Део Ⅰ Хелатор гвожђа, ПБТ434, модулише трансћелијску трговину гвожђем у микроваскуларним ендотелним ћелијама мозга

Апстрактан

Гвожђе и други прелазни метали, као што су бакар и манган, неопходни су за подржавање функције мозга, али је прекомерна акумулација цитотоксична. Ова прекомерна акумулација метала, посебно гвожђа, уобичајена је за неколико неуролошких поремећаја; ово укључује Алцхајмерову болест, Паркинсонову болест, Фридрихову атаксију и друге поремећаје који се манифестују неуродегенерацијом и повезаном акумулацијом гвожђа у мозгу. Управљање флуксом гвожђа помоћу крвно-мождане баријере представља прву линију одбране од прекомерне акумулације гвожђа у нормалној физиологији и овим патолошким стањима. У овој студији смо утврдили да хелатор гвожђа ПБТ434, који се тренутно развија за лечење Паркинсонове болести и вишеструке системске атрофије, модулира унос гвожђа микроваскуларним ендотелним ћелијама људског мозга (хБМВЕЦ) хелацијом екстрацелуларног Фе.^{2 плус}. Третман хБМВЕЦ са ПБТ434 доводи до повећања обиља транскрипата за трансферин рецептор (ТфР) и церулоплазмин (Цп). Вестерн блот и ЕЛИСА анализе такође откривају одговарајуће повећање протеина. Унутар ћелије, ПБТ434 повећава ниво добротворног, лабилног Фе^{2 плус}; подаци указују да овај Фе^{2 плус}се ослобађа из феритина. Поред тога, ПБТ434 појачава ефлукс гвожђа вероватно због повећања цитосолног гвожђа гвожђа, супстрата за извозника гвожђа, феропортина. ПБТ434 се уравнотежује брзо и двосмерно преко хБМВЕЦ крвно-мождане баријере. Ови резултати указују да ПБТ434-комплекс гвожђа није супстрат за унос хБМВЕЦ и стога подржава модел у којем би ПБТ434 хелатирао интерстицијално гвожђе и инхибирао поновно преузимање гвожђа од стране ендотелних ћелија крвно-мождане баријере, као као и инхибирају његово преузимање од стране других ћелија неуроваскуларне јединице. Све у свему, ово представља нов и обећавајући механизам за терапеутско хелирање гвожђа.

Кликните овде да бисте добиликоје су предности Цистанцхеа

Увод

Терапија хелацијом метала (МЦТ) се дуго користила као третман за тровање транзиционим металима и за генетске поремећаје у метаболизму есенцијалног металног јона који доводи до прекомерне акумулације метала [1–3]. Два примера последњег су хиперакумулација бакра код Вилсонове болести [4] и гвожђа код наследне хемохроматозе [5]. И бакар и гвожђе су катализатори оксидативног стреса и стога су цитотоксични у концентрацијама које превазилазе способност ћелије и организма да „прати“ ове редокс активне прелазне метале [6, 7]. Акумулација гвожђа је нарочито идиопатска; заиста, повећање гвожђа је обележје старења мозга [8–10]. Патолошки, ова акумулација гвожђа у мозгу је карактеристика мутација у генима који нису повезани са метаболизмом гвожђа [11–15], као и низа других неуродегенеративних болести, од којих некима недостаје специфична генетска веза као што је старење [16], Алцхајмерова болест [ 17], Фридрајхова атаксија [18] и Паркинсонова болест [19]. Као група, такви поремећаји се могу сматрати неуродегенерацијом са акумулацијом гвожђа у мозгу (НБИА) иако је овај акроним обично ограничен на оне за које је идентификована генетска веза [11, 13, 14].

У случају преоптерећења гвожђем, циљ је 'очистити' тело од вишка гвожђа због дефекта у преузимању или ефлуксу гвожђа ћелијама. Овде је циљ да се надмаши физиолошки хелатори гвожђа са леком; једињење које има добру фармакокинетику и висок афинитет за обојено гвожђе је циљни лек. Пошто је тело презасићено есенцијалним металом, мало је забринутости због изазивања недостатка у току лечења. Лечење церебралне болести терапијом хелацијом гвожђа захтева другачију стратегију. Ово није проблем системског преоптерећења гвожђем, већ акумулације гвожђа у подручјима патологије са штетним низводним последицама. Акумулација гвожђа повезана са годинама код Паркинсонове болести (ПД), на пример, потенцијално доприноси оштећењу ћелија које је повезано са оксидативним стресом [20]. Прекомерно лабилно гвожђе промовише погрешно савијање -синуклеина у неуронима црне супстанце. Употреба хелатора високог афинитета може довести до одређеног смањења оптерећења гвожђем у мозгу, али ће сасвим сигурно изазвати недостатак гвожђа који је барем у старијој популацији контраиндикован с обзиром на системски недостатак гвожђа уобичајен за ту старосну групу [21] . Хелатор са оптималним афинитетом има потенцијал да смањи акумулацију гвожђа као и пратећи оксидативни стрес због вишка лабилног гвожђа и основних болести.

Цистанцхе тубулосаиЦистанцхеови ефекти

Један хелатор одобрен за употребу у лечењу преоптерећења гвожђем изазваног трансфузијом код пацијената са таласемијом је деферипрон (ДФП, бренд Феррипрок) [5, 22]. ДФП се такође користи у лечењу Фридрихове атаксије [23] и Паркинсонове болести [24, 25]. У мета-анализи се показало да ДФП обезбеђује значајно смањење садржаја гвожђа у миокарду, као и већу заштиту срца код пацијената са таласемијом од дефероксамина, класичног хелатног средства за гвожђе [5]. С друге стране, ДФП се брзо метаболише у јетри [26] и новији рад је показао да хелатира Фе2 плус на активном месту хистон лизин деметилаза зависних од гвожђа, активност која је у корелацији са раније непрепознатом цитотоксичношћу [27]. Овај налаз наглашава кључно ограничење у коришћењу терапије хелацијом гвожђа, односно конкуренцију лека за физиолошки есенцијално гвожђе, било у складишту гвожђа или протеину који садржи протетске врсте гвожђа. Без обзира на то, ДФП је, на пример, показао ефикасност у пробном третману Паркинсонове болести фазе 2, на шта указују и аналитички (смањено оптерећење гвожђем у мозгу помоћу Т{14}} пондерисане МРИ) и индекси понашања (когнитивна и моторна неуронска функција) [ 24, 25].

Међутим, афинитет ДФП-а за Фе3 плус остаје забрињавајући. Стабилна врста ДФП-гвожђа је трис-комплекс, [Фе(ДФП)3] 0 [28]. Док је неутралност овог комплекса идеална за мобилизацију гвожђа из ћелије, константа стабилности за њега, ~1037, чини ДФП правим чистачем гвожђа; у овом контексту, његова инхибиција ензима гвожђа као што је лизин деметилаза је предвидљива [27]. Ова забринутост одражава потребу за развојем хелатора гвожђа који имају мембранску пермеабилност ДФП-а, али знатно слабији афинитет и за Фе2 плус и за Фе3 плус. Ова последња карактеристика ограничава уклањање лека из протетског метала и термодинамички потенцијал хелатног агенса да катализује аутооксидацију гвожђа која доводи до производње реактивних врста кисеоника. У суштини, јаки келатори фери гвожђа катализују прооксидативна својства Фе2 плус [29]. У овој студији извештавамо како такав келатор гвожђа са умереним афинитетима за гвожђе и гвожђе модулира флукс гвожђа у микроваскуларним ендотелним ћелијама мозга које формирају крвно-мождану баријеру (БББ).

Цистанцхе пилуле

Овај лек, ПБТ434 [5,7-дихлоро-2-((метиламино)метил)-8-хидрокси-3-метилхиназолин-4 (3Х)-он, Слика 1А] , формира комплекс бис-гвожђа са лог константама стабилности од ~11 и ~15 за Фе^{2 плус}и Фе^{3 плус}, односно [30]. ПБТ434 је спречио губитак неурона субстантиа нигра парс цомпацта (СНпц), смањио акумулацију ниграл-синуклеина, смањио садржај гвожђа у средњем мозгу повезан са моделом ПД и спасио моторне перформансе у два мишја модела Паркинсонове болести без икаквог очигледног исцрпљивања системских залиха гвожђа [30]. ПБТ434 је такође ефикасан у мишјим моделима вишеструке системске атрофије (МСА) [30, 31], моторичког поремећаја сличног Паркинсоновој, али који карактерише погрешно савијање -синуклеина и накнадна акумулација која изазива формирање глијалних цитоплазматских инклузија које су обележје патологија болести [32]. Значајно је да је ПБТ434 смањио маркере оксидативног стреса у моделима ПД код миша [30] што указује на то да 1) ПБТ434 циља залихе гвожђа које су иначе биле припремљене да функционишу као прооксиданси и 2) ПБТ434 није потенцирао ову насталу цитотоксичност засновану на оксидацији. ПБТ434 је на задовољавајући начин завршио студију фазе 1 [33].

Рад који је овде представљен је дизајниран да испита утицај који ПБТ434 има на трговину гвожђем у ћелијама баријере мозга, микроваскуларним ендотелним ћелијама које заједно са основном глиом формирају крвно-мождану баријеру. Ове студије су користиле добро валидирану бесмртну ендотелну ћелијску линију у монослојним и трансвелл форматима културе [34–37]. Примарни циљ ових студија био је да се утврди кинетика узимања и ефлукса гвожђа из ових ћелија и њихова модулација помоћу ПБТ434. Трансвелл БББ модел је такође коришћен да би се демонстрирао двосмерни трансцелуларни флукс ПБТ434 преко баријере ендотелних ћелија. Модел је демонстрирао у молекуларном смислу да ПБТ434 инхибира унос гвожђа хелацијом док стимулише ефлукс гвожђа. Студије снимања ћелија показују да ПБТ434 приступа истом лабилном базену гвожђа који је испитан класичним Фе^{2 плус}хелатни агенс, 2,2'-бипиридин или бипиридил, и флуоресцентна сонда за обојено гвожђе. Резултати сугеришу могући механизам деловања за ПБТ434 који укључује инхибицију узимања системског гвожђа у БББ и накнадну секвестрацију гвожђа у мозгу у интерстицијалном простору.

Резултати

1. ПБТ434 нема цитотоксичне ефекте на микроваскуларне ендотелне ћелије мозга

Да бисмо одредили одговарајући опсег радних концентрација за ПБТ434 у нашој ин витро ћелијској култури, користили смо МТТ тест за праћење хБМВЕЦ митохондријалне функције као одговор на ПБТ434. На основу претходних извештаја [30], третирани су опсегом концентрација ПБТ434 до 100 μМ током 24 сата. Нисмо приметили значајне промене у виталности хБМВЕЦ са било којом тестираном концентрацијом (слика 2).

2. ПБТ434 се брзо преузима и прометује преко хБМВЕЦ баријере

ПБТ434 је орално биорасположиви лек који може лако да продре у БББ, као што се види у студијама спроведеним на мишевима и људима [30, 38, 39]. Пратили смо акумулацију ПБТ434 у хБМВЕЦ узгојеним у монослојевима користећи ПБТ434 обележен са 14Ц као радиотрацер. Подаци су показали да се у првој фази 14Ц-ПБТ434 брзо уравнотежио између медијума за унос и ћелије. Ово почетно унос је праћено додатном спором акумулацијом током 3 х која је показала брзину од 30,1 ± 9,8 пмол/мг/х (слика 3А). У протоколу за унос, унос се гаси и ћелије се испиру на 4˚Ц пре обраде за акумулацију 14Ц-ПБТ434 (Методе). У посебном експерименту, испитали смо ефлукс 14Ц-ПБТ434 из хБМВЕЦ након периода пуњења од 30 минута. У протоколу ефлукса, ћелије се испиру на 25˚Ц. Подаци на слици 3Б показују да је у прању на 25˚Ц изгубљено приближно 92 процента ћелија акумулираног 14Ц-ПБТ434 (цф 550 пмол 14Ц-ПБТ434/мг протеина у 3А на 30 минута до 43 пмол 14Ц-ПБТ433 протеин на т=0 у 3Б). Дошло је до даљег спорог губитка преосталог 14Ц-ПБТ434 (слика 3Б). Подаци указују на два аспекта акумулације и ефлукса ПБТ434 помоћу хБМВЕЦ. Проток кроз плазма мембрану брзо достиже оно што се чини као равнотежу, било током узимања или ефлукса. Међутим, у оба процеса се појављује још један спорији процес. Ово сугерише да је унутар ћелије, неки део ћелије ПБТ434 у локалу/стању које је у кинетичком стабилном односу са фракцијом у равнотежи са ванћелијским миљеом. Кинетичка анализа забележена на Слици 3Б процењује да је овај скуп ПБТ434 представљен са 27±4 пмол/мг протеина у ћелијском лизату када су ћелије третиране са 20 μМ реагенса.

Да бисмо испитали трансцелуларни флукс ПБТ434, користили смо добро валидиран ин витро модел БББ-а који користи раст на апикалној страни мембране трансбунара [35, 36, 40, 41]. Баријерна својства ових трансвелл култура су верификована квантификацијом њихове трансендотелне електричне отпорности (ТЕЕР) и непропусности за ФИТЦ-обележени декстран (С1 слика). Упоредили смо унос 14Ц-ПБТ434 на луминалној (или апикалној, крвној страни) (слика 4А) са уносом на аблуминалној (или базолатералној, можданој страни) (слика 4Ц) мембрани. У истом експерименту, одговарајући ефлукс (трансћелијски флукс) је квантификован појавом 14Ц-ПБТ434 у ефлуксној комори (слика 4, панели Б и Д). Брзине ових процеса су дате у табели 1. Подаци о маси илустровани на слици 4 (панели Б и Д) показују да је нето проток ПБТ434 кроз овај модел крвно-мождане баријере био исти у два смера. Било је 976 ± 185 пмол 14Ц-ПБТ434 акумулираних у базалној комори (слика 4Б) и 1033 ± 210 пмол квантификовано у базалној комори (слика 4Д). Ова блиска еквивалентност се такође одразила на блиско сличне стопе ефлукса ПБТ434 на две баријерне мембране (Табела 1). Међутим, у овом моделу баријере дошло је до значајно већег уноса ПБТ434 на базолатералну мембрану, као што је илустровано ~50 процената већег губитка једињења из базалне коморе (слика 4Ц) што је одговарало ~40 процената већој стопи привидног уноса ћелија (Табела 1). Предвиђа се да ће снажније усвајање резултирати већом акумулацијом. Анализа ћелија у 3 х показала је да су задржале ~6 μМ ПБТ434 без обзира на смер флукса. Вредности су биле 8,1±1,3 μМ (апикално до базално) и 4,7±1,2 μМ (базално до апикално). Као што је горе наведено, ова анализа прати испирање ћелија пре лизе и квантификацију укупног ћелијског протеина и 14Ц-ПБТ434. Поред тога, медијум у апикалној комори је садржао РПМИ плус 10 процената ФБС и 10 процената НуСерума, док је базална, „мождана“ комора садржала само РПМИ (методе). Разуман закључак је био да је веће 'узимање' на базалној мембрани одражавало адсорпцију ПБТ434 на површини ћелије која је била ограничена у апикалној комори присуством протеинских компоненти у серуму. Након прања ћелија за акумулацију ПБТ434, овај адсорбовани материјал (који је регистрован као 'уптаке') је уклоњен. Понављање овог експеримента са флуксом, али са серумом у базалној комори, показало је да је, заиста, серум потиснуо ову вероватну адсорпцију ПБТ434 на површини ћелије (С2 слика).

3. ПБТ434, за разлику од бипиридила, не ограничава интрацелуларну доступност лабилног гвожђа

Пошто ПБТ434 има умеренији афинитет за гвожђе у поређењу са класичним хелаторима гвожђа као што су деферипрон или бипиридил, испитали смо како се та разлика одражава на ефекат ПБТ434 на ћелијски лабилни пул гвожђа (ЛИП) хБМВЕЦ-а. Да бисмо то урадили, искористили смо пропусни, Фе^{2 плус}-специфична флуоресцентна боја ФерроОранге, која реагује са добротворним цитоплазматским гвожђем. Видели смо значајну аблацију флуоресценције у ћелијама када су третиране бипиридилом, што је у складу са хелацијом ЛИП-а овим хелатором гвожђа високог афинитета и на тај начин блокира деловање флуоресцентног индикатора гвожђа (слика 5А). Насупрот томе, ПБТ434 се није такмичио са ФерроОранге-ом за Фе^{2 плус}, понашање у складу са његовим умеренијим афинитетом [30]. Резултати су показали да је ПБТ434, али не и ПБТ434-састао са неактивним дериватом, изазвао повећање Фе доступног ФероОранге-у од 34 ± 9 процената^{2 плус}што сугерише да је овај хелатни агенс мобилисао гвожђе унутар ћелије без истовремене токсичности. Подаци представљени у наставку сугеришу да је ово гвожђе дошло из феритина.

Раније је показано да ПБТ434 обнавља експресију осиромашеног протеина феропортина код мишева третираних МПТП до нивоа сличног оном код мишева без лезија [30]. Овај резултат, заједно са повећањем интрацелуларног обојења гвожђем као одговор на ПБТ434, сугерише потенцијални ефекат на ћелијски систем одговора на гвожђе и функцију низводних протеина повезаних са гвожђем. Да бисмо ово проценили, прво смо спровели квантитативну ПЦР (кПЦР) анализу ефекта ПБТ434 на обиље транскрипата за неколико протеина који рукују гвожђем (слика 6). Док су транскрипти за протеин ефлукса гвожђа, феропортин (Фпн) и два цитоплазматска шаперона гвожђа, ПЦБП1 и 2 били непромењени, обиље мРНК за рецептор трансферина (ТфР) и фероксидазе, церулоплазмина (Цп), није утицало на променити. ТфР и Цп транскрипти су повећани за 2,8 и 3.{13}} пута, респективно. Експресија трансферинског рецептора (ТфР) је повезана са системом елемента који реагује на гвожђе (ИРЕ)/регулаторни протеин гвожђа (ИРП) [42–44]. Повећање ТфР мРНА сугерише да се ПБТ434 такмичи са ПЦБП1-зависном испоруком гвожђа за склапање Фе, С кластера који претвара регулаторни ИРЕБП из протеина који везује РНК у цитосолну аконитазу [45]. Дакле, ПБТ434 помера ову регулаторну модулацију ка везивању РНК и одговарајућој инхибицији деградације ТфР мРНА. Код ћелијског недостатка гвожђа, експресија Цп је делимично регулисана ХИФ-1 [46]. Повећање функције ХИФ-1 произилази из укидања његове хидроксилације активношћу пролил хидроксилазе у реакцији која зависи од гвожђа [47]. Као иу случају ИРЕБП, чини се да ПБТ434 смањује количину гвожђа које служи као кофактор у ХИФ-1 хидроксилацији и деградацији. У овом моделу, повећање стабилног нивоа овог активатора транскрипције повећава Цп транскрипцију.

Користећи комбинацију ЕЛИСА анализе и Вестерн блотинга, испитали смо експресију протеина који рукују гвожђем у ПБТ434 или ПБТ434-мет третираном хБМВЕЦ; примери ВБ анализа дати су на слици 7А. Подаци су показали да је обиље ТфР мономера и димера значајно повећано за 24 сата као и Цп (слике 7Б и 7Ц). Оба повећања су била паралелна са ПБТ434-зависним повећањем у одговарајућим транскриптима (слика 6), насупрот томе, експресија протеина ефлукса гвожђа, Фпн, била је неосетљива на третман ПБТ434 (слика 7Д).

Користили смо ЕЛИСА као додатни метод за квантификацију промена набора на које указују вестерн блот подаци. Дакле, хБМВЕЦ је третиран са ПБТ434 током 24 сата, а ћелијски лизати су анализирани ЕЛИСА тестом за ТфР (слика 8А). Преструко повећање ТфР-а као одговор на третман ПБТ434 квантификовано помоћу ЕЛИСА-е било је еквивалентно оном добијеном анализом вестерн блотова (слика 7Б). ЕЛИСА је такође коришћена за процену количине излученог и ГПИ-везаног Цп протеина, користећи ХепГ2 ћелије као позитивну контролу. Што се тиче Цп излученог у медијуму за раст, овај приступ је био ограничен по томе што је обиље сЦп-а и у ХепГ2 и у хБМВЕЦ кондиционираном медијуму било на или испод доње границе осетљивости овог теста (С3 слика). Међутим, то је омогућило процену обиља ГПИ-Цп. У овој методи, ћелије су третиране фосфатидилинозитол специфичном фосфолипазом Ц (ПИ-ПЛЦ), која цепа ГПИ сидро; тако кондиционирани медијум је концентрован и анализиран помоћу Цп-ЕЛИСА. Иако је овај приступ показао да је ПБТ434 повећао количину ГПИ-Цп у ХепГ2 ћелијама, поново није успео да открије било који Цп који је ослободио ПИ-ПЛЦ (слика 8Б). ЕЛИСА је такође омогућила директну методу за квантификацију феритина. Да би се то урадило, хБМВЕЦ је напуњен са 1 уМ Фе-цитратом током 24 сата, након чега је уследио третман у одсуству или присуству ПБТ434 током додатних 1 х. Добијени ћелијски лизати су подвргнути ЕЛИСА анализи на феритин (слика 8Ц). За разлику од повећања ТфР, третман са ПБТ434 је срушио протеин феритина (Фт) за ~18 процената. Заиста, овај губитак Фт протеина је био очигледан након само 1 сата третмана са реагенсом. Временска природа овог резултата може бити повезана са повећањем добротворног Фе2 плус који је горе наведен након 30-минутног третмана са ПБТ434. Као што је касније дискутовано, нокдаун феритина је показано након третмана са другим ћелијским пермеантним Фе2 плус хелатним агенсима [48].

4. ⁵⁵Фе^{2 плус}апсорпција је инхибирана комплексирањем са ПБТ434

С обзиром на брзу еквилибрацију ПБТ434 у хБМВЕЦ у року од 30 минута, у поређењу са спорим, двофазним уносом и равнотежом Фе2 плус током 24 сата [49], претпоставили смо да ПБТ434 и Фе2 плус немају исти механизам узимања. Да би се ово тестирало, монослојеви су инкубирани са радиоактивно обележеним 55Фе2 плус у одсуству или присуству ПБТ434 или ПБТ434-мет, и праћено је унос 55Фе2 плус током 3 х (слика 9А). ПБТ434 је значајно смањио брзину узимања 55Фе2 плус, као и смањио укупну акумулацију 55Фе2 плус у ћелијским лизатима (слика 9Ц). Овај ефекат није примећен са ПБТ434-метом. Поређење стопа преузимања ПБТ434 са 55Фе показује да се ПБТ434 и Фе2 плус преузимају одвојеним транспортним путевима. Штавише, инхибиција узимања 55Фе у присуству ПБТ434 али не и ПБТ434-мет сугерише да екстрацелуларни ПБТ434-комплекс гвожђа није лиганд за транспортере обојеног гвожђа у хБМВЕЦ, односно ЗИП8, и ЗИП14.

Цистанцхе суплементи

Да бисмо даље испитали улогу ПБТ434 у акумулацији гвожђа, тестирали смо ефекат његовог претходног излагања на унос 55Фе2 плус. Ћелије претходно третиране са ПБТ434 које су, након прања, биле изложене 55Фе2 плус, показале су повећање брзине узимања и акумулације 55Фе2 плус након 3 сата (слика 9, панели Б и Д). Ова повећана акумулација се одржавала најмање 24 сата. Ови подаци сугеришу да претходно излагање ћелија ПБТ434 привремено појачава унос гвожђа. Неочекивано, предтретман са ПБТ434- је такође показао повећање и узимања и акумулације (слика 9Б), али овај ефекат није био толико значајан или постојан као онај који показује ПБТ434.

Показали смо да је узимање гвожђа из 59Фе-трансферина подржано редукцијом фери и феро-пермеацијом на плазма мембрани има [50, 51]. Један експериментални исход који подржава овај ТБИ модел преузимања гвожђа био је укидање овог уноса инхибицијом активности екстра-цитоплазматске фериредуктазе; други резултат је био 60-постотна инхибиција ТБИ апсорпције гвожђа ферозином, јаким хелатним агенсом за обојено гвожђе [50]. Ова последња стратегија је коришћена да се покаже да ПБТ434, али не и ПБТ{10}}, такође инхибира унос гвожђа ТБИ (Слика 10).

5. ПБТ434 стимулише Фпн зависан 55Фе2 плус ефлукс

ПБТ434 има приближно 20 процената способности деферипрона да произведе привидну стимулацију Фе2 плус ефлукс из неуронских ћелија [30]. Процењивали смо ефлукс 55Фе2 плус из хБМВЕЦ у одсуству или присуству ПБТ434 у контролним ћелијама или ћелијама третираним мини-хепцидином, ПР73. Хепцидин је пептидни хормон који се налази и системски и у интерстицијуму мозга који се везује за Фпн и циља на транспортер за деградацију. Ефекти хепцидина на функцију извоза гвожђа Фпн су опширно проучавани [52–54]. Раније смо показали да је ефлукс Фе2 плус из хБМВЕЦ зависан од Фпн [35, 49]. ПР73 има ЕЦ50 од ~4 нМ за деградацију Фпн у ГФП репортер тесту [55]. хБМВЕЦ у монослојевима је напуњен са 55Фе2 плус током 24 сата у одсуству или присуству ПР73. 55Фе-ефлукс је затим квантификован током периода од 5 сати у сталном одсуству или присуству ПР73 у комбинацији са одсуством и присуством ПБТ434 (слика 11). Док је ПР73 срушио ефлукс 55Фе из контролне и ПБТ{31}}третиране културе, ПБТ434 је делимично потиснуо инхибицију услед мини-хепцидина. У одсуству ПБТ434, ефлукс гвожђа из култура третираних ПР73-смањен је за ~75 процената, док је нокдаун у културама третираним ПБТ{37}} био само ~50 процената (слика 11 и табела 2). Из ових резултата могу се извући два закључка. Прво, нокдаун Фпн од стране ПР73 регулише ефлукс 55Фе у присуству као иу одсуству ПБТ434. Друго, под било којим условима, ПБТ434 подржава значајну, иако малу стимулацију ефлукса гвожђа.

Референце

1. Хатцхер ХЦ, Сингх РН, Торти ФМ, Торти СВ. Синтетички и природни хелатори гвожђа: терапеутски потенцијал и клиничка употреба. Футуре Мед Цхем. 2009; 1(9):1643–70.

2 . Нуњез МТ, Цхана-Цуевас П. Нове перспективе у терапији хелатацијом гвожђа за лечење неуродегенеративних болести. Фармацеутика (Базел). 2018; 11(4):109.

3. Тосато М, Ди Марцо В. Метална хелациона терапија и Паркинсонова болест: Критички преглед термодинамике формирања комплекса између релевантних металних јона и обећавајућих или етаблираних лекова. Биомолекули. 2019; 9(7).

4. Хедера П. Ажурирање клиничког управљања Вилсоновом болешћу. Аппл Цлин Генет. 2017; 10:9–19.

5. Ксиа С, Зханг В, Хуанг Л, Јианг Х. Компаративна ефикасност и безбедност дефероксамина, деферипрона и деферасирокса код тешке таласемије: мета-анализа 16 рандомизованих контролисаних студија. ПЛоС Оне. 2013; 8(12):е82662.

6. Буеттнер ГР, Јуркиевицз БА. Каталитички метали, аскорбат и слободни радикали: комбинације које треба избегавати. Радиат Рес. 1996; 145(5):532–41. ПМИД: 8619018

7. Сингх А, Кукрети Р, Сасо Л, Кукрети С. Оксидативни стрес: кључни модулатор у неуродегенеративним болестима. Молецулес. 2019; 24(8).

8. Асхраф А, Цларк М, Со ПВ. Старење гвозденог човека. Неуросци предњег старења. 2018; 10:65.

9. Гхадери Ц, Пирпамер Л, Хофер Е, Лангкаммер Ц, Петровић К, Лоитфелдер М, ет ал. Р2* мапирање за гвожђе у мозгу: асоцијације на когницију у нормалном старењу. Неуробиол Агинг. 2015; 36(2):925–32.

10. Зецца Л, Иоудим МБХ, Риедерер П, Цоннор ЈР, Црицхтон РР. Гвожђе, старење мозга и неуродегенеративни поремећаји. Нат Рев Неуросци. 2004; 5(11):863–73.

11. Ди Мео И, Тиранти В. Класификација и молекуларна патогенеза НБИА синдрома. Еур Ј Паедиатр Неурол. 2018; 22(2):272–84.

12. Леви С, Финаззи Д. Неуродегенерација са акумулацијом гвожђа у мозгу: ажурирање патогених механизама. Фронт Пхармацол. 2014; 5:99–.

13. Леви С, Тиранти В. Неуродегенерација са поремећајима акумулације гвожђа у мозгу: вредни модели усмерени на разумевање патогенезе депозиције гвожђа. Фармацеутика (Базел). 2019; 12(1).

14. Меиер Е, Куриан МА, Хаифлицк СЈ. Неуродегенерација са акумулацијом гвожђа у мозгу: генетски диверзитет и патофизиолошки механизми. Анну Рев Геномицс Хум Генет. 2015; 16:257–79.

15. Тонекабони СХ, Молламохаммади М. Неуродегенерација са акумулацијом гвожђа у мозгу: преглед. Иран Ј Цхилд Неурол. 2014; 8(4):1–8. ПМИД: 25657764

16. Цоззи А, Ореллана ДИ, Сантамброгио П, Рубио А, Цанцеллиери Ц, Гианнелли С, ет ал. Моделирање неуроферитинопатије матичним ћелијама открива гвожђе као детерминанту старења и фероптозе током старења неурона. Извештаји о матичним ћелијама. 2019; 13(5):832–46.

17. Лиу ЈЛ, Фан ИГ, Ианг ЗС, Ванг ЗИ, Гуо Ц. Гвожђе и Алцхајмерова болест: од патогенезе до терапијских импликација. Фронт Неуросци. 2018; 12:632.

18. Ллоренс ЈВ, Сориано С, Цалап-Куинтана П, Гонзалез-Цабо П, Молто МД. Улога гвожђа у Фридриховој атаксији: увиди из студија о људским ткивима и ћелијским и животињским моделима. Фронт Неуросци. 2019; 13:75.

19. Пусцхманн А. Нови гени који узрокују наследну Паркинсонову болест или Паркинсонизам. Цурр Неурол Неуросци Реп. 2017; 17(9):66.

20. Цриелаард БЈ, Ламмерс Т, Ривелла С. Циљање метаболизма гвожђа у откривању и испоруци лекова. Нат Рев Друг Дисцов. 2017; 16(6):400–23.

21. Гуралник ЈМ, Еисенстаедт РС, Ферруцци Л, Клеин ХГ, Воодман РЦ. Преваленција анемије код особа старијих од 65 година у Сједињеним Државама: доказ о високој стопи необјашњиве анемије. Крв. 2004; 104 (8): 2263–8.

22. Пепе А, Мелони А, Цапра М, Цианциулли П, Проссомарити Л, Малавентура Ц, ет ал. Третман деферасироксом, деферипроном и десфериоксамином код пацијената са великом таласемијом: поређење срчаног гвожђа и функције утврђено квантитативном магнетном резонанцом. Хаематологица. 2011; 96(1):41–7.

23. Пандолфо М, Арпа Ј, Делатицки МБ, Ле Куан Санг КХ, Мариотти Ц, Муницх А, ет ал. Деферипрон код Фриедреицхове атаксије: 6-месечно рандомизовано контролисано испитивање. Анн Неурол. 2014; 76(4):509–21.

24. Мартин-Бастида А, Вард РЈ, Невбоулд Р, Пиццини П, Схарп Д, Кабба Ц, ет ал. Хелација гвожђа у мозгу деферипроном у фази 2 рандомизираног двоструко слепог плацебом контролисаног клиничког испитивања у Паркинсоновој болести. Сци Реп. 2017; 7(1):1398.

25. Девос Д, Мореау Ц, Деведјиан ЈЦ, Клуза Ј, Петраулт М, Лалоук Ц, ет ал. Циљање хелатног гвожђа као терапеутског модалитета код Паркинсонове болести. Антиоксид Редок сигнал. 2014; 21(2):195–210. хттпс://дои. орг/10.1089/арс.2013.5593 ПМИД: 24251381

26. Сингх С, Епемолу РО, Доббин ПС, Тилброок ГС, Еллис БЛ, Дамани ЛА, ет ал. Метаболички профили у урину код људи и пацова 1,2-диметил- и 1,2-диетил-супституисаних 3-хидрокси пиридин-4-она. Метаболизам и диспозиција лекова. 1992; 20(2):256. ПМИД: 1352218

27. Кходавердиан В, Тападар С, МацДоналд ИА, Ксу И, Хо ПИ, Бридгес А, ет ал. Деферипрон: Пан-селективна хистонска лизин деметилаза инхибициона активност и студија односа активности. Сци Реп. 2019; 9(1):4802.

28. Хидер Р. Недавни развој усредсређен на орално активне хелаторе гвожђа. Тхалассемиа Репортс. 2014; 4 (2).

29. Косман ДЈ. Метаболизам гвожђа у аеробима: управљање хидролизом фери гвожђа и аутооксидацијом гвожђа. Цоорд Цхем Рев. 2013; 257(1):210–7.

30. Финкелстеин ДИ, Биллингс ЈЛ, Адлард ПА, Аитон С, Седјахтера А, Мастерс ЦЛ, ет ал. Ново једињење ПБТ434 спречава неуродегенерацију посредовану гвожђем и токсичност алфа-синуклеина у више модела Паркинсонове болести. Ацта Неуропатхол Цоммун. 2017; 5(1):53.

31. Херас-Гарвин А, Рефоло В, Сцхмидт Ц, Брадбури М, Стамлер Д, Стефанова Н, уредници. ПБТ434 чува допаминергичке неуроне, смањује олигомеризацију алфа-синуклеина и побољшава моторну функцију у моделу трансгене атрофије вишеструких система мишева. Анналс оф Неурологи; 2020: Вилеи 111 Ривер Ст, Хобокен 07030–5774, Њ САД.

32. Херас-Гарвин А, Стефанова Н. МСА: Од основних механизама до експерименталне терапије. Паркинсонизам повезан с поремећајем. 2020; 73:94–104.

33. Давсон ВЛ, Давсон ТМ. Обећавајуће терапије за Паркинсонову болест које модификују болест. Сциенце Транслатионал Медицине. 2019; 11(520):еаба1659.

34. Еигенманн ДЕ, Ксуе Г, Ким КС, Мосес АВ, Хамбургер М, Оуфир М. Компаративна студија четири бесмртне капиларне ендотелне ћелије мозга човека, хЦМЕЦ/Д3, хБМЕЦ, ТИ10 и ББ19, и оптимизација услова културе, за ин витро модел крвно-мождане баријере за студије пропусности лекова. Течности и баријере ЦНС-а. 2013; 10(1):33.

35. МцЦартхи РЦ, Косман ДЈ. Церулоплазмин и хепцидин глија ћелија различито регулишу ефлукс гвожђа из микроваскуларних ендотелних ћелија мозга. ПЛоС Оне. 2014; 9(2):е89003.

36. Стеимле БЛ, Смитх ФМ, Косман ДЈ. Носачи раствора ЗИП8 и ЗИП14 регулишу акумулацију мангана у микроваскуларним ендотелним ћелијама мозга и контролишу нивое мангана у мозгу. Ј Биол Цхем. 2019; 294(50):19197–208.

37. Стинс МФ, Бадгер Ј, Сик Ким К. Бактеријска инвазија и трансцитоза у трансфицираним микроваскуларним ендотелним ћелијама људског мозга. Мицроб Патог. 2001; 30(1):19–28.

38. Стамлер Д, Брадбури М, Вонг Ц, Оффман Е. Прво у људском проучавању ПБТ434, новог инхибитора малих молекула агрегације -синуклеина (С4.001). Неурологи. 2019; 92(15 додатак):С4.001.

39. Стамлер Д, Брадбури М, Вонг Ц, Оффман Е. Студија фазе 1 ПБТ434, новог инхибитора агрегације -синуклеина малих молекула, код одраслих и старијих одраслих добровољаца (4871). Неурологи. 2020; 94(15 додатак):4871.

40. МцЦартхи РЦ, Косман ДЈ. Активација експресије церулоплазмина ћелија Ц6 глиобластома од стране суседних интерлеукина добијених из ендотелије људског мозга у систему модела крвно-мождане баријере ин витро. Ћелијска комуникација и сигнализација: ЦЦС. 2014; 12:65.

41. МцЦартхи РЦ, Парк ИХ, Косман ДЈ. сАПП модулира ефлукс гвожђа из микроваскуларних ендотелних ћелија мозга стабилизујући феропортин који извози гвожђе. ЕМБО Репортс. 2014; 15(7):809–15. хттпс://дои. орг/10.15252/ембр.201338064 ПМИД: 24867889

42. Хентзе МВ, Муцкентхалер МУ, Гали Б, Цамасцхела Ц. Тво то Танго: Регулатион оф Маммалиан Ирон Метаболисм. Ћелија. 2010; 142(1):24–38. хттпс://дои.орг/10.1016/ј.целл.2010.06.028 ПМИД: 20603012

43. Зхоу ЗД, Тан ЕК. Сигнални пут регулаторног протеина гвожђа (ИРП)-елемента који реагује на гвожђе (ИРЕ) у људским неуродегенеративним болестима. Молекуларна неуродегенерација. 2017; 12(1):75. хттпс://дои.орг/10. 1186/с13024-017-0218-4 ПМИД: 29061112

44. Црицхтон РР, Дектер ДТ, Вард РЈ. Метаболизам гвожђа у мозгу и његова пертурбација код неуролошких болести. Ј Неурал Трансм. 2011; 118(3):301–14. хттпс://дои.орг/10.1007/с00702-010-0470-з ПМИД: 20809066

45. Пател СЈ, Фреи АГ, Паленцхар ДЈ, Ацхар С, Буллоугх КЗ, Васхисхт А, ет ал. ПЦБП1-БолА2 шаперонски комплекс испоручује гвожђе за склоп цитосолног [2Фе-2С] кластера. Нат Цхем Биол. 2019; 15(9):872–81. хттпс://дои.орг/10.1038/с41589-019-0330-6 ПМИД: 31406370

46. ​​Мукхопадхиаи ЦК, Мазумдер Б, Фок ПЛ. Улога фактора који изазива хипоксију-1 у транскрипционој активацији церулоплазмина услед недостатка гвожђа. Ј Биол Цхем. 2000; 275(28):21048–54.

47. Стровитзки МЈ, Цумминс ЕП, Таилор ЦТ. Хидроксилација протеина хидроксилазама изазваним хипоксијом (ХИФ): јединствена или свеприсутна? Ћелије. 2019; 8(5).

48. Де Доменицо И, Ваугхн МБ, Ли Л, Баглеи Д, Мусци Г, Вард ДМ, ет ал. Феропортином посредована мобилизација феритинског гвожђа претходи деградацији феритина од стране протеазома. Ембо ј. 2006; 25(22):5396–404.

49. МцЦартхи РЦ, Косман ДЈ. Феропортин и активност егзоцитоплазматске фероксидазе су неопходне за ефлукс гвожђа из микроваскуларних ендотелних ћелија мозга. Тхе Јоурнал оф Биологицал Цхемистри. 2013; 288(24):17932–40.

50. МцЦартхи РЦ, Косман ДЈ. Механистичка анализа акумулације гвожђа у ендотелним ћелијама БББ. Биометали. 2012; 25(4):665–75.

51. Косман ДЈ. Телос метало-редукције и метало-оксидације у еукариотској трговини гвожђем и бакром. Металомицс. 2018; 10(3):370–7. хттпс://дои.орг/10.1039/ц8мт00015х ПМИД: 29484341

52. Асцхемеиер С, Киао Б, Стефанова Д, Валоре ЕВ, Сек АЦ, Руве ТА, ет ал. Анализа структуре и функције феропортина дефинише место везивања и алтернативни механизам деловања хепцидина. Крв. 2018; 131(8):899–910.

53. Ганз Т, Неметх Е. Хепцидин и хомеостаза гвожђа. Биоцхим Биопхис Ацта. 2012; 1823(9):1434–43.

54. Киао Б, Сугианто П, Фунг Е, Дел-Цастилло-Руеда А, Моран-Јименез МЈ, Ганз Т, ет ал. Ендоцитоза феропортина изазвана хепцидином зависи од убиквитинације феропортина. Целл Метаб. 2012; 15(6):918–24.

55. Фунг Е, Цхуа К, Ганз Т, Неметх Е, Руцхала П. Тиол-дериватизовани минихепцидини задржавају биолошку активност. Биоорг Мед Цхем Летт. 2015; 25(4):763–6.

Даниелле К. БаилеиИД, Вхитнеи Цларк, Даниел Ј. Косман

Одсек за биохемију, Јацобс Сцхоол оф Медицине и Биомедицинских наука, Државни универзитет Њујорка у Буффалу, Буффало, НИ, Сједињене Америчке Државе