВА са Бонферронијевим пост хоц поређењем (Ц, леви панел) или једносмерним АНОВА са Тукеијевим пост хоц тестом (Ц, десни панел). Статистичке разлике: #п < 0.05,="" **/##п="">< 0.01="" и="" ****п="">< 0,0001;="" *мир-466ф-3п="" у="" односу="" на="" друге;="" #мир-сунђер="" против="">

неурона у ГЛН и ПЛН мишјем хипокампусу (слика С3). Ови налази показују да појачана регулација хипокампалног миР-466ф-3п промовише раст неурита и формирање дендритичне кичме, што је слично индукцији густине кичме уоченој у хипокампусу ГЛН мишева у односу на ПЛН мишеве.

миР-466ф-3п позитивно модулира просторно учење миша имеморијаперформансе, као и синаптичка пластичност

Да бисмо истражили да ли миР-466ф-3п позитивно регулише просторно учење миша имеморијаформирање, користили смо приступ рекомбинантној лентивирусној инфекцији да прекомерно експресујемо миРНА у хипокампусу миша. Мишеви су анализирани 7 дана након ињекције лентивируса у ДГ (слика 3А). Репрезентативне слике нивоа експресије кука миР-466ф-3п су заиста биле повишене у миР-466ф-3п групи прекомерне експресије у поређењу са контролном групом (десни хистограм на слици 3Б). Открили смо да су мишеви са хипокампалном прекомерном експресијом миР-466ф- 3п и подвргнути задатку МВМ показали кашњење од 88 ± 5 с у првој сесији и 19 ± 1 с у 6. сесији (црвено тачкаста линија, слика 3Ц), који су били бољи него код мишева са векторском контролом (црна линија) или контролних мишева мутанта (црвена кружна линија) и слични су латенцијама бежања ГЛН мишева описаних на слици 1А. Паралелно, испитали смо ефекат губитка функције миР-466ф-3п на просторно учење имеморијаинхибирањем миР-466ф-3п помоћу миР сунђера. Приметно је да су МВМ перформансе мишева код којих је хипокампални миР-466ф-3п био заробљен миР сунђером био сличан оном код ПЛН мишева, тј. нису научили да пронађу платформу чак ни последња сесија (пуна зелена квадратна линија,

Слика 3Ц). Штавише, чини се да мишеви којима је убризган лентивирус нису пореметили хомеостатску пластичност, пошто су неки мишеви у свакој групи научили или су барем били у процесу учења током последње сесије (слика 3Ц, десни хистограм).

С обзиром на то да је прекомерна експресија миР-466ф-3п у хипокампусу миша побољшала њихово учење имеморијаспособности, анализирали смо компаративну електрофизиологију култивисаних неурона хипокампуса који изражавају различите нивое миР-466ф-3п. Минијатурна ексцитаторна постсинаптичка струја (мЕПСЦ) из ДИВ14 хипокампалних неурона који прекомерно експримирају миР-466ф-3п или мут-миР-466ф-3п, миР-спужву или контролу је снимљено помоћу патцх стезаљки за целу ћелију. Док није било значајних разлика у мЕПСЦ амплитуди, порасту Тау или распадном Тау међу четири сета узорака, мЕПСЦ фреквенција неурона који прекомерно експримирају миР-466ф-3п била је значајно виша у поређењу са друге групе (Слика 4А), што указује да су постсинаптички глутаминергички рецептори били снажније активирани након прекомерне експресије миР-466ф- 3п.

Затим смо измерили дуготрајну потенцирање (ЛТП) да бисмо директно одредили улогу миР-466ф-3п у синаптичкој пластичности ин виво. У хипокампус мишева смо убризгали рекомбинантни лентивирус као што је описано на Слици 3, а затим индуковали ЛПинхипокампус тетаничном стимулацијом (три низа високофреквентне стимулације [3кХФС]) Шаферовог колатералног пута. Открили смо да је наш протокол индуковао ЛТП у свим групама, о чему сведочи упорни пораст ексцитаторних постсинаптичких потенцијала поља (фЕПСП) у региону цорну аммонис 1 (ЦА1) (Слика 4Б, леви панел). ЛТП је био јачи у резовима са прекомерном експресијом миР-466ф-3п (188 процената ± 2 процента од почетне вредности на 40–50 мин након стимулације, средња вредност ± СЕМ) у поређењу са мутантом (169 процената ± 1 проценат почетне вредности), СЦР-спужва (173 процента ± 3 процента од почетне вредности) и кришке инфициране контролном вирусом (159 процената ± 2 процента почетне вредности), као миР-466ф-3п инхибиција од миР-сунђер је смањио ЛТП (128 процената ± 1 проценат основне вредности) у односу на контроле (слика 4Б, десна табла). Такође смо измерили ЛТП група ГЛН и ПЛН након тренинга. Одговарајући подаци су такође открили значајне разлике у нагибу фЕПСП у ЦА1 региону између ГЛН и ПЛН група (Слика 4Ц). Дакле, повишени ниво миР-466ф-3п побољшава ЛТП и синаптичку пластичност што, заузврат, може промовисати учење имеморијаспособност мишева. Заједно, подаци представљени на сликама 2, 3 и 4 показују да миР-466ф-3п игра кључну позитивну улогу у просторном учењу имеморијаформирање, вероватно повећањем формирања кичме, ЛТП-а и јачине синаптичке пластичности.

Меф2а мРНА је регулаторна мета миР-466ф-3п

Спровели смо биоинформатичку анализу да бисмо идентификовали потенцијалне циљне мРНК регулисане везивањем миР-466ф-3п за њихових 30 УТР. Међу кандидатима које смо идентификовали била је Меф2а мРНА која кодира МЕФ2А. Занимљиво је да је раније утврђено да је експресија МЕФ2А смањена након МВМ тренинга, а прекомерна експресија овог фактора је имала негативан ефекат на перформансе мишева (Цоле ет ал., 2012). Због тога смо користили тест репортера луциферазе да испитамо да ли миР-466ф-3п регулише транслацију мРНК Меф2а везивањем за њен 30 УТР. Убацили смо дивље или мутантне Меф2а 30 УТР секвенце низводно од цДНК луциферазе вођене СВ40-промотором (Луц), што је резултирало репортерским плазмидом псиЦХЕЦК2-МЕФ2А 30 УТР или псиЦХЕЦК2- мут-МЕФ2А 30 УТР (Слика 5А). Као што је приказано на левом хистограму на слици 5Б, коекспресија миР-466ф-3п је ослабила експресију луциферазе коју је усмеравао Меф2а 30 УТР. Чинило се да овај ефекат зависи од интеракције између миР-466ф-3п и Меф2а 30 УТР пошто је мутација било предвиђеног места везивања миР-466ф-3п на Меф2а 30 УТР (50-УГУ-ГУАУ-30) или семенски регион миР-466ф-3п (50-АУАЦАЦА-30) Препознавање Меф2а 30 УТР поништило је инхибиторни ефекат миР-466ф-3п на активност луциферазе (Слика 5Б, средњи хистограм). Штавише, коекспресија миР сунђера, али не и ЦР сунђера, такође је елиминисала репресивни ефекат миР-466ф-3п на активност луциферазе (Слика 5Б, десни хистограм). Приметно, ни прекомерна експресија миР-466ф-3п ни миР-спужва нису имали никакав утицај на нивое Меф2а мРНА у примарним хипокампалним неуронима (слика 5Ц), али су смањили или повећали, респективно, ниво МЕФ2А протеина (слика 5Д). Такође смо открили да је прекомерна експресија миР-466ф-3п или миР-спужва, респективно, смањила или повећала ниво мРНА цитоскелетног повезаног протеина (Арц) регулисаног активношћу у примарним неуронима хипокампуса (Слика 5Ц) , који је био познати низводни циљ који је позитивно регулисао МЕФ2А (Флавелл ет ал., 2006)

Такође смо извршили флуоресцентну ин ситу хибридизацију (ФИСХ) да бисмо открили миР-466ф-3п и комбиновали је са ИФ обележавањем МЕФ2А у ДИВ14 примарним неуронима хипокампуса без или са третманом форсколином. Познато је да форсколин индукује хемијски ЛТП и активира аденилил циклазу, чиме подиже нивое интрацелуларног цАМП. Приметили смо нуклеарну колокализацију МЕФ2А са миР-466ф- 3п, као што је илустровано репрезентативним сликама на слици 5Е. Након стимулације форсколином, међутим, миР-466ф-3п сигнал се повећао и у соми и у дендритима, док је МЕФ2А сигнал у

језгро се смањило, као што је приказано реципрочним променама интензитета МЕФ2А и Фаст Ред сигнала, респективно, појединачних неуронских ћелија (Слика 5Е). Укратко, подаци на сликама 5А–5Е указују на то да миР-466ф-3п негативно регулише експресију МЕФ2А протеина везивањем за 30 УТР Меф2а иРНК и сходно томе потискујући његову транслацију.

У складу са горе описаним резултатима, открили смо да су нивои протеина МЕФ2А хипокампуса смањени код ГЛН мишева након МВМ тренинга, али не и код ПЛН мишева (Слика 5Ф). Штавише, релативни нивои МЕФ2А код појединачних ГЛН мишева (тачке) и ПЛН мишева (квадрати) били су у обрнутој корелацији са нивоима миР-466ф-3п (Р=0.60, Слика 5Г). Дакле, хетерогени обрасци просторног учења имеморијаспособност су модулисана стохастичким повећањем хипокампалног миР- 466ф-3п код појединачних мишева и последичним смањењем МЕФ2А након стимулације неуронске активности.

Стохастичка активација хипокампалног ЦРЕБ-а и последична транскрипциона регулација миР- 466-669 кластера током МВМ тренинга

Истраживали смо механизме помоћу којих би Р-466ф-3п у хипокампусу миша могао бити стохастички регулисан задатком МВМ. Постоје три прекурсора миРНА који кодирају миР-466ф-3п, а сви припадају миР-466-669 кластеру специфичном за глодаре који се налази у интрону 10 његовог гена домаћина, мСфмбт2 (Иноуе ет ал. ., 2017) (Слика 6А). Занимљиво је да за разлику од миР-466ф-3п, није било значајне разлике у нивоима експресије мСфмбт2 између ГЛН и ПЛН група (Слика 6Б), што сугерише да би миР-466-669 кластер могао да кодира посебан транскрипт уместо да буде део примарног транскрипта мСфмбт2. Сходно томе, дизајнирали смо неколико сетова прајмера да идентификујемо претпостављени примарни транскрипт миР-466-669 кластера помоћу РТ-кПЦР. Као што је приказано на слици 6А, дугачак ПЦР фрагмент (плус 282 до 2,381), заједно са низом преклапајућих кПЦР трака, наиме А (плус 282 до 115), Б (131 до 406), Ц (388 до 686), Д (662 до 1,028), Е (1,004 до 1,299), Ф (1,242 до 1,629), Г (1,605 до 2,029) и Х( 2,005 до 2,381), могу се открити у хипокампусу миша, али не и од 2, 3706 до И део ) (подаци нису приказани). Ови подаци потврђују да је миР-466-669 кластер кодирао дугачак транскрипт близу приближно 2388 бп узводно од првог прекурсора миРНА (тј. пре-мир-466м, означеног плус 1 на слици 6А). Изванредно, слично ономе што смо пронашли за миР-466ф-3п, просечан ниво овог транскрипта у хипокампусу ГЛН мишева био је виши него код ПЛН мишева (слика 6Ц). Дакле, побољшано учење имеморијаспособност ГЛН мишева је последица транскрипционе активације миР-466-669 кластера.

Активација нуклеарног ЦРЕБ-а фосфорилацијом током МВМ задатака или у другим облицима учења је критичан корак за претварање краткорочних у дугорочнемеморија(Лисман ет ал., 2018; Рогерсон ет ал., 2014). Стога смо истражили да ли различити нивои миР-466ф-3п међу појединачним мишевима који су били подвргнути МВМ задатку могу бити у корелацији са статусом активације ЦРЕБ-а. Да бисмо истражили ову идеју, прво смо испитали нивое фосфорилације ЦРЕБ хипокампуса код појединачних мишева. Као што је приказано на слици 6Д, активација ЦРЕБ (фосфорилацијом на остатку С-133) је побољшана код ГЛН мишева у односу на ПЛН и ХЦ мишеве. Такође смо потврдили да је миР-466ф-3п заиста ко-експримиран са пЦРЕБ у неуронима извођењем миРНА ИСХ у комбинацији са ИФ бојењем пЦРЕБ и МАП2 у примарним неуронима хипокампуса (слика С2А). Штавише, примарни нивои транскрипта миР- 466-669 кластера су били у позитивној корелацији са пЦРЕБ код ГЛН мишева (Р=0.52), док је био у негативној корелацији са пЦРЕБ код ПЛН мишева (Р=0 .71) (Слика 6Е). Проверили смо корелацију између нивоа другог активног фактора, фосфо-екстрацелуларне сигнално регулисане киназе (пЕРК), и примарних нивоа транскрипта миР-466-669 кластера. Открили смо да су оба типа мишева обучених за МВМ показала позитивне корелације између сигнала миР-466-669 кластера и пЕРК (Р=0.59 и 0.48, респективно; слика С4А), и није било разлике у пЕРК/ експресија тЕРК између те две групе (слика С4Б). Да бисмо даље разјаснили утицај активације ЦРЕБ-а на регулацију транскрипције у њиховом-466-669кластера и, сходно томе,

индукција миР-466ф-3п,користимо специфични ЦРЕБинхибитор,666- 15 (Ксие ет ал., 2015), у комбинацији са форсколином третманом ДИВ14 примарних неурона хипокампуса. Познато је да форсколин активира ЦРЕБ фосфорилацију (Малхотра ет ал., 2015). Открили смо да је предтретман примарних хипокампалних неурона са 666-15 блокирао активацију ЦРЕБ изазвану форсколином (слика 6Ф) и смањио нивое миР-466ф-3п и миР-466-669 кластера транскрипт (слике 6Г и 6Х). Истовремено, нивои мРНА познатих пЦРЕБ циљних гена нурр1 и хомер1а (Бриди ет ал., 2017; Јенсен ет ал., 2017) такође су смањени након третмана 666-15 (слика 6Х). Узето заједно, слика 6 показује да стохастичка активација ЦРЕБ у хипокампусу субпопулације инбред мишева који пролазе кроз МВМ задатак индукује транскрипцију миР-466-669 кластера и, последично, индукцију миР-466ф{{23 }}п, чиме се побољшава њихово просторно учење имеморијаспособност да боље обављају задатак.

ДИСКУСИЈА

Истражили смо могућу улогу миРНА у модулацији различитих способности просторног учења имеморијамеђу инбред мишевима Ц57БЛ/6Ј. Предлажемо да стохастичка активација ЦРЕБ-а и последична регулација хипокампалног миР-466ф-3п представља веће просторно учење имеморијаспособност подгрупе наших тест мишева, вероватно због миР-466ф-3п који посредује у транслационој инхибицији Меф2а мРНА која кодирамеморијанегативни регулатор МЕФ2А. Наши налази пружају сценарио који демонстрира функционалну и еволуциону улогу специфичне миРНА у регулисању когниције кроз стохастичку индукцију ЦРЕБ-пЦРЕБ-миР-466ф-3п-МЕФ2А осе стимулансима из околине.

Задатак МВМ се широко користио за испитивање различитих способности просторног учења имеморијаза глодаре. У нормалним условима, глодари користе дисталне знакове да би се оријентисали, омогућавајући им да науче и запамте локацију скривене платформе у задатку. Већина наших тестних инбред Ц57БЛ/6Ј мишева (62 процента) је показала нормалан образац кашњења у бекству, проналазећи платформу у року од 30 с до 3.-6 сесије (Слика 1А, ГЛН). Насупрот томе, група мишева (38 процената) није научила задатак чак ни до 6. сесије (ПЛН). Значајно је да смо мишеве подвргли још два теста препознавања. Први је био тест препознавања нових објеката (НОР), који је једно испитивање засновано на урођеном истраживању без појачања или стреса за мотивисање понашања (Легер ет ал., 2013). Корелација између НОР и МВМ задатака у смислу перформанси миша је лоша (Р {{1{{20}}}}.13), што је слично корелацији између НОР перформанси и нивоа експресије хипокампуса од миР-466ф-3п (Р=0.01; подаци нису приказани). НОР тест такође није открио разлике у индексу дискриминације између МВМ ГЛН и ПЛН група (0,36 ± 0,25 наспрам 0,29 ± 0,18; Слика С1Б). Други просторно учење имеморија-зависни задатак који смо применили је Барнсов лавиринт (БМ), који је сличан МВМ. Заснован је на претпоставци да глодари смештени у аверзивно окружење треба да науче и запамте локацију кутије за евакуацију која се налази испод површине платформе. Као што је приказано на слици С1Ц, открили смо да су перформансе миша у испитивањима БМ сонде такође у позитивној корелацији са нивоима експресије хипокампуса миР-466ф-3п. Дакле, индукција ЦРЕБ-пЦРЕБ-миР-466ф-3п-МЕФ2А осе у хипокампусу током учења имеморијаформирање је просторно зависно од контекста.