Део 2: Фенилетаноидни гликозиди Цистанцхе Тубулоса индукују апоптозу ћелија хепатоцелуларног карцинома и појачавају антитуморски ефекат
Mar 25, 2022
Контакт:ali.ma@wecistanche.com
Пенгфеи Иуан, БСц1, Цхангсхуанг Фу, МСц1, Ии Ианг, ПхД1, Аипире Адила, ПхД1, Фангфанг Зхоу, МСц1, Ксианкиан Веи, МСц1, Веилан Ванг, ПхД1, Јие Лв, ПхД1, Иијие Ли, ПхД1, Ксиа Лији, ПхД1, и Јиниао Ли, ПхД1
КЛИКНИТЕ ОВДЕ ЗАДЕО 1
Резултати
ЦТПГ инхибира пролиферацију ХЦЦ ћелија ин витро
Компоненте ЦТПГ-а су квалификоване и квантификоване помоћу ХПЛЦ користећи стандарде ехинакозида и актеозида (допунска слика 1А), који су били главне компоненте фенилетаноидних гликозида изЦистанцхе.18Према временима вршног задржавања и површинама пикова, ЦТПГ је садржао 28 процената ехинакозида и 9,9 процената актеозида. Осим тога, садржај полисахарида у ЦТПГ је био 34,8 процената методом фенол-сумпорне киселине.19 МТТ тест је показао да ЦТПГ значајно смањује виталност БЕЛ-7404 и ХепГ2 ћелија на начин који зависи од дозе и времена ( Слика 1А). Конзистентно, пролиферација БЕЛ-7404 ћелија је значајно инхибирана ЦТПГ третманом, који је анализиран Ки-67 бојењем (слика 1Б). Ефекат ЦТПГ-а на пролиферацију спленоцита ин витро је такође анализиран МТТ тестом. Приметили смо да ЦТПГ појачава пролиферацију спленоцита на начин који зависи од дозе (Слика 1Ц).
Сигнални пут протеин киназе активиране митогеном (МАПК) игра кључну улогу у преживљавању, диференцијацији и отпорности на лекове ћелија рака код људи.20 Да би се истражило да ли је МАПК сигнални пут укључен у инхибиторни ефекат ЦТПГ на пролиферацију ХЦЦ ћелија, нивои фосфорилације различитих протеина из МАПК сигналног пута су анализирани у ХепГ2 ћелијама након третмана са ЦТПГ у различитим концентрацијама и различитим временским тачкама. Фосфорилација ЈНК (П-ЈНК) и п38 (П-п38) је дозно-зависно појачана ЦТПГ третманом. Фосфорилација ЕРК-а (П-ЕРК) је смањена са 200 и 400 уг/мЛ ЦТПГ третманом, док је П-ЕРК повећана под 600 уг/мЛ ЦТПГ третманом (Слика 1Д). Штавише, нивои П-ЈНК, П-п38 и П-ЕРК су регулисани на начин који зависи од времена (Слика 1Д). Ови резултати сугеришу да ЦТПГ може инхибирати пролиферацију ХЦЦ ћелија кроз МАПК сигнални пут.
Слика 1. Ефекат ЦТПГ-а на пролиферацију ХЦЦ ћелија и спленоцита.
ЦТПГ индуковано заустављање ћелијског циклуса ХЦЦ у С фази
Даље смо анализирали да ли ЦТПГ инхибира пролиферацију ХЦЦ ћелија кроз индукцију заустављања ћелијског циклуса. После третмана са ЦТПГ, акумулација БЕЛ-7404 ћелија у С-фази је примећена на начин који зависи од дозе. Слично, ЦТПГ је такође изазвао заустављање ћелијског циклуса ХепГ2 у С-фази, а фреквенције су се повећале са 40,66 процената у контролној групи на 61,90 процената у групи третираној ЦТПГ од 600 уг/мл (слика 2А). Циклини и циклин зависне киназе (ЦДК) играју важну улогу у контроли и развоју ћелијске деобе,21 од којих су повезане са Г2/М фазом.22 Ниво експресије Цицлин Д1 је дозно-зависно смањен ЦТПГ третманом, али је унапредио Г1 у С фаза прогресије. Нивои експресије циклина Б1, ЦДК1 и ЦДК2 су такође смањени; ови протеини су били повезани са Г2/М фазом (слика 2Б). Ови резултати сугеришу да ЦТПГ потискује пролиферацију ХЦЦ ћелија изазивањем заустављања ћелијског циклуса.
Пут апоптозе зависан од митохондрија активира ЦТПГ у ћелијама ХЦЦ
Такође смо открили да ли је ЦТПГ покренуо апоптозу у ХЦЦ ћелијама и открили да ЦТПГ индукује апоптозу у ХепГ2 и БЕЛ-7404 ћелијама на начин који зависи од дозе (слика 3А). Поред тога, нивои експресије Бак и Бцл-2 су повећани, односно смањени ЦТПГ третманом на начин зависан од дозе, респективно (Слика 3Б). Апоптоза ХепГ2 ћелија је даље одређена Хоецхст 33342 бојењем након третмана са ЦТПГ током 24 сата. Нуклеарна морфологија је посматрана инвертованим флуоресцентним микроскопом. Као што је приказано на слици 3Ц, контролне ХепГ2 ћелије су биле хомогено обојене док су ХепГ2 ћелије третиране ЦТПГ-ом показале кондензацију и фрагментацију хроматина на начин зависан од дозе, што је било слично ХепГ2 ћелијама третираним цисплатином. Ови резултати су показали да ЦТПГ индукује апоптозу ћелија ХЦЦ.
Интегритет спољне митохондријалне мембране је строго регулисан од стране Бцл-2 породице и смањење Δψм промовише ослобађање цитохрома ц који активира каскаду каспазе да изазове апоптозу.23,24 Када се Δψм смањује, ЈЦ{{3 }} полимер (црвена флуоресценција) се разлаже на мономере (зелена флуоресценција).25 Према томе, Δψмоф ХЦЦ ћелије су детектоване ЈЦ-1 бојењем након ЦТПГ третмана током 24 сата. Као што је приказано на слици 4А, интензитет зелене флуоресценције ФЛ-1 канала је дозно-зависно повећан третманом ЦТПГ-ом, док је интензитет црвене флуоресценције ФЛ-2 канала био дозно-зависно смањен у оба БЕЛ{ {12}} и ХепГ2 ћелије. Посматрање инвертованог флуоресцентног микроскопа показало је сличан резултат (слика 4Б), што указује да ЦТПГ смањује Δψм ћелија ХЦЦ. Након тога, приметили смо да су нивои цитокрома ц повећани у ћелијама БЕЛ-7404 и ХепГ2 након третмана ЦТПГ (слика 4Ц), што је даље потврдило смањење Δψм у ХЦЦ ћелијама третираним ЦТПГ.
Ослобађање цитохрома ц може да активира иницијаторску каспазу-9 да изазове апоптозу.26 Резултати Вестерн блот теста сугеришу да нивои цепане каспазе-3, -7 и{{4} } су повећани док ниво цепане каспазе-8 није промењен (Слика 5). Активирана каспаза-3 може да цепи ензим за поправку ДНК поли (АДП-рибоза) полимеразе (ПАРП) да спречи поправку ДНК и акумулира оштећење ДНК.27 Такође смо приметили повећане нивое расцепљене ПАРП. Улога каскаде каспазе у апоптози ћелија ХЦЦ изазваној ЦТПГ је даље одређена коришћењем инхибитора каспазе (З-ВАД-ФМК) и инхибитора каспазе-3 (Ац-ДЕВД-ЦХО), респективно. З-ВАД-ФМК је значајно преокренуо апоптозу БЕЛ-7404 и ХепГ2 ћелија изазвану ЦТПГ (додатна слика 1Б). Слично томе, Ац-ДЕВД-ЦХО је такође значајно преокренуо апоптозу ХепГ2 ћелија изазвану ЦТПГ (додатна слика 1Ц). Резултати су показали да ЦТПГ индукује апоптозу ХЦЦ ћелија путем митохондријски зависног пута.
ЦТПГ потиснута миграција ХЦЦ ћелија ин витро
Миграција ћелија рака се сматра једним од критичних процеса у метастазама тумора. Да би се утврдило да ли ЦТПГ утиче на миграцију ХЦЦ ћелија, покретљивост ћелија ХепГ2 је процењена тестом зарастања рана. Као што је приказано на сликама 6А и Б, миграција ХепГ2 ћелија је значајно инхибирана ЦТПГ третманом на начин који зависи од дозе. Породица ММП и ВЕГФ играју кључну улогу у миграцији туморских ћелија.28 Након ЦТПГ третмана током 24 сата, нивои ММП-2 и ВЕГФ су значајно смањени (слика 6Ц), што сугерише да ЦТПГ може потиснути инвазију и метастазе оф ХЦЦ.
ЦТПГ побољшао имунитет мишева
Пријављено је даЦистанцхедесертицолаполисахаридииматиимуномодулаторнофункцијеукључујући промовисање пролиферације лимфоцита и активирање макрофага. 29Т ћелије и Б ћелије су главни лимфоцити, који посредују ћелијски и хуморални имуни одговор, респективно. ЦТПГ је садржао 34,8 процената садржаја полисахарида. Стога смо испитали ефекте ЦТПГ-а на пролиферацију Т ћелија и Б ћелија. Као што је приказано на Додатној слици 2А, ЦТПГ је значајно повећао пролиферацију Т ћелија и Б ћелија на начин који зависи од дозе, чак и у присуству цисплатина. Занимљиво је да је ЦТПГ значајно инхибирао апоптозу спленоцита изазвану цисплатином (додатна слика 2Б), што указује да би ЦТПГ могао да побољша нежељене ефекте цисплатина на имуни систем мишева.
Даље смо проценили имуностимулативни ефекат ЦТПГ-а на мишеве. После ип ињекције, сц ињекције и иг примене ЦТПГ (200 и 400 мг/кг), није било значајне промене у стању мишева у поређењу са нетретираном групом. Телесна тежина мишева такође није имала значајну разлику између група које су третиране ЦТПГ и група које нису третиране (Слика 7А). Индекси срца, јетре, слезине, плућа, бубрега и тимуса код мишева били су слични међу свим групама осим индекса слезине код мишева у групи која је примала 400 мг/кг ЦТПГ ип ињекције (Табела 1). Резултати су показали да одабране дозе ЦТПГ-а нису имале нежељене ефекте код мишева.
Слезина је важан имунолошки одбрамбени орган код сисара, а њен развој директно утиче на имунолошку функцију појединца и способност да се одупре болестима. Индекс имунолошких органа одражава развој и имунолошку функцију имунолошких органа. Слезина садржи различите имуне ћелије, укључујући Т ћелије, Б ћелије, природне ћелије убице (НК ћелије), макрофаге, дендритске ћелије (ДЦ) и друге, које играју важну улогу у имунолошком систему.3{{2} } Пријављено је да полисахариди могу повећати број имуних ћелија како би побољшали имунитет организма.31 Како је ип ињекција ЦТПГ-а значајно повећала индекс слезине (повећан 0.55 пута), даље смо анализирали број различитих имуне ћелије у слезини. Резултати су показали да је ип ињекција ЦТПГ значајно повећала број Т ћелија (ЦД3 плус ЦД19− ћелије) (повећан {{1{0}}.49 пута), Б ћелија (ЦД3−ЦД19 плус ћелије) (повећан 0,49 пута), и НК ћелије (ЦД3-ЦД19-ЦД49б плус ћелије) (повећане 1,63 пута) у поређењу са нетретираном групом. ЦД4 плус и ЦД8 плус Т ћелије, као главни подтипови Т ћелија, играју важну улогу у антиген-специфичном ћелијском имуном одговору.32 Стога смо даље анализирали број и статус активације ЦД4 плус и ЦД8 плус Т ћелија у слезина. Резултати су показали да ип ињекција ЦТПГ-а не само да је значајно повећала број ЦД4 плус и ЦД8 плус Т ћелија (повећан 0.55 и 0,34 пута, респективно), већ је такође побољшао стање активације ЦД4 плус Т ћелија (ЦД4 плус ЦД44 плус ћелије) (повећан 0,84 пута) (Слика 7Б), ови резултати сугеришу да ЦТПГ има функцију побољшања имунитета.
Слика 2. Ефекти ЦТПГ-а на ћелијски циклус у ХЦЦ ћелијама.
Комбинација ЦТПГ-а и цисплатина показала је снажан антитуморски ефекат на моделу миша Х22 тумора
Опште је прихваћено да хемотерапија или радиотерапија могу довести до лоше прогнозе и изазвати бројне нежељене догађаје, који могу бити последица супресије имуног система и оштећења нормалних ткива и органа. Полисахариди из ТЦМ-а имају ефекте побољшања имунитета и ублажавају оштећења имуних органа и имуних ћелија изазвана хемотерапијом, на пример, хитозан33 и полисахариди Лициум барбарум.34 Горњи резултат је показао да ЦТПГ може да ублажи нежељене ефекте цисплатина на имуни систем. Због тога је антитуморски ефекат ЦТПГ у комбинацији са цисплатином процењен на Х22 моделу миша тумора. Као што је приказано на слици 8А, сам ЦТПГ, сам цисплатин и комбинација ЦТПГ и цисплатина (ЦТПГ плус цисплатин) значајно су потиснули раст тумора Х22 у поређењу са контролном групом. ЦТПГ плус цисплатин показао је јачи инхибиторни ефекат од самог ЦТПГ-а и цисплатина. Двадесетог дана, запремине тумора у контролној групи, само цисплатин, само ЦТПГ и ЦТПГ плус цис платина група су биле око 1707,8, 722,5, 1033,8 и 367,5 мм3, респективно. Истог дана, тумори су сакупљени за визуелно посматрање (Слика 8Б) и поређење тежине (Слика 8Ц). ЦТПГ плус цисплатин је показао боље терапеутске ефекте на моделу миша тумора Х22 него ЦТПГ или сам цисплатин. Тежина тумора у групи која је примала ЦТПГ плус цисплатин била је нижа од оне у другим групама. Ови резултати сугеришу да антитуморска активност ЦТПГ-а и цисплатина резултира синергистичким ефектима.
Телесна тежина мишева је измерена да би одражавала здравствено стање мишева. Телесна тежина се значајно смањила након третмана цисплатином, што указује на озбиљну системску токсичност изазвану цисплатином.35 У поређењу, ЦТПГ у комбинацији са цисплатином значајно је побољшао губитак телесне тежине изазван цисплатином, док сам ЦТПГ није имао значајан утицај на телесну тежину мишева (Слика 8Д). Органи укључујући слезину, срце, јетру, плућа, бубреге и тимус такође су изоловани да би се израчунали индекси органа. У поређењу са нетретираном групом, индекси слезине су значајно смањени и повећани код цисплатина и ЦТПГ-а, респективно. ЦТПГ плус цисплатин је повратио индексе слезине у поређењу са самим цисплатином. Индекси осталих органа нису показали значајну разлику међу свим групама (Табела 2).
ЦТПГ у комбинацији са цисплатином побољшао је имунитет туморских мишева
Горе наведени резултати су показали да ЦТПГ појачава имунитет мишева и инхибира апоптозу спленоцита изазвану цисплатином. Даље смо истражили да ли је антитуморски ефекат ЦТПГ плус цисплатина у корелацији са побољшаним имунитетом. У процесу настанка и развоја тумора, имунолошки систем тела игра важну функцију имунолошког надзора, а ћелијски имунитет посредован Т ћелијама игра кључну улогу. ЦД4 плус Т ћелије имају функцију помоћи ћелијском имунитету и хуморалном имунолошком одговору, а ЦД8 плус Т ћелије су главне ефекторске ћелије имуног одговора, које могу специфично да убијају циљне ћелије и играју важну улогу у имунитету тумора и антивирусном имунитету.32 Сакупљене су слезине мишева са туморима да би се открио број Т ћелија и Б ћелија помоћу проточне цитометрије. Учесталости и број Т ћелија укључујући ЦД4 плус и ЦД8 плус Т ћелије у групи ЦТПГ плус цисплатин били су значајно већи од оних у контролној (повећани 0,55 и 0,7 пута, респективно) и групе цисплатина (повећане 0,92 и 1,16 пута, респективно) (Слика 9А и Б). У поређењу са контролном групом, сам ЦТПГ је такође делимично повећао број ЦД4 плус и ЦД8 плус Т ћелија иако није било значајне разлике. Учесталост и број Б ћелија нису имали значајну разлику међу свим групама.
Супресорске ћелије изведене из мијелоида (МДСЦ) и регулаторне Т ћелије (Трегс) се шире у туморима и инхибирају антитуморске имуне одговоре; они потискују активацију и експанзију ЦД4 плус Т ћелија, функцију ефекторских Т ћелија, активацију и/или пролиферацију и формирање цитокина ЦД4 плус и ЦД8 плус Т ћелија, пролиферацију Б ћелија и производњу имуноглобулина и промену класе, цитотоксичне функције НК и Т ћелија природних убица (НКТ), и функција и сазревање ДЦ-а.36-38 Учесталости и број МДСЦ (ЦД11б плус Гр-1 плус ), макрофага (ЦД11б плус Гр{ {9}}−), и Трегс (природни Трегс: ЦД4 плус ЦД25 плус Фокп3 плус; индуковани Трегс: ЦД4 плус ЦД25-Фокп3 плус) у слезини туморских мишева анализирани су проточном цитометријом. У поређењу са контролном групом, учесталост и број МДСЦ-а су се значајно смањили након ињекције самог цисплатина (смањен 1,56 пута) или у комбинацији са ЦТПГ-ом (смањен 0,62 пута). Број ЦД11б плус Гр-1− макрофага се такође значајно смањио иако није било значајне промене у њиховим фреквенцијама (Слика 9Ц). Поред тога, само ЦТПГ и третман ЦТПГ плус цисплатин значајно су смањили учесталост индукованих Трег-ова (смањени 0.33 и 0,37 пута, респективно) (Слика 9Д). Ови резултати сугеришу да би антитуморски ефекат ЦТПГ плус цисплатина могао бити у корелацији са побољшаним имунитетом који се карактерише повећаним бројем Т ћелија и смањеним бројем МДСЦ и Трег-ова.
Цистанцхе јача имунитет.
Дискусија
Пријављено је да ТЦМ може индуковати апоптозу различитих туморских ћелија кроз различите путеве, укључујући рецепторе екстринзичне смрти, интринзичне путеве стреса митохондријалног и ендоплазматског ретикулума (ЕР).39 Наша претходна студија је показала да је субфракција Н-бутанола Брассица рапа Л. апоптоза А549 ћелија аденокарцинома плућа16 и етанолни екстракти култивисаних и дивљих Плеуротус ферулае изазвали су апоптозу ћелија Х22 путем ЕР пута који зависи од стреса и митохондрија.17 Такође смо известили да ЦТПГ инхибира раст ћелија меланома Б{0} и карцинома једњака Еца-109 ћелије путем индукције апоптозе путем пута који зависи од митохондрија.13Ехинакозид је важно једињење са многим биолошким активностима у ПхГс. Пријављено је да је ехинакозид испољавао своје антипролиферативне и проапоптотичке функције на ћелијској линији ХепГ2 ХЦЦ путем смањења експресије ТРЕМ2 и ПИ3К/АКТ сигнализације.40 У овој студији смо открили да ЦТПГ инхибира раст хуманог ХЦЦ ХепГ2 и БЕЛ{18 }} ћелије кроз активацију МАПК сигналног пута и индукцију апоптозе путем пута који зависи од митохондрија. Бак и Бцл-2 играју кључну улогу у путу апоптозе зависне од митохондрија.24 Овде смо открили да ЦТПГ повећава експресију Бак и смањује експресију Бцл-2 у ХепГ2 и БЕЛ{{25 }} ћелије, што је резултирало смањењем Δψ и ослобађањем цитокрома ц да би се активирала каскада каспазе. Високо регулисани нивои расцепљене каспазе-9 и одцепљене каспазе-3 примећени су после ЦТПГ третмана, док нивои цепане каспазе-8 нису промењени ЦТПГ третманом, што сугерише да апоптоза ХепГ2 и БЕЛ-7404 ћелије индуковане ЦТПГ-ом нису биле посредоване спољашњим сигналним путем. Међутим, наша претходна студија је показала да ЦТПГ индукује апоптозу Х22 ћелија кроз унутрашње и екстринзичне путеве.15 Ови резултати сугеришу да ЦТПГ може инхибирати раст туморских ћелија кроз више мета и путева.
ТЦМ се широко користи за лечење рака путем вишеструких сигналних путева са или без мањих нежељених ефеката.41 МАПК сигнални пут је уско повезан са појавом, инвазијом и метастазама туморских ћелија, што углавном укључује пут п38, ЈНК/САПК пут и ЕРК1/2 пут.20 Активација п38 и ЈНК може изазвати апоптозу, али активација ЕРК1/2 може бити анти-апоптотичка или про-апоптотичка у зависности од својстава ћелије.42 Пријављено је да је ЦХМ индуковао апоптозу туморске ћелије активирањем п38, ЈНК или ЕРК МАПК путева.43,44 Открили смо да ЦТПГ повећава нивое фосфорилације п38, ЈНК и ЕРК, што сугерише да би МАПК сигнални пут могао бити укључен у апоптозу ХЦЦ ћелија изазван ЦТПГ.
Хемотерапија и радиотерапија могу изазвати различите нежељене догађаје, укључујући супресију имуног система. Да би се побољшала клиничка ефикасност хемотерапије, природни полисахариди су одобрени за употребу као помоћна средства за лечење рака. Пријављено је да је комбинација лентинана и хемотерапеутског агенса тегафур побољшала клиничку ефикасност пацијената са карциномом једњака јачањем имунолошке функције пацијента.45 У нашим претходним студијама, ин виво инхибиторни ефекат ЦТПГ-а на раст тумора је повезан са не само његов директан антитуморски ефекат већ и његову функцију побољшања имунитета.13,15 Функција побољшања имунитета ЦТПГ-а може бити у корелацији са садржајем полисахарида у њему. Овде је истражен ин виво антитуморски ефекат ЦТПГ плус цисплатина. У моделу миша тумора Х22, ЦТПГ плус цисплатин не само да је показао најбољи антитуморски ефекат већ је и смањио нежељене ефекте цисплатина. ЦТПГ плус цисплатин побољшао је имунитет мишева који носе тумор повећањем броја ЦД4 плус и ЦД8 плус Т ћелија и смањењем броја МДСЦ-а и Трег-ова, који су учествовали у инхибиторном микроокружењу изазваном тумором, промовисали раст тумора и инхибирали имуни одговор .46 Повећани број Т ћелија може се кориговати њиховом пролиферацијом коју промовише ЦТПГ и њиховом смањеном апоптозом заштићеном ЦТПГ-ом. Међутим, механизми ЦТПГ-а за смањење броја МДСЦ-а и Трег-ова требају даље истраживање.
У закључку, ЦТПГ је индуковао апоптозу у ћелијама ХЦЦ преко сигналних путева зависних од митохондрија и МАПК ин витро и инхибирао раст ХЦЦ кроз директне антитуморске ефекте и индиректно јачање имунитета у комбинацији са цисплатином. ЦТПГ може послужити као потенцијални кандидат за лечење ХЦЦ.
цистанцхе таблете
За више информација кликните на слику.
