ДЕО Ⅰ: Утицај услова околине на број нефрона
Mar 20, 2022
за више информација:ali.ma@wecistanche.com
ДЕО Ⅰ: Ефекти услова околине на број нефрона: Моделирање болести мајке и епигенетска регулација у развоју бубрега
Ларс Фухрманн, Саскиа Линднер, Алекандер-Тхомас Хаусер, Цлеменс Хосе и др.
1. Представљање
На развој фетуса утиче окружење ин утеро, а неповољна средина може да предиспонира болести као што су хипертензија, кардиоваскуларне болести и хроничне болести бубрега касније у животу [1-4]. Низ интраутериних поремећаја може довести до смањења нефрона и компромитоване бубрежне функције код потомака. Код глодара, услови који доводе до смањеног броја нефрона при рођењу укључују интраутерину рестрикцију раста (ИУГР), исхрану са мало протеина за мајку, лекове (укључујући кортикостероиде или нестероидне антиинфламаторне лекове), моногенетске мутације и низак ниво витамина А, као и дијабетес код мајке. и недостатак гвожђа [5-10]. Код људи тренутно не постоји неинвазивна метода мерења броја нефрона. Међутим, постморталне студије су показале негативну корелацију између броја нефрона и крвног притиска [4,11]. Поред тога, познато је да су интраутерина стања повезана са смањеним бројем нефрона, као што је ИУГР, повезана са повећаном стопом хипертензије и ЦКД[12].
Експерименти ин виво где су штетна интраутерина стања вештачки изазвана код трудних животиња показали су се од непроцењиве вредности за откривање и опис бубрежних промена изазваних код потомака. Међутим, свака експериментална интервенција током гестације доводи до сложених промена у физиологији мајке, плаценте и фетуса које могу саме да утичу на окружење метанефроа у развоју. Ек виво технике моделирања то заобилазе тако што омогућавају испитивање развоја бубрега потпуно одвојено од утицаја мајке животиње, плаценте или других органа фетуса. Изоловане културе метанефроја на интерфејсу средњег ваздуха је првобитно извео Тровелл 1950. године [13], а затим су рафинисане култивисањем бубрега на филтер мембранама[14], пружајући основу за једно-варијабилне услове културе.
Укратко, постоји све већи број доказа који сугеришу да су пренатални инзулти повезани са малим бројем нефрона релевантни за факторе ризика за хипертензију и ЦКД. Да би се развиле превентивне стратегије за обезбеђивање адекватног нефрона при рођењу, неопходно је механичко разумевање фактора који утичу на развој бубрега и нефрогенезу. У овом раду, култура метанефричких органа је коришћена за моделовање различитих аспеката регулације животне средине да би се проучавали њихови ефекти на раст бубрега и могуће импликације на дугорочну функцију бубрега и коришћена за скрининг епигенетских регулатора коришћењем малих једињења одобрених од стране ФДА.
Цлицк то Цистанцхе херба производи за функцију бубрега
2. Резултати
2.1. Употреба метанефричних органских култура за проучавање утицаја услова околине на развој бубрега
Да би се моделирали неповољни услови животне средине, бубрези из ембриона ембрионалног дана (Е) 12.5 култивисани су на интерфејсу средњег ваздуха (слика 1А). Да би се олакшало праћење развоја нефрона и гломерула, Сик2. Цре и Под. Коришћени су Цре дуал-флуоресцентни репортерски мишеви (Слика 1Б, Ц). Уобичајено стање током трудноће је грозница, која погађа више од 10 процената трудноћа током првих 16 недеља гестације [15] Топлота је добро окарактерисан тератоген, а показало се да хипертермија током трудноће доводи до побачаја фетуса, успоравања раста, и развојни дефекти, као што су агенеза бубрега, хипоплазија и мала порођајна тежина код неколико врста [16-21]. Да би се проценио утицај продужених хипертермичких стања са распоном температуре на раст бубрега и формирање нефрона, бубрези су изоловани и одржавани на 37 или 40 степени (Слика 1Д). Након 7 дана културе, бубрези култивисани на 40Ц били су у просеку 18,36 процената мањи од својих колега култивисаних у физиолошким условима (Слика 1Е). Међутим, није пронађена значајна разлика у броју гломерула по бубрегу између група (Слика 1Ф). Ипак, смањен укупни раст бубрега показује негативан ефекат повишене температуре на метанефрични раст.
Са око 19 процената трудница које пате од анемије услед недостатка гвожђа [22], недостатак гвожђа је једно од најраспрострањенијих стања са потенцијалом да поремети развој бубрега [23]. Подаци ин виво су показали да су раст бубрега, број гломерула и унос гвожђа у бубреге смањени током трудноћа које су погођене недостатком гвожђа код мајке [24]. Да би се проценио утицај смањене количине гвожђа везаног за трансферин на раст бубрега и нефрогенезу, експланти су култивисани у медијуму који садржи 50 уг/мл холотрансферина засићеног гвожђем или 50 уг/мл апо-трансферина осиромашеног гвожђем, редом. Бубрези ограничени гвожђем остали су много мањи од својих колега са довољно гвожђа и показали су повећану апоптозу у уретерним пупољцима и смањено гранање и пролиферацију уретерних пупољака (слика 1Г, додатна слика С1А-Ф). Док је популација нефрона била морфолошки непромењена, могло се видети смањење дисталног дела нефрона у развоју, као и дисталних тубула (слика 1Х, И, додатна слика С1Г-Ј). Бубрези са недостатком гвожђа били су, у просеку, 47,9 процената величине својих холо-трансферинских колега (Слика 1) и показали су смањење укупног броја гломерула по бубрегу од 69,9 процената након 7 дана у култури (Слика 1К) . Дакле, исцрпљивање гвожђа апо-трансферином показало је озбиљне ефекте на раст бубрега са фенотипом потпуно проксималне нефрогенезе.
Слика 1. Употреба култура метанефричних органа за проучавање утицаја услова околине на развој бубрега.(А) Урогенитални гребен из Е12.5 мишјих ембриона (лева плоча) је микрохируршки екстрахован (други панел), а бубрези су изоловани (трећи панел) и постављени на Трансвелл уметке (десни панел). Скалиране шипке∶ 1 мм (леви панел), 500 μм (трећи панел). (Б) Трансгени мишеви са двоструком експресијом Томато/ЕГФП коришћени су за условно обележавање шест2-позитивних ћелија и њихових потомака коришћењем Сик2. Цре или (Ц) подоцин-позитивне ћелије које користе Под. Цре мишеви. (Д) Експланти из истог ембриона су култивисани 7 дана на 37 или 40 степени. Скала бар∶ 500 μм. （Е） Површине експлантата узгајаних 7 дана на 37 или 40 степени .н=40 парова, упарени т-тест, средња вредност ±СД.(Ф) Број гломерула у групама експлантата после 7 дана.н{{ 17}} парова, упарени т-тест, средња вредност ±СД. (Г) Експланти из истог ембриона су култивисани 7 дана у медијуму који садржи холо-Тф или апо-Тф. Скала бар∶ 500 μм. (Х) Широкопољне слике холо-Тф и апо-Тф култивисаног пара експлантата обојеног против СИКС2 и Е-кадхерина након 48 х културе показују нормалан базен прогениторских ћелија и дефекте у раној морфологији нефрона. Скала бар∶100 μм. (И) Слике широког поља холо-Тф и апо-Тфкултурног пара експлантата обојене против ВТ1 и ЈАГ1. Скала бар∶100 μм. （） Површине холо-Тф и апо-Тф култивисаних експлантата након 7 дана.н=30 парови, упарени т-тест, средња вредност ± СД.(К) Број гломерула у групама експлантата након 7 дана.н =17 парови, упарени т-тест, средња вредност ± СД.
2.2. Ек Вио Излагање високој глукози доводи до промена повезаних са дијабетичком нефропатијом у бубрезима у развоју
Дијабетес мајке је још једно уобичајено стање током трудноће, са глобалном преваленцом хипергликемије у трудноћи од ~17 процената и преко 20 милиона живорођених сваке године [25]. Показало се да дијабетес индукован на моделима мишева и пацова доводи до потомака са мањим бројем нефрона[10,26,27]. Култура метанефричних органа је раније коришћена за проучавање утицаја високе глукозе на развој бубрега [27-29]. Раније смо пријавили смањење величине, броја нефрона и метилације ДНК у условима високе глукозе од 55 мМ[30]. За разлику од објављених података [28], у нашим узорцима није се могао видети никакав утицај на величину експланта или број гломерула када су узгајани у различитим медијумима од 30 мМ глукозе у поређењу са контролним условима од 5 мМ након 7 дана (додатна слика С2А, Б). Штавише, није се могло открити смањење метилације ДНК на ЛИНЕ-1 и главним сателитским местима (додатна слика С2Ц, Д). Даље је анализиран ефекат 55 мМ високе глукозе на развој бубрега након 7-дневне културе, показујући смањење брзине раста почевши од 3. дана у култури (Слика 2А, Б). Имунофлуоресцентно бојење није показало морфолошке дефекте СИКС2-позитивних прогениторских ћелија (Слика 2Ц), али је показало смањено бојење подоцитног маркера подокаликсина (ПОДКСЛ, Слика 2Д). Утврђено је да гломерули садрже задебљани гломеруларни базални матрикс видљив у хистолошким бојењима (Слика 2Е). Слични налази су направљени у електронској микроскопији, показујући повећање дебљине базалне мембране гломерула (Слика 2Ф), једног од најранијих маркера пред-дијабетеса и дијабетичке нефропатије (ДН)[31,32], у пет од шест бубрега и ниједном од седам контролних бубрега легла. Да би се даље разоткриле промене у транскриптому, извршена је анализа диференцијалне експресије гена у пару (ДГЕ) култура бубрега из три легла, при чему је један бубрег сваког ембриона култивисан са високим садржајем глукозе, а други са контролним медијумом и бубрези су прикупљени за анализу ( н=3).ДГЕ је потврдио регулацију компоненти екстрацелуларног матрикса као примарни биолошки процес који је регулисан нагоре (додатна табела С1). Снижено регулисани гени су углавном били укључени у (имуну) активацију ћелија и егзоцитозу / секрецију (додатна табела С1). Онтологија фенотипа сисара је указала на абнормалну морфологију кортекса бубрега и бубрежног тела услед смањене регулације гена као што су Пдгфб, Подкл, Рен, Птпро, Мафб и Вегфа (додатна табела С1). Утврђено је да је експресија у бубрезима неколико гена, као што су Ангптл4, Спон2 (Миндин), Паппа и Ткнип, за које се показало да су појачано регулисани код дијабетичке нефропатије [33-36], повећана у условима хипергликемије. Да би се упоредио профил експресије гена културе бубрега са високим садржајем глукозе са хуманим ДН, подаци ДГЕ су упарени са људским подацима из микродисекованих гломерула и тубула из биопсија пацијената са дијабетичком нефропатијом из Европске банке бубрежне цДНК (ЕРЦБ). Од 216 различито регулисаних гена који су упарени након анализе серије, 94 гена су била одговарајуће диференцијално регулисана у гломеруларним и/или тубуларним фракцијама (Слика 2Г). Преклапање нашег модела и људских ДН гена показало је 40 од 95 гена који су регулисани у гломерулима и 34 гена у тубулима (25 заједничких гена) (слика 2Х). Гени су углавном били укључени у организацију екстрацелуларног матрикса (ЦОЛ4А5, ЦОЛ4А6, ЦОЛ8А2, ЛАМБ3, ЛАМЦ3) и ћелијску адхезију (ИТГБЛ1, ЦЛДН15). Поред тога, гени повезани са дијабетесом, као што су ТКСНИП, СПОН2 и ПАППА, били су повећани. Од 120 гена са смањеном регулацијом из култура бубрега, 22 су такође смањене регулације у гломерулима, а 39 је такође смањено у тубулима (уобичајено 16 (Слика 2И). Ови гени су били укључени у одговор на ендогени стимулус (БМП2, КЛФ15, ЈУНБ, ЦТСБ), развој епитела нефрона (ПТПРО, ПОДКСЛ, ВЕГФА) и позитивна регулација хемотаксе ендотелних ћелија (ЛГМН, П2РКС4, ВЕГФА). Поред тога, гени повезани са дијабетесом, као што су РАСГРП3, СИРПА, ГАТМ и ЕСМ1, били су смањени [ 37-39]. Диференцијално регулисани гени који се не преклапају са ЕРЦБ подацима такође одражавају промене повезане са дијабетесом, као што је екстрацелуларни матрикс (АНГПТЛ4, ТНН, ДПТ, ЦОЛ9А2) или гестацијски дијабетес (ЛАТ2, ХП, ЦКСЦЛ10, ЦД{76} }, ЦД68, РЕН, СЛЦ2А3, ВЦАМ1). Дакле, развој бубрега у условима високог нивоа глукозе показао је изузетне сличности са дијабетичком нефропатијом код одраслих људи.
Слика 2. Ек виво висока изложеност глукози доводи до промена повезаних са дијабетичком нефропатијом у бубрезима у развоју.(А) Ембрионални бубрези из Под.Цре; Парадајз/ЕГФП животиње узгајане 7 дана у условима ниске глукозе (ЛГ, 5,5 мМ -Д-глукоза, 55 мМ манитола) или високе глукозе (ХГ, 55 мМ -Д-глукоза). Скала трака: 500 ум. (Б) Површина бубрега за ХГ и ЛГ стања.*,п=0.0474;*,п=0.0052;*,п<0.0001.paired t-test,="" mean="" ±="" sd.(c)="" confocal="" immunofluorescent="" stainings="" of="" day="" 7="" kidney="" cultures="" against="" six2="" and="" (d)="" podocalyxin="" with="" pan-cytokeratin="" and="" hoechst.scale="" bar:="" 100="" um.="" (e)="" stainings="" of="" 6="" um="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" scale="" bar:="" 20="" um.="" (f)transmission="" electron="" microscopy="" of="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" glomerular="" basement="" membranes="" are="" thickened="" in="" kidneys="" exposed="" to="" high="" glucose="" conditions.="" left="" column:="" magnification="" showing="" podocyte="" foot="" processes.="" scale="" bars:="" 500="" nm="" (left="" panels),100="" nm="" (right="" panels).(g)="" fold="" change="" of="" rna-seq="" data="" from="" hg="" compared="" to="" lg="" kidneys="" and="" ercb="" diabetic="" nephropathy="" (dn)patient="" microarray="" data="" from="" microdissected="" glomeruli="" and="" tubules="" showing="" differentially="" expressed="" genes.="" (h)="" genes="" upregulated="" in="" the="" kidney="" cultures(kc)overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="" highlighted.="" (i)genes="" downregulated="" in="" the="" kidney="" cultures="" (kc)="" overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="">
2.3. Ек виво Излагање високој глукози утиче на формирање дуготрајне меморије путем метилације ДНК
Да би се даље разумеле молекуларне промене посредоване хипергликемијским окружењем, културе бубрега су узгајане у условима високе глукозе током 3,5 дана, а затим су промењене у услове ниске глукозе исто време (слика 3А). Занимљиво је да инкубација у физиолошким условима након краћег периода инкубације у медијуму са високим садржајем глукозе није преокренула смањење раста након 7 дана у култури, при чему су културе расле истом брзином као и под континуираним третманом са високим садржајем глукозе (Слика 3Б). Штавише, метилација ДНК је показала хипометилацију ЛИНЕ-1 елемента и главних сателитских локуса (Слика 2Ц, Д), као и трајну хиперметилацију ДНК Ппаргцла промотера, и под високим нивоом глукозе и под обрнутим условима (Слика 3Е), што указује на формирање метаболичке меморије путем метилације ДНК због ранијих неповољних услова средине као средства феталног програмирања.
Слика 3. Екс виво висока изложеност глукози утиче на формирање дугорочне меморије путем метилације ДНК.(А) Снимање Е12.5 ембрионалних бубрега од дана 0 до 7. дана у медијуму са ниским нивоом глукозе (5,5 мМ), медијуму са високим нивоом глукозе (55 мМ) или медијуму са високим садржајем глукозе током 3,5 дана и прелазак на медијум са ниским нивоом глукозе за преостале дане.Размера: 500 ум. (Б) Површина бубрега током 7 дана. Средња вредност ± СД. н=36 бубрега. ЛГ, третман ниске глукозе; ХГ, третман са високом глукозом; ХГ до ЛГ, 3,5 дана висок и 3,5 дана низак третман глукозе.***,ЛГ-ХГ (неупарени т-тест):п=0.0004;**,ЛГ-ХГ до ЛГ (упарени т-тест ):п<0.0001.(c) analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" line-1="" and(d)major="" satellite="" loci="" shows="" continuous="" dna="" hypomethylation="" in="" high="" glucose="" treated="" conditions.**,p-value="0.0022.*,p-value=0.0357.(E)" analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" the="" ppargcla="" locus="" shows="" continuous="" dna="" hypermethylation="" in="" high="" glucose="" conditions.="" mean="" ±="" sd.="" *,p-value="">
2.4. Ек Виво екран малих једињења идентификује епигенетичке регулаторе развоја бубрега
Резултати овог рада, као и претходних радова, сугеришу да епигенетски механизми играју улогу у развоју бубрега [30, А40-45]. Стога смо желели да систематски проценимо ефекат епигенетских модулатора различитих класа ензима на развој бубрега. За ово смо одабрали библиотеку од 22 мала једињења одобрена од стране ФДА са показаном инхибиторном активношћу [46-56] (Слика 4А). Коришћењем Сик2.Цре-репортер мишева за процену развоја нефрона, бубрежне структуре су култивисане 3 дана са инхибиторима у медијуму. Повећава се величина током времена у поређењу са контролним органима легла, а морфологија је проверена на абнормалности у развоју (Слика 4Б). Може се показати да неколико инхибитора омета нормалан ек виво развој бубрега. ХДАЦ инхибитор ентиностат, инхибитор бензамид хистон деацетилазе са високим афинитетом за ХДАЦ1,2 и 3 [57], показао је доследно смањење раста и недостатак диференцијације и пролиферације након 3 дана (слика 4Ц). ТХ39 се развио као селективни инхибитор ХДАЦ8 (ИЦ50). ХДАЦ8 88 нМ, 26-преструко селективан према ХДАЦ1,28-преструко селективан према ХДАЦ6[56]), показао је сличну озбиљну инхибицију раста у поређењу са контролним органима легла. Штавише, хелатори гвожђа и инхибитори ЈмЈЦ деферасирокса и дефероксамина показали су смањење раста аналогно медијуму са недостатком гвожђа. Поред тога, СЕТ7/9 инхибитор ципрохептадин [58,59] показао је смањење раста и недостатак диференцијације и пролиферације у поређењу са контролним бубрезима (Слика 4Д), али се такође чинило да омета Внт сигнализацију (додатна слика С3). Други ХДАЦ, ХАТ, ХДМ и ХМТ инхибитори и ДНМТ инхибитор 5-азацитидин нису показали смањење раста или развојне аномалије у измереном временском оквиру (Слика 4А).
Слика 4. Ек виво мали екран једињења идентификује модулаторе развоја бубрега.(А) Листа малих једињења, њихових епигенетских циљева и коришћених концентрација показује смањење раста бубрега са ентиностатом, ТХ39, деферасироксом, дефероксамином и ципрохептадином у 3 независна експеримента после 3 дана у култури. Контролне културе су третиране са ДМСО. ***, п-вредност<0.0001. (b)examples="" of="" two="" sets="" of="" embryonic="" kidney="" cultures="" with="" pictures="" taken="" from="" day="" 0="" until="" day="" 3="" showing="" growth="" reduction="" and="" morphological="" differences="" in="" kidneys="" treated="" with="" th39,="" deferasirox,="" and="" deferoxamine="" compared="" to="" littermate="" control="" kidneys.="" scale="" bar∶="" 500="" μm.="" (c）entinostat="" showed="" growth="" reduction="" at="" 5="" and="" 10="" μm="" concentrations,="" no="" nephron="" differentiation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" (d)cvproheptadine="" showed="" growth="" reduction="" at="" 100="" and="" 50="" μm="" concentrations,="" lack="" differentiation,="" ureter="" dilation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" in="" culture.="" scale="" bar:="" 500="" um.="" panck,="" pan-cytokeratin.="" cc3,="" cleaved="" caspase-3.="" pcna,="" proliferating="" cell="" nuclear="">
