Део Ⅱ Недостатак Смад3 побољшава терапију дијабетеса и дијабетесне повреде бубрега засновану на острвцима промовишући пролиферацију ћелија преко Е2Ф3-зависног механизма

Методе

1. Животиње

Смад3-нулл (Смад3КО) мишеви су љубазан поклон проф. Цхукиа Денга и одржавани су у хетерозиготима (Смад3 плус /- ) у позадини Ц57БЛ/6 [20]. Смад3КО мишеви су генерисани укрштањем Смад3 плус /- мишева. дб/дб мишеви са мутацијом Лепр (лептинског рецептора) у позадини Ц57БЛКС купљени су од Експерименталног центра за животиње Кинеског универзитета у Хонг Конгу (ЦУХК). Све животиње су држане у објекту без специфичних патогена (СПФ) са слободним приступом храни и води у циклусу дан/ноћ од 12/12 х. Све манипулације на животињама у овој студији изведене су у складу са прописима и одобреним од стране Етичког комитета експеримената на животињама ЦУХК-а са Реф. Не. 18-177-МИС.

2. Стрептозоцин (СТЗ) изазван дијабетички мишји модел

Мужјацима Ц57БЛ/6 мишева старости од 8-10 недеља интраперитонеално је ињициран 50 мг/кг/дан СТЗ дневно током 5 континуираних дана. 5 дана након коначне СТЗ ињекције, мишеви са стабилном насумичном глукозом у крви више од 16 мМ током 2 узастопна дана су сматрани успешним успостављањем дијабетеса и коришћени су као мишеви примаоци за трансплантацију острваца.

3. Изолација острваца, трансплантација и процена дијабетичког фенотипа

Острва су изолована од мужјака или женки Смад3 нокаут (КО) или дивљег типа (ВТ) мишева у доби од 8-10 недеља као што је претходно описано [21]. Да би се извршила трансплантација оточића, назначено је да је неколико оточића пресађено испод бубрежне капсуле мужјака дб/дб мишева у доби од 4. седмице или СТЗ-индукованих дијабетичких мишева 7. дана након коначне ињекције СТЗ према протоколу који су описали Сзот ет ал. 22]. Укратко, миш прималац је анестезиран анестезијом Цомбо (1,5 процената кетамина и 0,15 процената ксилазина, 6 μЛ/г телесне тежине). Након губитка свести, направљен је рез од 1 цм на кожи која покрива леви бубрег. Нежно извуците бубрег и одржавајте га влажним стерилним физиолошким раствором током операције. Са иглом од 25Г направите малу огреботину на капсули да бисте направили урез. Наведени број острваца је достављен у бубрежну капсулу помоћу ПЕ50 цеви. На крају крајева, острвца су пресађена, запечатите ницк цаутеризацијом са малом топлотом. Замените бубрег и затворите перитонеум шавовима. Запечатите кожу спајалицама. 100 μЛ раствора пеницилин-стрептомицина (Гибцо, кат. бр. 15140122, САД) је убризгано интраперитонеално да би се спречила инфекција. 100 μЛ Тегмиц-а је убризгано интрамускуларно да би се ублажио бол. Животиња је стављена у топло окружење до потпуног опоравка. Иста операција је такође спроведена код лажних контролних мишева, али без инфузије острваца. И насумични нивои глукозе у крви и нивои глукозе у крви током 6 х наташте (РБГ и ФБГ) у крви из врха репа проверавани су једном недељно помоћу преносивог мерача глукозе (Роцхе, АЦЦУ-ЦХЕК® Перформа). Тест инсулинске резистенције (ИПИТТ), тест толеранције на глукозу (ИПГТТ), нивои ХбА1ц и инсулина у серуму су мерени као што је претходно описано [9].

Кликните овде да бисте добиликористи Цистанцхе

4. Укупни протеини у урину и креатинин у серуму

24 х урин је сакупљен у метаболичком кавезу. Укупни протеин у урину за 24 сата израчунат је множењем запремине урина и концентрације протеина у урину који је квантификован помоћу Куицк Старт Брадфорд Протеин Ассаи Кит-а (Био-Рад, кат. бр. 5000201, САД). Креатинин у серуму је одређен комплетом за квантификацију креатинина (Станбио Лаборатори, цат# 0430-120, САД).

5. Хистопатологија

Хистопатолошке промене бубрега су испитиване у параформалдехидом фиксираним, парафином уграђеним пресецима (4 µм) са Периодиц Ацид-Сцхифф-овим (ПАС) реагенсом као што је претходно описано [23]. Проширење мезангијалне матрице је оцењено коришћењем програма за квантитативне слике (Имаге-Про Плус 7.0, Медиа Цибернетицс) као што је претходно описано [23].

6. Имунохистохемија

Бубрег или панкреас који носи острвце фиксиран је у 4 процента параформалдехида, уграђен у парафин и пресечен на 4 μм. Након рехидрације, секције су третиране микроталасним узимања антигена у 0.01 М цитрату (пХ 6.0) током 10 минута и блокирањем у 5% БСА током 1 х. . Примарна инкубација антитела је обављена преко ноћи на 4 степена. За флуоресцентно бојење, флуоресцентно секундарно антитело је примењено на собној температури (РТ) током 1 х. За термогенезу посредовану ДАБ-ом, додатни корак од 3 процента Х2О2 блокирања током 15 минута је укључен пре узимања антигена. Након примарне инкубације антитела, додат је ХРП-коњуговани полимер (Енвисион плус Систем, Дако, САД). За бојење Е2Ф3, узимање антигена је извршено у раствору ЕДТА-Трис (пХ 9,0). Антитела коришћена у имунохистохемији су детаљно приказана у табели С2. Позитивна област бојења је квантификована помоћу софтвера Имаге Ј (в1.47, НИХ, САД).

Екстракт Цистанцхе

7. Мерење калемљене ћелијске масе у бубрегу који носи острвце

Индекс просечне површине ћелије по секцији је коришћен за семи-квантитативно одређивање ћелијске масе у трансплантату острваца. Укратко, бубрег који носи острвце (уграђен у парафин) је узастопно пресечен на 4 μм дуж сагиталне осе. Континуирани пресеци у интервалима од 160 μм су флуоресцентно имуно обојени на инсулин. Најмање 6 секција са инсулин-позитивним бојењем коришћено је за израчунавање површине ћелије по секцији у сваком мишу. Подручје ћелије позитивне на инсулин у свакој секцији је квантификовано помоћу софтвера Имаге Ј (в1.47, НИХ, САД). Индекс просечне површине ћелије по секцији код сваког миша је израчунат дељењем укупне инсулин-позитивне површине на све делове са бројем инсулин-позитивних делова.

8. Примарна култура ћелија острваца

Изолована острвца су раздвојена у појединачне ћелије и засејана у 96-плочу у 200 μЛ РПМИ 1640 (Гибцо, САД) плус 10 процената ФБС (Гибцо, САД) плус 1 проценат пеницилин-стрептомицина (Гибцо, САД) допуњен са 20 мМ глукозе. Ћелије острваца су култивисане наведено време у инкубатору постављеном на 37 степени, 5 процената ЦО2 и 100 процената влажности. За уништавање Е2Ф3 посредовано аденовирусом, дисоциране ћелије оточића су култивисане у медијуму који садржи аденовирус који прекомерно експримира кратку укосну РНК (схРНА) циљајући мишји Е2Ф3 (схЕ2Ф3) или контролну неспецифичну схРНА (приказано) у титру од 10 пфу по ћелији за 2 дана након чега следи средња замена. Секвенца стабла дуплекса схЕ2Ф3 била је 5'-ЦАТЦЦАТГЦТЦТАТТЦТГТ-3'. Дисперговане ћелије са 50 острваца су засејане по бунарчићу за имунобојење и РТ-ПЦР, и 100 острваца по бунарчићу за Вестерн блот, који су спроведени као што је претходно описано [9].

9. Ин виво и ин витро БрдУ обележавање

Да би се извршило ин виво обележавање БрдУ, мишеви су интраперитонеално убризгани са 50 мг / кг / дан БрдУ (у ПБС) током 7 дана од 2. дана након трансплантације острваца и жртвовани су 2 сата након последње ињекције. За ин витро обележавање БрдУ, дисперговане ћелије острваца су култивисане 48 х, након чега је замењена свежим медијумом који садржи 10 μМ БрдУ и култивисана додатна 24 х. Флуоресцентно имунолошко бојење против БрдУ у ткиву и култивисаним ћелијама изведено је као што је претходно описано [9].

Цистанцхе прах

10. РНА-Сек

Острва су изолована од мишева Смад3ВТ-дб/дб, Смад3КО-дб/дб, Смад3ВТ-дб/м и Смад3КО-дб/м. За сваки генотип, острвца од више од 5 мишева су спојена за изолацију РНК. РНК је припремљена са миРНеаси Мини Кит (Киаген, Немачка). РНА-сек и анализа података низводно описани су раније [9]. Ниво експресије датог гена је представљен као фрагменти по килобази транскрипта на милион мапираних читања (ФПКМ). Диференцијално изражен ген (ДЕГ) је дефинисан као варијанса ФПКМ-а између две групе већа или једнака 2 пута. Регулисани и ниже регулисани ДЕГ су комбиновани и коришћени за анализу обогаћивања путева генске онтологије (ГО) и Кјото енциклопедије гена и генома (КЕГГ) са онлајн ДАВИД биоинформатичким ресурсима (в6.8) са подразумеваним подешавањима. ГОТЕРМ_БП_ДИРЕЦТ поткатегорија је коришћена за ГО анализу.

11. Имунопреципитација

Да би се извршила имунопреципитација у мишјим острвцима, око 500 свеже изолованих острваца је лизирано у 500 мЛ РИПА пуфера. Додато је зечје анти-Смад3 антитело (2 уг) или изотип зечјег ИгГ и инкубирано на 4 степена преко ноћи уз лагану ротацију. Затим је додато 20 μЛ зрна протеина А агарозе (Беиотиме, цат# П2051, Кина) и инкубирано 2 х на 4 степена. Након снажног испирања свежим РИПА пуфером, везани протеин је ослобођен денатурацијом у пуферу за пуњење 1кСДС и подвргнут Вестерн блот анализи. Да би се избегао утицај тешког ланца ИгГ, коришћен је мишји анти-зечји ИгГ специфичан за лаки ланац (ХРП коњугован, Абмарт, кат. # М21006, Кина) за препознавање преципитираног Смад3 протеина.

12. Имунопреципитација хроматина-ЦхИП

Да би се извршио ЦхИП у мишјим острвцима, сакупљено је око 2000 острваца од 8-10 недеља старих Ц57БЛ/6 мишева и коришћено као један ЦхИП препарат. Свеже изолована острва су стимулисана са 10 нг/мЛ ТГФ- 1 (Гибцо, САД) током 15 минута у РПМИ 1640 плус 1 проценат ФБС плус 1 проценат пеницилин-стрептомицина. ЦхИП је изведен са СимплеЦхИП® Плус Ензимским хроматинским ИП комплетом (ЦСТ, САД) према препорученом упутству. Антитела и прајмери ​​коришћени у ЦхИП тесту су детаљно описани у табели С1 и С2.

Стандардизед Цистанцхе

13. Дуал-луциферасе репортер тест

Промотор Е2Ф3 миша (-1000 до плус 451 бп) је клониран у пГЛ3-основни вектор (пГЛ3-Е2Ф3.Про). Истовремено, спроведена је тачкаста мутација места везивања Смад3 да би се генерисао пГЛ3- Е2Ф3.Про. Мут. Да би се извршио тест репортера са двоструком луциферазом, ћелије ХЕК293Т су засејане у плочу са 24-бунарићем при густини од 5 к 104 ћелија/бунарићу. Следећег дана, ћелије су трансфектоване са 500 нг пГЛ3-Басиц или пГЛ3-Е2Ф3.про или пГЛ3-Е2Ф3.про.мут у комбинацији са пцДНА3.1-Смад3, који прекомерно експримира мишји Смад3, или не (као што је приказано на слици 10Ф) методом фосфатног калцијума. Вектор пЕГФП-Ц1 је допуњен да би се уравнотежила доза трансфекције у сваком третману. 10 нг пГЛ4.73.хуц/СВ40 вектора који експримира ренила луциферазу је укључено у сваки третман да би се нормализовала ефикасност трансфекције. 6 х након трансфекције, подлога је промењена након чега је уследила инкубација додатних 48 х. Ћелије су лизиране, а активност луциферазе је одређена помоћу система Дуал-Луциферасе® Репортер Ассаи (Промега, САД) и квантификована у луминометру (ВИЦТОРТМ Кс4 2030 Мултилабел Реадер, ПеркинЕлмер, САД). Транскрипциона активност клонираног Е2Ф3 промотора је представљена као однос вредности луциферазе кријеснице и ренила луциферазе. Сваки третман је изведен у три примерка.

14. Статистика

Подаци су представљени као средња вредност ± СД и анализирани помоћу СПСС софтвера (16.0). Нормалност података је проверена тестом Колмогоров-Смирнов са једним узорком. Хомогеност варијанси међу групама тестирана је статистиком Левена. За поређење између две групе коришћен је Студентов т-тест. За поређење међу више група, коришћена је једносмерна АНОВА са ЛСД тестом ако је претпостављена једнака варијанса. За једнаку варијансу која није претпостављена, коришћена је алтернативна статистика Велчовог теста праћена вишеструким поређењима са Тамханеовим Т2 тестом. П < 0.05 се сматрало статистички значајним.

Цистанцхе суплементи

Закључци

Недостатак Смад3 у великој мери побољшава терапију замене острваца за Т1ДМ и Т2ДМ и штити од дијабетесне повреде бубрега. Повећана пролиферација ћелија зависна од Е2Ф3- може бити кључни механизам терапије Смад3КО острваца и код Т1ДМ и Т2ДМ. Стога, терапија замене ћелија Смад3КО може бити клинички боља терапијска стратегија за дијабетес.

Референце

1 Схапиро АМ, Покривцзинска М, Рицорди Ц. Клиничка трансплантација острваца панкреаса. Нат Рев Ендоцринол. 2017; 13: 268-77.

2. Јацобсон ЕФ, Тзанакакис ЕС. Диференцијација људских плурипотентних матичних ћелија до функционалних ћелија панкреаса за терапије дијабетеса: иновације, изазови и будући правци. Ј Биол Енг. 2017; 11: 21.

3. Тосо Ц, Иссе К, Деметрис АЈ, Диниари П, Кох А, Имес С, ет ал. Хистолошка процена графта након клиничке трансплантације острваца. Трансплантација. 2009; 88: 1286-93.

4. Лан ХИ. Различите улоге ТГФ-бета/Смадс у бубрежној фибрози и упали. Инт Ј Биол Сци. 2011; 7: 1056-67.

5. Менг КСМ, Танг ПМ, Ли Ј, Лан ХИ. ТГФ-бета/Смад сигнализација код реналне фиброзе. Фронт Пхисиол. 2015; 6: 82.

6. Ел-Гохари И, Тулацхан С, Виерсцх Ј, Гуо П, Велсх Ц, Прасадан К, ет ал. Смад сигнална мрежа регулише пролиферацију ћелија острваца. дијабетеса. 2014; 63: 224-36.

7. Дхаван С, Дирице Е, Кулкарни РН, Бхусхан А. Инхибиција ТГФ-бета сигнализације промовише репликацију хуманих бета ћелија панкреаса. дијабетеса. 2016; 65: 1208-18.

8. Ванг П, Каракосе Е, Лиу Х, Свартз Е, Ацкеифи Ц, Златанић В, ет ал. Комбинована инхибиција путева ДИРК1А, СМАД и триторакса синергије да изазове робустну репликацију у одраслим људским бета ћелијама. Целл Метаб. 2019; 29: 638-52 е5.

9. Схенг ЈИ, Ванг Л, Танг ПМ-К, Ванг ХЛ, Ли ЈЦ, Ксу БХ, ет ал. Недостатак Смад3 промовише пролиферацију и функцију бета ћелија код дб/дб мишева кроз обнављање експресије Пак6. Тхераностицс. 2021; 11: 2845-59.

10. Змуда ЕЈ, Повелл ЦА, Хаи Т. Метода за изолацију мишјих острваца и субкапсуларну трансплантацију бубрега. Ј Вис Екп. 2011.

11. Цхои МИ, Лим СЈ, Ким МЈ, Вее ИМ, Квон Х, Јунг ЦХ, ет ал. Трансплантација изотрансплантата острва побољшава осетљивост на инсулин у мишјем моделу дијабетеса типа 2. Ендокрине. 2021; 72: 660-71.

12. Вијаиацхандра К, Хиггинс В, Лее Ј, Глицк А. Индукција п16инк4а и п19АРФ помоћу ТГФбета1 доприноси заустављању раста и одговору на старење у кератиноцитима миша. Мол Царциног. 2009; 48: 181-6.

13. Диер МА, Цепко ЦЛ. Регулисање пролиферације током развоја мрежњаче. Нат Рев Неуросци. 2001; 2: 333-42.

14. Дисон Н. Регулација Е2Ф протеинима породице пРБ. Генес Дев. 1998; 12: 2245-62.

15. Ксиао Кс, Фисцхбацх С, Сонг З, Гаффар И, Зиммерман Р, Виерсцх Ј, ет ал. Пролазна супресија сигнализације ТГФбета рецептора олакшава трансплантацију људског острва. Ендоцринологи. 2016; 157: 1348-56.

16. Номура М, Зху ХЛ, Ванг Л, Моринага Х, Такаианаги Р, Терамото Н. Поремећај СМАД2 у бета ћелијама панкреаса миша доводи до хиперплазије острваца и поремећене секреције инсулина услед слабљења активности К плус канала осетљивог на АТП. Диабетологиа. 2014; 57: 157-66.

17. Ради Б, Цхен И, Ваца П, Ванг К, Ванг И, Салмон П, ет ал. Прекомерна експресија Е2Ф3 промовише пролиферацију функционалних људских бета ћелија без индукције апоптозе. Целл Цицле. 2013; 12: 2691-702.

18. Зханг И, Алекандер ПБ, Ванг КСФ. ТГФ-бета породична сигнализација у контроли пролиферације и преживљавања ћелија. Цолд Спринг Харб Перспецт Биол. 2017; 9.

19. Ванг П, Фиасцхи-Таесцх НМ, Васавада РЦ, Сцотт ДК, Гарциа-Оцана А, Стеварт АФ. Дијабетес мелитус--напредак и изазови у пролиферацији људских бета ћелија. Нат Рев Ендоцринол. 2015; 11: 201-12.

20. Ианг Кс, Леттерио ЈЈ, Лецхлеидер РЈ, Цхен Л, Хаиман Р, Гу Х, ет ал. Циљано оштећење СМАД3 доводи до ослабљеног имунитета слузокоже и смањене реакције Т-ћелија на ТГФ-бета. ЕМБО Ј. 1999; 18: 1280-91.

21. Ли ДС, Иуан ИХ, Ту ХЈ, Лианг КЛ, Даи Љ. Протокол за изолацију острва из мишјег панкреаса. Нат Протоц. 2009; 4: 1649-52.

22. Сзот ГЛ, Коудриа П, Блуестоне ЈА. Трансплантација острваца панкреаса у капсулу бубрега дијабетичких мишева. Ј Вис Екп. 2007: 404.

23. Ксу БХ, Схенг Ј, Иоу ИК, Хуанг КСР, Ма РЦВ, Ванг К, ет ал. Брисање Смад3 спречава реналну фиброзу и упалу код дијабетичке нефропатије типа 2. Метаболизам. 2020; 103: 154013.

Хонг-Лиан Ванг1,2, Биао Веи2, Хуи-Јун Хе2, Ксиао-Ру Хуанг2,3, Јинг-Ии Схенг2,4, Ксиао-Цуи Цхен2,5, Ли Ванг1, Руи-Зхи Тан1, Јиан-Цхун Ли1, Јиан Лиу1, Си-Јин Ианг6, Роналд ЦВ Ма2 и Хуи-Иао Лан2,7

1 Истраживачки центар за интегрисану медицину и одељење за нефрологију, придружена болница традиционалне кинеске медицине Југозападног медицинског универзитета, Луџоу, Сечуан, 646000, Кина.

2. Одељење за медицину и терапију, и Институт здравствених наука Ли Ка Шинг, Кинески универзитет у Хонг Конгу, Хонг Конг, 999077, Кина.

3. Заједничка лабораторија Гуангдонг-Хонгконг за имунолошке и генетске болести бубрега, Народна болница провинције Гуангдонг, Академија медицинских наука Гуангдонг, Гуангџоу, Гуангдонг, 510080, Кина.

4. Државна кључна лабораторија за биоелектронику, кључна лабораторија Јиангсу за биоматеријале и уређаје, Школа биолошких наука и медицинског инжењерства, Југоисточни универзитет, Нањинг, Кина.

5. Кључна лабораторија за превенцију и управљање хроничном бубрежном болешћу града Зхањианг, Институт за нефрологију, придружена болница Медицинског универзитета Гуангдонг, Зхањианг, Гуангдонг, 524001, Кина.

6. Национална база за клиничка истраживања традиционалне кинеске медицине, придружена болница традиционалне кинеске медицине Југозападног медицинског универзитета, Луџоу, Сечуан, 646000, Кина.

7. Заједничка истраживачка лабораторија за имунолошке и генетске болести бубрега ЦУХК-Гуангдонг Провинциал Пеопле'с Хоспитал, Кинески универзитет у Хонг Конгу, Хонг Конг, 999077, Кина.