Део 2: Молекул повреде бубрега-1 је потенцијални рецептор за САРС-ЦоВ-2

За више информација. контактtina.xiang@wecistanche.com

Клиничке манифестације коронавируса

1. Период инкубације је дуг, а главни симптоми су температура, умор, бол у грлу и кашаљ. Грозница може бити висока, умерена или ниска температура;

2. Одојчад и старије особе нису типичне и често су праћене пискањем и диспнејом. У тешким случајевима може доћи до оштећења више система;

3. Суви кашаљ у раној фази је углавном пароксизмалан и јак, сличан великом кашљу, који утиче на сан и активности; у каснијој фази, кашаљ је испљувак, испљувак је опак, повремено садржи малу количину крви, а неки су праћени звиждањем;

4. Неки пацијенти имају благе симптоме и можда немају температуру. Већина пацијената има добру прогнозу, а мали број пацијената је критично болестан или чак умире;

5. Акутни респираторни дистрес синдром, септички шок, рефракторна метаболичка ацидоза и коагулациона дисфункција.

Како спречити нови корона вирус, побољшање сопственог имунитета је најефикасније средство за борбу против вируса. Цистанцхе, који се од давнина користио као хранљиво благо, познат је као "пустињагинсенг" и краљ је јачања имунитета. Цистанцхе - Краљ јачања имунитета

Савремена медицинска истраживања су доказала да поред функције исхране и јачања организма, Цистанцхе има значајна лековита дејства у превенцији тумора, против старења, против аритмије, инхибицији апоптозе и побољшању имунитета. наклоност.

Тхеукупни глукозиди Цистанцхеасу активне компоненте гинсенга за регулисање имунолошке функције, што може побољшати имунолошку функцију не само за нормалне људе већ и за људе са ниском имунолошком функцијом.

Клиничка опсервација је потврдила да Цистанцхе има одређено лековито дејство на малигне туморе, и да има очигледан ефекат повећања леукоцита. Узимање гинсенга током радиотерапије и хемотерапије може смањити токсичне и нежељене ефекте радиотерапије и хемотерапије, убрзати поправку оштећеног ткива и спречити леукопенију;

Дискусија

За борбу противЦОВИД-19 пандемија, дубоко разумевање какоСАРС-ЦоВ-2инвазију на људске ћелије је оправдано. Студије су показале директну инфекцију САРС-ЦоВ-2 убубрегапоред плућа (Браун ет ал., 2020; Фаркасх ет ал., 2020). Међутим, АЦЕ2 остаје једини добро препознат рецептор који може посредовати у овој инвазији. Штавише, бубрежни тропизам САРС-ЦоВ-2 и повезаниповреда бубрегаизгледа необјашњиво због релативно смањеног нивоа АЦЕ2 након вирусне инвазије (Куба ет ал., 2005). Овде наша студија сугерише да КИМ1, драстично повећан биомаркер за повреду бубрега (Ианг ет ал., 2015), посредује у САРС-ЦоВ-2 инвазији бубрега као рецептор.

Такође смо открили да се САРС-ЦоВ-2-РБД везује за КИМ1 са већим афинитетом од САРС-ЦоВ-РБД и МЕРС-ЦОВ-РБД, што вероватно лежи у основи јаче заразе САРС-ЦоВ-2 (Рабаан ет ал, 2020); стога, бубрежна инфекција и улоге КИМ1 у овим тешким респираторним болестима вреди поново размотрити. Посебно, наши резултати сугеришу различита места везивања КИМ1 и АЦЕ2 на вирусном РБД, па је вредно истражити да ли и како КИМ1 и АЦЕ2 посредују у инвазији САРС-ЦоВ-2 у овим органима. Поред тога, пошто се КИМ1 ендоцитозира путем путева зависних од клатрина (Зхао ет ал., 2016), такође би било интересантно даље истражити КИМ{21}}зависни процес након везивања вируса за ћелијску мембрану.

АЦЕ2 је најбоље проучаван рецептор за САРС-ЦоВ-2, али није идеална терапијска мета за ЦОВИД-19, пошто је широко изражен у више органа и игра кључну улогу у регулисању крвног притиска и спречавање повреде срца/бубрега (Имаи ет ал., 2005; Ли ет ал., 2020д). Насупрот томе, КИМ1 има јачу повезаност са функцијом бубрега и високо је изражен тек наконповреда бубрега(Кондратовицз ет ал, 2011; Иуан ет ал, 2015; Цостафреда и Каплан, 2018), што га чини специфичнијим, а можда и безбеднијим терапијским циљем за ЦОВИД{3}} пацијенте са болестима бубрега.

Укратко, наши подаци указују на кључну улогу КИМ1 у САРС-ЦоВ-2 бубрежном тропизму као потенцијалном рецептору за САРС-ЦоВ-2. Овде предлажемо модел „зачараног круга“ посредованог КИМ1 и АЦЕ2 (слика 5Г), који може да објасни бубрежни тропизам САРС-ЦоВ-2 код пацијената са ЦОВИД-19. Током почетне фазе инвазије САРС-ЦоВ-2, виши физиолошки ниво (додатна слика С1) и афинитет везивања (додатна табела С1) чине АЦЕ2 примарним циљем, који није специфичан за бубреге. Међутим, након појаве АКл изазваног вирусом, резултујући драстично повећан КИМ1 брзо промовише секундарну вирусну инфекцију посредовану КИМ1 и АЦЕ2, која је више специфична за бубреге, и последично погоршава оштећење бубрега у зачараном кругу (Слика 5Г). Приступи који могу да прекину интеракцију између САРС-ЦоВ-2 и КИМ1, укључујући анти-КИМ1 антитела, инхибиторе малих молекула и антагонистичке пептиде изведене из КИМ{29}}, могу да расветле ЦОВИД-19 третман.

материјали и методе

Материјали

Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 процената) је хемијски синтетизовао Генсцрипт. Анти-лгГ антитело миша (п/н 18-8816-33) и анти-лгГ антитело зеца (п/н 18-8817-33) добијено је од Роцкланда. ИгГ витх СуреБеадс" Протеин Г магнетне перле (Ј2112ЛБ-02) су купљене од Био-Рад. ДАПИ (Д9542) је био од Сигма. Алек Флоур 594 ​​означен фалоидин (Ц2205С) је био из Беиотимеса. Антитела против КИМ1 (НБП{ 15}}, Новус Биологицалс), Флаг (Ф1804, Сигма), ХА (Х6908, Сигма) и АЦЕ2 (2115-1-АП, Протеинтецх).

Аквизиција и анализа профила експресије КИМ1 и АЦЕ2

Да бисмо добили свеобухватне профиле транскриптома и протеина КИМ1 и АЦЕ2 за људска ткива, прикупили смо и анализирали податке о транскриптомима и протеинске профиле засноване на имунохистохемији из Атласа хуманих протеина (ХПА, хттпс://ввв.протеинатлас.орг), који су показали експресија и локализација хуманих протеина у ткивима и органима, на основу дубоког секвенцирања РНК (РНА-сек) из 37 нормалних ткива и имунохистохемије на микромрежима ткива који садрже 44 типа ткива (Ухлен ет ал., 2015). ХПА РНА-сек ткиво гена за кодирање протеина је забележено као средњи транскрипти који кодирају протеине на милион (пТПМ), што одговара средњим вредностима узорака из сваког ткива. Нивои експресије протеина засновани на хистологији анализирани су ручно у четири нивоа (није откривен, низак, средњи и висок). На додатној слици С1, 10 најбољих нивоа транскрипције ткива и нивои експресије протеина КИМ1 и АЦЕ2 засновани на хистологији су наведени, респективно, а резимиран је профил преклапања експресије КИМ1 и АЦЕ2.

Молекуларно спајање и симулације динамике

Пристајање је обављено преко З-Доцк-а (хттп://здоцк. умассмед.еду/). Кристалне структуре САРС-ЦоВ-РБД (ПБД ИД 2АЈФ), САРС-ЦоВ-2-РБД (ПДБ ИД 6МОЈ), МЕРС-ЦОВ-РБД (ПДБ ИД 4Л3Н), АЦЕ2(ПДБ ИД 1Р42) и КИМ1 Иг В домен (ПДБ ИД 5ДЗО) коришћен је за тражење потенцијалних модела везивања. Најбоље оцењени протеински комплекси су одабрани за следеће симулације молекуларне динамике, које је спровео Десмонд сервер и анализирали Пимол2.3 и Маестро11.8.012. Дијаграм симулације динамике од 50 нс примењен је за проучавање динамичких параметара протеинских комплекса . Слободну енергију везивања ММ-ГБСА израчунао је ХавкДоцк (Мисини лгњатовић ет ал., 2016).

Средње квадратна девијација (РМСД) и средње квадратна флуктуација (РМСФ)

РМСД је коришћен за процену просечне промене у померању одабраних атома за одређени оквир као што је описано (Ли ет ал., 2011). РМСФ је спроведен да би се проучавале промене померања у ланцу протеина (Ли ет ал., 2011) .

АКИ модели миша и кПЦР

И/Р повреда је извршена на мишевима Ц57БЛ/6 као што смо претходно описали (Цхен ет ал, 2015, 2017). За АКИ изазван цисплатином, 30 мг/кг телесне тежине цисплатина је интраперитонеално убризгано 8-недељним мужјацима мишева, а мишеви су жртвовани 3 дана касније. Узорци крви и бубрега су прикупљени за даљу анализу, са н=4 за сваку експерименталну групу животиња. Укупна РНК је изолована из бубрега помоћу РНАисо Плус (ТаКаРа) и реверзно транскрибована у цДНК коришћењем М-МЛВ система синтезе првог ланца (Инвитроген). Обиље специфичних генских транскрипата је процењено кПЦР. Дати су прајмери ​​коришћени у студији (додатна табела С4).

Конструкције

Експресиони плазмиди сисара за хумани КИМ1, КИМ1 Иг В (КИМ1 остаци аа 20-127), КИМ1 △лг В (скраћени КИМ1 без остатака аа 20-127), КИМ1-ЦФП, КИМ1 лг В-ЦФП, АЦЕ2, САРС-ЦоВ-2-РБД(САРС-ЦоВ-2-С остаци аа 319-541), САРС-ЦоВ-2-С, САРС-ЦоВ{{20 }}РБД-ИФП и ТИМ4-ИФП су конструисани. Производи ПЦР амплификације одговарајућих цДНК фрагмената су клонирани у вектор заснован на пРК промотеру који садржи или ХА или ФЛАГ ознаку. Плазмиди повезани са САРС-ЦоВ-2- били су љубазни поклони др ПХВанг са Универзитета Шандонг.

Ћелијска култура и трансфекција

Тубуларна ћелијска линија ХК-2 људског бубрега (добијена од Кинеског центра за колекцију типских култура) је култивисана у медијуму ДМЕМ/Ф12 (Хицлоне) који садржи 17,5 мМ глукозе и 10 процената феталног говеђег серума. Да би се проценио утицај САРС-ЦоВ-2 на ћелије, ћелије ХК-2 су трансфектоване САРС-ЦоВ-2-С и САРС-ЦоВ-2-РБД плазмидима, а затим сакупљене за даље откривање.

Цо-ИП

Означене ћелије ХК-2/ХЕК293Т (1×10) су лизиране у 1 мл пуфера пре лизе (25 мМ Трис-ХЦл, пХ7,4, 150 мМ НаЦл, 1 проценат НП-40, 1 мМ ЕДТА, 5 проценат глицерола), који је формулисан за пуллдовн и ИП тестове и као пуфер за прање перли. За ИП, ћелијски лизат је имунопреципитиран са назначеним антителом или одговарајућим гГ магнетним перлицама СуреБеадсТМ Протеин Г преко ноћи на 4Ц. Након испирања пуфером за пре-лизу који садржи 500 мМ НаЦл, куглице су куване у пуферу за пуњење и подвргнуте имуноблотингу (Ван ет ал., 2017).

ФРЕТ тест

Интраћелијска интеракција између КИМ1 и САРС-ЦоВ-2-РБД је откривена стандардним тестом заснованим на ФРЕТ (Карпова и МцНалли, 2006) коришћењем КИМ1-ЦФП и САРС-ЦоВ-2-РБД-ИФП . Укратко, експресиони плазмиди сисара који експримирају КИМ1-ЦФП или КИМ1 Алг В-ЦФП су котрансфектовани са САРС-ЦоВ-2-РБД-ИФП у-293Т ћелије. За детекцију засновану на флуоресцентном спектрофотометру, ћелије су сакупљене и лизиране 24 сата након трансфекције, а лизат је детектован Ф-2700 флуоресцентним спектрофотометром (Хитацхи) преко скенирања таласне дужине (500-600нм) и временског скенирања (435). /527 нм, ексцитација/емисија). За конфокалну детекцију, ћелије су снимљене Леица ТЦС СП8 конфокалним микроскопом под објективом велике снаге (40×) (ЦФП канал: 435/485 нм, ексцитација/емисија; ИФП канал :485/527нм, побуда/емисија; ФРЕТ канал:435/527 нм, побуда/емисија) (Ли ет ал,2020б). Котрансфекција некоњугованог ЦФП и ИФП је укључена као негативна контрола као што је описано (Карпова и МцНалли, 2006). Интеракција између КИМ1 и његовог лиганда ТИМ4 је откривена ФРЕТ тестом као позитивна контрола (Ронг ет ал, 2011).

ЦРИСПР-Цас{1}}нокаут КИМ1

Протоколи засновани на ЦРИСПР-Цас{1}}у за инжењеринг генома су коришћени како је описано (Зханг ет ал., 2017). Дате су водећи РНК циљне секвенце за КИМ1 (додатна табела С4).

ФИТЦ обележавање и конфокална микроскопија

ФИТЦ ознака је изведена као што смо претходно описали (Ли ет ал, 2020б; Зханг ет ал., 2020). Укратко, САРС-ЦоВ-2-РБД је инкубиран са ФИТЦ-ом (моларни однос 1:5) преко ноћи, а затим је додат 5 мМ НХЦл да се заустави реакција и угаси неизреаговани ФИТЦ. Раствор је дијализован два пута и лиофилизован за даљу употребу.

Ћелије ХЕК293Т (5×109) или ХК-2 ћелије (1×107) су инкубиране са слободним ФИТЦ или ФИТЦ-САРС-ЦоВ-2-РБД (100 уг/мл за 2). За анализе интернализације засноване на пептидима, АП1 или АП2 (50 μМ) су додани заједно са ФИТЦ-САРС-ЦоВ-2-РБД (100 уг/м). Након фиксирања са 4 процента (в/в) формалдехида, ћелијске мембране су обојене са Алек Флоур 594 ​​означеним фалоидином (2уг/мл), а језгра су обојена ДАПИ (1уг/м), а затим снимљена Леица ТЦС СП8 конфокални микроскоп. За сваку групу, најмање 100 ћелија из пет поља под објективом велике снаге (64×) је укључено у процену. Представљене су репрезентативне слике. Квантификацију слика је спровео ИмагеЈ1.8.0.

Тестови виталности ћелија

Ћелије су постављене на 3000-4000 ћелија по бунарчићу у 96-плочама са бунарима. На 80 процената конфлуенције, ћелије инкубиране са САРС-ЦоВ-2-РБД (100 уг/мл) су третиране са или без АП1 или АП2 (10,50,100 μМ). Након тога, сваком је додато 10 ул МТТ (5 мг/мл).

4 х, медијум је уклоњен и додат је ДМСО. Апсорпција мерена на 490 нм је нормализована на одговарајућу контролну групу.

Статистичка анализа

Подаци су изражени као средња вредност ± СД. Значајне разлике су процењене двостраним Студентовим тестом. Двострана П-вредност<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">