Фотоосетљиви наносклопови пролекова који садрже хемотерапеутску функцију мировања потенцира имунотерапију рака

Апстрактан

Имунотерапија у комбинацији са ефикасним терапијским средствима као што су хемотерапија и фотодинамичка терапија је успешна стратегија за активирање антитуморског имуног одговора за побољшање лечења против рака. Међутим, развој мултифункционалних биоразградивих, биокомпатибилних, нискотоксичних, али високо ефикасних и клинички доступних трансформисаних нано-имуностимуланса остаје изазов и велика је потражња. Овде извештавамо и дизајнирамо нови фото-хемотерапеутски нано-пролек ЦОС-БА/Це6 НП-а без носача комбиновањем три мултифункционалне компоненте само-састављене природне бетулинске киселине малих молекула (БА), олигосахарида хитозана растворљивог у води (ЦОС), и нискотоксични фотосензибилизатор хлорин е6 (Це6) за повећање антитуморске ефикасности имунолошког адјуванса анти-ПД-Л1-посредоване имунотерапије рака. Показали смо да дизајнирани нанолекови имају паметну и препознатљиву карактеристику „успавања“ у хемотерапијском ефекту са жељеном нижом цитотоксичношћу и вишеструким повољним терапијским карактеристикама, укључујући побољшану генерацију 1 О2 изазвану смањеним енергетским јазом Це6, пХ-респонзивношћу, добром биоразградљивошћу и биокомпатибилност, обезбеђујући високо ефикасну, синергистичку фотохемотерапију. Штавише, када се комбинују са анти-ПД-Л1 терапијом, и хемотерапија заснована на нано-састављању и хемотерапија/фотодинамичка терапија (ПДТ) могу ефикасно активирати антитуморски имунитет приликом лечења примарних или удаљених тумора, отварајући потенцијално атрактивне могућности за клиничку имунотерапију.

Предности цистанцхе тубулоса-Антитумор

КЉУЧНЕ РЕЧИ

имунотерапија рака; Нано-имуностимуланси; Хемотерапеутски мировање; Про-друг; Самостална монтажа; Природни мали молекул; Бетулинска киселина; Фотодинамичка терапија

1. Представљање

Имунотерапија против рака, као што је стратегија блокаде имунолошке контролне тачке која користи ПД-Л1 или ЦТЛА-4 за борбу против рака активирањем имунолошког система домаћина, несумњиво је револуционирала лечење рака1,2. Нажалост, слаб имунолошки одговор и неефикасни терапијски ефекти су у великој мери ограничили његове клиничке изгледе3,4. Недавно су актуелне студије откриле да комбинација имунотерапије са другим модалитетима као што су хемотерапија5, фотодинамичка терапија (ПДТ)6, фототермална терапија (ПТТ)7 и радиотерапија8, може ефикасно покренути антитуморску имуногеност индукујући ћелије рака да се подвргну имуногеној смрти ћелија ( ИЦД)9, што сугерише потенцијал имунолошке модулације да активира антитуморски имуни одговор. Бројни иновативни дизајни наноматеријала засновани на овим синергистичким комбинацијама имунотерапијских стратегија постигли су значајно побољшану активност против рака укључујући неорганске10, полимер11 и биомиметичке12 наночестице (НП). Међутим, развој мултифункционалних биоразградивих, биокомпатибилних, ниске токсичности, али високо ефикасних и клинички доступних трансформисаних нано-имуностимуланса остаје велики изазов и велика потражња. Природни биолошки материјали као што су нуклеинске киселине13, протеини12, пептиди14,15 и мали молекуларни природни производи16,17 због својих инхерентних предности (нпр. биокомпатибилност, нетоксичност) привукли су значајан истраживачки интерес за медицинску примену. Нарочито последњих година, сукцесивно су откривени антиканцерогени биоактивни терпеноидни природни мали молекули (НСМ) који поседују функцију самосастављања18,19. На пример, бетулинска киселина (БА), ергостерол (ЕТ) и абиетинска киселина (АА) могу се самостално саставити у микронске или нано-структуриране честице. Ови НСМ-ови су атрактивни градивни блокови који се користе за развој антитуморских агенаса за синергистичку хемотерапију и ПДТ. Доказано је да показују значајне предности лаке нано-производње, боље биокомпатибилности и биоразградљивости, ниже токсичности са смањеним оштећењем јетре и високог синергизма у антитуморској терапији20е23. Ово пружа обећавајуће алтернативе за развој клинички доступних нано-имуностимуланса који се могу преводити за синергистичку имунотерапију. Међутим, генерално јача липофилност ових НСМ-а довела је до неефикасне ћелијске ендоцитозе, која је ослабила њихову антиканцерогену активност и ограничила њихову клиничку вредност за лечење рака24. Слично уобичајено пријављеним нанокомпозитима, одговарајуће нано-формулације НСМ-а су промовисале ћелијско узимање да би се побољшали хемотерапеутски ефекти, али су такође ненамерно повећали ризик од неспецифичне цитотоксичности на нормалне ћелије22. Стога је вредно дубоког размишљања о томе како максимизирати ефикасност терпеноидних НСМ нано агенаса против карцинома уз минимизирање њихове токсичности за нормално ткиво као кључно питање у процесу синергистичке имунотерапије.

цистанцхе користи за мушкарце - јача имуни систем

Стратегије про-лекова су у великој мери примењиване да би се побољшала ћелијска апсорпција липофилних малих молекула повећањем хидрофилности25. Генерално, амфифилни лекови посебно поседују већу ефикасност ћелијске апсорпције од хидрофилних или липофилних лекова26. Што је већа ћелијска фагоцитоза, то је боља терапијска ефикасност24. Стога, развој амфифилних терпеноидних НСМс пролекова може бити потенцијална метода за максимизирање њихових терапеутских ефеката. Поред тога, нанолекови који реагују на стимулусе на специфично микроокружење тумора (нпр. киселина, редокс реаговање) имају велико обећање за контролу ослобађања лека, што је корисно у сузбијању цитотоксичности хемотерапеутских лекова27,28. У међувремену, супрамолекуларно састављање (нпр. приступ репреципитације) је била ефикасна стратегија за припрему нанолекова који су високо растворљиви у води без носача22,29, за које се могло очекивати да ће донекле смањити ефикасност фагоцитозе амфифилних НСМ-а, чиме се умањује њихов пре- дизајнирана цитотоксичност. Претпостављамо да су нанолекови који реагују на стимулусе и потпуно хидрофилни нанолекови даље успостављени на основу амфифилних НСМ про-лекова и да могу ефикасно да потисну његову неспецифичну цитотоксичност на нормалне ћелије, истовремено стимулишући ослобађање високо токсичних амфифилних НСМ-а у туморске ћелије, олакшавајући њихово мировање у нормалним ткивима и активација на месту тумора. Важно је одабрати одговарајући прекурсор растворљив у води и прекурсор који реагује на стимулусе да би се модификовали терпеноидни НСМ за припрему амфифилних молекула пролекова. Годинама, олигосахариди хитозана (ЦОС), као деградирани производи хитозана, не само да имају добру растворљивост у води и обилне еОХ ореНХ2 групе које доводе до доброг пХ одговора, већ имају и корисне антитуморске активности јачањем имунолошке функције домаћина кроз регулацију активности. имуних ћелија као што су моноцитни макрофаги и лимфоцити30,31. Ово гарантује огромну могућност конструисања циљних нано имуностимуланата који реагују на стимулусе за синергистичку имунотерапију.

Овде, на основу горе наведених разматрања, у нашем експерименталном дизајну, пентациклични тритерпенски НСМ бетулинске киселине (БА) се користи као снажно средство против рака32, ЦОС је уведен да би се синтетизовао амфифилни ЦОС-БА молекул да би се побољшао хемотерапеутски ефекат. Хлорин е6 (Це6), широко коришћени фотосензибилизатор са веома малом/без тамне токсичности33, употребљен је за конструисање потпуно растворљивог у води фотосензитивног пролека ЦОС-БА/Це6 НП-а користећи директну стратегију ко-састављања. ЦОС-БА/Це6 НП комбинује два терапеутска модалитета, хемотерапију и фотодинамичку терапију (ПДТ), који могу ефикасно повећати презентацију антигена добијених из тумора у Т ћелијама, стварајући снажне имунолошке одговоре уз помоћ имуног адјуванса анти-ПД-Л1 да изазове високо ефикасну и синергистичку антитуморну хемотерапију/ПДТ/имунотерапију (шема 1). Конструисани ЦОС-БА/Це6 НП су показали паметну функцију мировања са подмуклим ефектима хемотерапије, тј., неозрачени ко-састављени НП-ови показали су изузетно инхибирану ин витро цитотоксичност у поређењу са амфифилним ЦОС-БА, било против рака или нормалних ћелија. Приписујући карактеристично понашање које реагује на пХ, он има ниску токсичност и биолошку сигурност за нормално ткиво ин виво, али је високо токсичан за туморско ткиво због стимулативног ослобађања хиперактивног ЦОС-БА у слабо киселом микроокружењу тумора34. Према нашем најбољем сазнању, тренутно се још увек ретко извештава о дизајнираним нано лековима који садрже ову функцију хемотерапеутског мировања. У међувремену, нанолек има вишеструке повољне терапеутске карактеристике као што је побољшана генерација 1 О2 смањењем енергетског јаза (ДЕСТ) Це6, брз биолошки метаболизам и појачана акумулација тумора, што је довело до ефикасне и безбедне антитуморске комбинације хемотерапије и ПДТ третмана. Што је још важније, и хемотерапија заснована на НП и системи хемотерапије/ПДТ могу ефикасно активирати антитуморски имунитет олакшавањем пролиферације ЦД8þ Т ћелија које производе ТНФ-а и ИФН-г у примарним или удаљеним туморима. Наш предложени биоразградиви, биокомпатибилни, јединствено неактивни, биолошки безбедан и високо ефикасан фото-хемотерапеутски нано-лек постиже значајне системске имунолошке терапијске одговоре, отварајући атрактивне могућности за клиничку примену у лечењу удаљене или метастатске терапије рака.

Шема 1 ПДТ и хемотерапија ко-састављених ЦОС-БА/Це6 НП потенцирали су анти-ПД-Л1 да индукују системску антитуморну имунотерапију. Увођење ЦОС растворљивог у води може ефикасно побољшати хемотерапеутску активност БА (приказано као полумач), што резултира хиперактивним ЦОС-БА амфифилним пролеком (дуги мач). Када су заједно састављени са фотосензибилизатором Це6 (корица), нано-склопови са структуром љуске и осетљиви на пХ имали су паметну и препознатљиву функцију „успавања“ са инхибираном хемотерапијском токсичношћу за нормална ткива. Али, када стигне и буде стимулисан киселим (Хþ) туморским микроокружењем, високо активни амфифилни пролек ЦОС-БА ће се ослободити што ће резултирати значајном хемотерапијом. Поред тога, конструисани ко-склопови су показали одличну ПДТ активност са побољшаном генерацијом синглетног кисеоника (1 О2) изазвану смањеним енергетским јазом између синглетног и триплетног побуђеног стања (ДЕСТ) Це6. У комбинацији са блокадом контролне тачке анти-ПД-Л1, ослобађање антигена повезаних са тумором након хемотерапије/ПДТ третмана може ефикасно активирати системски антитуморски имуни одговор за удаљену имунотерапију рака.

2. Материјал и методе

2.1. Синтеза ЦОС-БА

Бетулинска киселина (40 мг, 0.1 ммол), ЕДЦ (38 мг, 0.2 ммол) и НХС (17 мг, 0.15 ммол ) растворени су у 3 мЛ Н,Н-диметилформамида (ДМФ). После мешања на собној температури током 30 мин, 96 мг ЦОС воденог раствора (1 мЛ) је нежно додато у капима у смешу и мешано 24 х. Затим је реакциона смеша разблажена са ЦХ2ЦИ2, и екстрахована више пута. ЦХ2Цл2 слој је упарен и пречишћен на колони силика гела. Нереаговани БА је првобитно уклоњен коришћењем петролеј етра: ацетона (5:1, в/в) као елуента, а затим промењен на 3:1 да би се добио бели ЦОС-БА (принос: 42%), где је ЦОС идентификован као димер ( н З 2). 1Х НМР (40{{70}} МХз, ЦДЦл3) д: 8,98 (1Х, с, БА-28 О] ЦеНХ), 4,73 (1Х, с, Х -29а), 4,60 (1Х, с, Х-29б), 3,18 (1Х, дд, ЈЗ 4,8, 10,8 Хз, Х-3), 2,95е3,93 (8Х, м, ЦОС), 2,64 (3Х, с, ЦХ3еЦОС), 0,76 (3Х, с, Х-24), 0,83 (3Х, с, Х-25), 0,90 (3Х, с, Х{ {69}}), 0,97 (3Х, с, Х-26), 0,98 (3Х, с, Х-27), 1,70 (3Х, с, Х{-30). 13Ц НМР (100 МХз, ЦДЦл3) д: 179,18 (ЦО, ЦОС), 156,43 (Ц- 28), 150,97 (Ц-20), 109,03 (Ц-29), 78,74, 77,04 , 69.32, 69.22, 65.25, 58.14, 55.62, 55.21, 53.65, 53.22, 50.52, 45.96, 44.32, 44.11, 41.85, 43.7, 38.5, 41.89, 43.7. 04, 36.39, 35.31, 34.21, 31.81, 31.54, 31.17, 30.28 , 29.09, 27.80, 27.22, 25.74, 25.53, 20.91, 19.48, 18.12, 16.02, 15.87, 15.17, 14.65, 14.62. ЕСИеМС м/з: 814,5871 [М‒6Х] (Ц44Х72Н2О12).

2.2. Припрема ЦОС-БА/Це6 НП

Ко-састављени ЦОС-БА/Це6 НП су припремљени методом репреципитације у једном кораку. Обично је прво помешано 5 мЛ Це6 (33 ммол/Л) и 40 мЛ ЦОС-БА (33 ммол/Л) ДМСО раствора. Након тога, смеша је брзо убризгана у 1 мЛ воде која садржи 10 мЛ НаОХ (50 ммол/Л) под ултразвуком (КК-250Е, СхуМеи, Кунсхан, Кина). После ултразвучне обраде у трајању од 10 минута, ЦОС-БА/Це6 НП су добијени центрифугирањем на 13,000 о/мин (ТГЛ-16Г, Ксиангии, Цхангсха, Кина) током 25 минута. Друге формулације са различитим односима ЦОС-БА према Це6 припремљене су истом процедуром са константним моларним односом НаОХ према Це6 од 3:1.

2.3. Ћелијске линије

Људске МЦФ-7, ХепГ2, ЛО2 и мишје 4Т1, Л929 ћелијске линије су обезбеђене од Института за биохемију и ћелијску биологију, СИБС, ЦАС (Кина). МЦФ-7, ХепГ2 и ЛО2 су култивисани у ДМЕМ медијуму са 10% феталног говеђег серума (ФБС, Гибцо) и 1% антибиотика пеницилин-стрептомицина (Лифе Тецхнологи, САД) на 37 Ц. 4Т1 и Л929 су култивисани у РМПИ-1640 медијум са истим односом као горе.

2.4. Студије ћелијске апсорпције и ендоцитних путева

За испитивање ћелијског преузимања, 4Т1 или ЛО2 ћелије су инкубиране са слободним Це6 или ЦОС-БА/Це6 НП (еквивалентна концентрација Це6: 1,7 мг/мЛ, ЦОС-БА: 19,5 мг/мЛ, БА: 10 .8 мг/мЛ) за различита времена. Након прања, фиксирања и ДИПА (#Д9542, Сигма) бојења, ћелије су снимљене под флуоресцентним инвертованим микроскопом (ФИМ) (ДСИ-2000Кс, УП Оптотецх, Цхангцхун, Кина). Интензитет флуоресценције је одређен коришћењем проточне цитометрије коришћењем Гуава ЕасиЦите мини система (Мерцк Миллипоре, Немачка). За квантификацију ефикасности апсорпције, ћелијска акумулација БА и ЦОС-БА је мерена помоћу ХПЛЦ (Агилент 1200, САД). Типично, 4Т1 ћелије су третиране слободним ЦОС-БА или БА (еквивалентни БА: 25 мг/мЛ) током 0,5 и 3 сата. Након испирања са ПБС-ом, ћелијске пелете су сакупљене и подвргнуте ултразвучној хомогенизацији (ЈИ{{25}ИИН, Сциентз Биотецхнологи, Нингбо, Кина) за лизу ћелија. Затим је ЦОС-БА или БА екстрахован хлороформом за ХПЛЦ анализу након лиофилизације узорака. Мобилна фаза је била вода (0,2% фосфорна киселина) и ацетонитрил при брзини протока од 1,0 мЛ/мин, а одговарајући запремински односи су били 60:40 и 15:85 (в/в) за анализу ЦОС-БА и БА, респективно. . Таласна дужина детекције била је 213 нм. За испитивање ендоцитних путева ЦОС-БА/Це6 НП, 4Т1 ћелије су засејане у 6-плоче са бунарима и инкубиране 24 сата пре него што су претходно третиране различитим инхибиторима ендоцитозе током 30 минута, укључујући инхибитор микропиноцитозе [50 ммол/Л , етил изопропил амилорид (ЕИПА) (#Н132356, Аладдин)], инхибитор ендоцитозе посредован клатрином [20 ммол/Л, хлорпромазин (#Ц7010, Соларбио)], инхибитор ендоцитозе посредоване кавеолама [25 ммол/Л, статин #ИН0260, Соларбио)], и инхибитор ацидификације лизозома [50 ммол/Л, хлорокин фосфат (#Ц9720, Соларбио)]35. Затим су ћелије даље култивисане са 2 мЛ ЦОС-БА/Це6 НП (Це6: 1,7 мг/мЛ, ЦОС-БА: 19,5 мг/мЛ) током 2 х и снимљене под ФИМ (УП Оптотецх). Ћелије инкубиране без ендоцитног инхибитора на 37 Ц постављене су као контролне и на инкубацији на ниској температури (4 Ц) за процену енергетски зависне ендоцитозе. У међувремену, средњи интензитет флуоресценције ћелија такође је одређен проточном цитометријом.

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

Кликните овде да видите производе Цистанцхе Енханце Иммунити

【Затражите више】 Е-пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Вхатс Апп: 0086 18599088692 / Вецхат: 18599088692

2.5. Испитивање цитотоксичности

4Т1 ћелије су засејане у 96-плочу са бунарима. Затим су ћелије третиране различитим концентрацијама ЦОС-БА НП током 24 сата. Након тога, 10 мЛ МТТ (#М158055, Аладдин) боје (5 мг/мЛ) је додат у бунар и инкубиран још 4 х, а затим је додато 150 мЛ ДМСО да би се растворили кристали формазана . Апсорбанција сваког базена на 492 нм је забележена читачем микроплоче. За групу са зрачењем, ћелије су третиране лековима током 4 х, затим озрачене 10 мин светлошћу 675  10 нм и инкубиране додатних 20 х. Цитотоксичност ЦОС-БА/ Це6 НП (1 мг/мЛ Це6 одговара 11,5 мг/мЛ ЦОС-БА и 6,4 мг/мЛ БА) према другим ћелијама (МЦФ-7, ХепГ2, ЛО2 и Л929) такође су одређени истим МТТ тестом само са различитим медијумом. У међувремену, комбиновани индекс је израчунат помоћу софтвера ЦомпуСин 2.0 коришћењем прорачуна Цхоу Талалаи теореме36.

2.6. Животињски модели

Све експерименталне процедуре су спроведене у складу са протоколима које је одобрио Комитет за негу и употребу животиња Медицинског универзитета у Харбину. 4Т1 ћелије су суспендоване у медијуму РМПИ-1640 и субкутано убризгане у десну страну сваке женке БАЛБ/ц миша (18е22 г, 6е7 недеља).

2.7. Ин/ек виво флуоресцентно снимање

200 мЛ ЦОС-БА/Це6 НПс 5% раствора глукозе (еквивалент Це6: 0,35 мг/мЛ, ЦОС-БА: 4,02 мг/мЛ) је убризгано кроз репну вену мишевима који носе тумор. Након тога, флуоресцентно снимање туморских места у унапред одређено време је изведено коришћењем АниВиев 100/600 мулти-модел ин виво система за снимање животиња (Гуангзхоу Биолигхт Биотецхнологи Цо., Лтд., Кина) са ексцитацијом на 630 нм. Након 24 х након ињекције, главни органи (срце, јетра, слезина, плућа и бубрези) и тумор су сакупљени за ек виво флуоресцентно снимање. Осим тога, процењене су и ек виво флуоресцентне слике тумора и главних органа у различито време након ив ињекција Це6 или ЦОС-БА/Це6 НП.

2.8. Ин виво хемотерапија/ПДТ

4Т1-мишеви који носе (75е100 мм3) су насумично подељени у шест група (н З 5): 1) 5% раствор глукозе; 2) Це6; 3) Це6 са зрачењем; 4) ЦОС-БА (40,2 мг/кг, при чему БА: 22,3 мг/кг); 5) ЦОС-БА/Це6 НП; 6) ЦОС-БА/Це6 НП са зрачењем. За сваку групу, мишевима је убризгано 200 мЛ ЦОС-БА/Це6 НП (еквивалент Це6: 3,5 мг/кг тела) кроз репну вену 0, 2. и 4. дана. За групе на зрачењу, на 4 х након ињекције након сваке примене, сви мишеви су анестезирани изофлураном, а места тумора су озрачена 675  10 нм (150 мВ/цм2) светлошћу током 15 минута. Запремине тумора и телесне тежине мишева се такође бележе сваки други дан. Запремине тумора се израчунавају по формули: ВЗ ширина2 дужина/2. После 14 дана третмана, тумори су изрезани и измерени да би се израчунао коефицијент инхибиције тумора (ТИР) по уобичајено коришћеној једначини: ТИРЗ (1 узорак/контрола) 100%. Где су узорак и контрола били просечна тежина тумора сваке третиране групе и групе са 5% воденог раствора глукозе, респективно.

2.9. Ин виво хемотерапија/ПДТ/имунотерапија

Да би се демонстрирао потенцијал ЦОС-БА/Це6 НП у комбинацији са имунотерапијом, билатерални модел тумора је дизајниран кроз субкутану ињекцију 4Т1 ћелија у леви и десни бок. Када су се тумори приближили 75е100 мм3, мишеви су подељени у пет група. (1) Контрола; (2) ЦОС-БА/ Це6 НП (ЦОС-БА З 40,2 мг/кг, где је БА З 22,3 мг/кг); (3) ЦОС-БА/Це6 НПс þ светлост; (4) ЦОС-БА/Це6 НПс þ анти-ПДЛ1; (5) ЦОС-БА/Це6 НП þ анти-ПД-Л1 þ светлост. Дана 0, 200 мЛ 5% раствора глукозе (Група 1) или ЦОС-БА/Це6 НП (Це6 З 3,5 мг/кг) (Група 2, 3, 4, 5) је ив убризгано мишевима. После 4 х након ињекције, десни тумори Групе 3 и 4 су зрачени 15 минута. Мишеви су анестезирани изофлураном и котрљани на једној страни да би се избегло излагање левих тумора. Затим је анти-ПД-Л1 антитело (БиоКсцелл, број производа: БЕ0101, број клона: 10Ф.9Г2) ив убризгано мишевима за Групе 4 и 5 дана 2, 4 и 6 (15 мг по мишу по ињекцији). Дужина и ширина сваког тумора су праћени сваки други дан. После 14 дана лечења, крвни серум мишева је сакупљен да би се проценио интерферон-гама (ИФН-г) (#КМЦ4021) и фактор некрозе тумора (ТНФ-а) (#БМС607-3) коришћењем ЕЛИСА теста (еБиосциенце ). Тумори су сакупљени, дисоцирани, третирани пуфером за лизу црвених крвних зрнаца и испрани са ПБС центрифугирањем. Затим је ћелијска суспензија обојена анти-ЦД3-ФИТЦ (#МА1-10187, клон 145-2Ц11, еБиосциенце) и анти-ЦД8а-ПЕ (#12-0081-85, клон 53-6.7, еБиосциенце). Након тога, инфилтрација цитотоксичних Т лимфоцита (ЦТЛ) у десном и левом тумору након различитих третмана је процењена проточном цитометријом.

3. Резултати и дискусија

3.1. Синтеза, производња и карактеризација ЦОС-БА/ Це6 НП

У овој студији дизајнирамо нови мали молекул пролека ЦОС-БА на бази китозан олигосахарида растворљивог у води (ЦОС), који може повећати хемотерапеутску активност пентацикличне тритерпене бетулинске киселине (БА) побољшањем преузимања ћелија кроз повећање хидрофилности. ЦОС (степен полимеризације, ДП: 2е6) који се овде користи је припремљен нашим претходно описаним методом30. Затим је ЦОС-БА синтетизован реакцијом кондензације дехидратације. У комбинацији са анализом главних компоненти ЦОС-а, сматрало се да је хемијска структура ЦОС-БА дисахаридом (ДП:2) модификована БА (помоћне информације, слика С1), што је потврђено 1Х НМР, 13Ц НМР и ЕСИеМС (Помоћне информације, слике С2еС4). Анализа репрезентативног 1Х НМР показала је јасан протонски сигнал ЦОС око 2,64е3,93 ппм и Ц]ЦХ2 пикове (4,60, 4,73 ппм) БА, демонстрирајући успешну синтезу ЦОС-БА (слика 1А). За припрему састављеног синергистичког антитуморског реагенса ЦОС-БА/Це6 НП, коришћен је свестрани приступ поновног таложења у сарадњи са високо ефикасним фотосензибилизатором Це6. Променом почетних моларних односа, обе формулације за комонтажу ЦОС-БА/Це6 могле би да формирају сферичне наноструктуре са модулисаним величинама (слика 1Б и пратеће информације, слика С5). У различитим улазним односима ЦОС-БА/Це6, хидрофилни пречници ЦОС-БА/Це6 НП били су близу 200е300 нм са негативним з-потенцијалом. С обзиром да су НП припремљени у формулацији 8:1 показали нижи индекс полидисперзности (ПДИ, 0,143) са релативно мањом величином (249 нм), довољна количина хемотерапеутског агенса ЦОС-БА је такође била потребна за комбинаторни третман. Због тога смо за следећу студију изабрали формулације ЦОС-БА/Це6 (8:1). Под овом оптимизацијом, ЦОС-БА/Це6 НПс су показали уску дистрибуцију величине (слика 1Ц) и добру растворљивост у води, што указује на његову колоидну природу (слика 1Д). Да би се истражили разлози који стоје иза овог успешног заједничког састављања, примарно понашање слободног ЦОС-БА је истраживано коришћењем скенирајуће електронске микроскопије (СЕМ) (Слика 1Е), што је сугерисало да би ЦОС-БА могао да формира веома униформну нано- сфера од в168 нм, што имплицира да хемијска модификација ЦОС не мења способност самосастављања самог БА (Помоћне информације, слика С6). То је то својство које на крају доводи до успешне изградње косклопова. Нарочито, осим чврсте наноструктуре потврђене трансмисијском електронском микроскопијом (ТЕМ), ЦОС-БА/ Це6 НПс су показале изразиту структуру љуске без ЦОС-БА НП, а просечна дебљина љуске била је приближно 2,35 нм. Друга физичкохемијска карактеризација је сажета на слици 1Ф. Осим тога, ЦОС-БА/Це6 НП су показали негативан з-потенцијал од 5,38 мВ и хидродинамичку величину од в249 нм, већи од оне добијене из СЕМ (в182 нм). Истовремено, ефикасност пуњења Це6 и инкапсулације била је 8,1 и 96%, респективно, као што је утврђено течном хроматографијом високих перформанси (ХПЛЦ). Такође, ФТ-ИР подаци (слика 1Г) додатно су потврдили ово састављање јер су ЦОС-БА/Це6 НП показали карактеристичне Ц]Н, ЦеН и Ц]ЦХ пикове Це6 који се појављују на 1633, 1078 и 633 цм 1 , редом.

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

3.2. Заједнички механизам и формирање структуре шкољке

Након тога, да бисмо боље разумели механизам ко-монтаже, прво смо истражили примарни процес формирања НП-а. Открили смо да ко-састављање ЦОС-БА са Це6 може бити спонтано јер би ове две врсте такође могле да формирају сферичну наноструктуру чак и без ултразвука (Информације за подршку, слика С7), што може бити последица негативне Гибсове промене слободне енергије (ДГ ) у саскуповима37. Овај спонтани склоп такође је сугерисао јачу интермолекуларну интеракцију између ЦОС-БА и Це6. Генерално, интермолекулске интеракције у супрамолекуларним само (или ко-) склоповима су нековалентно п‒п-слагање, водоничне везе и ван дер Валсове силе 38,39. За ову анализу, затим смо истражили УВ апсорпцију ЦОС-БА/Це6 НП (слике 1Х и Ф), што је сугерисало црвено померене Соретове (410} нм) и Ки (667 нм) траке у поређењу са слободни Це6 (405 и 665 нм, респективно). У међувремену, значајна црвено-померена карактеристична апсорпција ЦОС-БА такође се може наћи, што указује на могуће интермолекуларно слагање пп између ЦОС-БА и Це640. Штавише, након инкубације са сурфактантом натријум додецил сулфатом (СДС, 0,2% в/в) (попратне информације, слика С8), ЦОС-БА/Це6 НПс су показали ново плаво померену Ки траку на 641 нм и драматично обновљену флуоресценцију, демонстрирајући да су хидрофобне интеракције такође допринеле заједничком склапању28. Пошто су ове асоцијативне нековалентне интеракције, ко-склопови су показали значајно гашење флуоресценције (98,2%) у води (слика 1И). Колективно, разумно је веровати да п‒п слагање и хидрофобне интеракције могу бити главне покретачке снаге за изградњу ко-склопова. Након тога, да бисмо интуитивније визуализовали процес састављања и открили основне разлоге зашто се могу формирати НП-ови са структуром љуске, извели смо поједностављени симулациони модел молекуларне динамике (МД) који садржи 16 оптимизованих ЦОС-БА молекула и додатна два Це6 у кутији за воду . У почетку смо проценили могућу интеракцију/везивање ЦОС-БА самосклопа у року од 5 нс времена симулације (слика 2А и пратеће информације, слика С9). Открили смо да се, осим бројних интрамолекуларних водоничних веза у ЦОС фракцији, може уочити и неколико парова интермолекуларних Х-веза између ЦОС-БА (слика 2Б и пратеће информације, слика С10), што указује да водонична веза може бити једна главних покретачких снага за формирање ЦОС-БА НП. Посебно је интересантно, у самосастављању ЦОС-БА, сви молекули ЦОС-БА формирају наизглед симетричну структуру (слика 2Ц). Овај фасцинантни феномен нас је мотивисао да истражимо могућу везу између ове особине и формирања ЦОСБА НП-а са структуром љуске. Затим смо покушали да проширимо јединице кутије. Изненађујуће, повезане кутије које се састоје од молекула ЦОС-БА биле су распоређене на правилан начин што је резултирало "ортогоналним" шупљим мрежним структурама (Помоћне информације, слика С11). Што је још важније, насумично смо израчунали дебљину молекула љуске и открили да су у складу са ТЕМ (в2,35 нм) (слика 2Д). Ова тенденција формирања шупљих мрежних структура може бити одговорна за формирање НП-ова са структуром шкољке. Да би се тестирала ова идеја, симулирана је МД структура ко-склопова ЦОС-БА/ Це6 (слика 2Е и пратеће информације, слика С12). Слично као код самосклопа ЦОС-БА, велики број интрамолекуларних и интермолекуларних Х-веза је такође пронађен у ко-склоповима (слика 2Ф и пратеће информације, слика С13). Поред тога, могуће пп слагање између Ц]Ц ЦОС-БА и ароматичног прстена Це6 примећено је у ко-склоповима (слика 2Г), што је у складу са подацима из претходних УВ истраживања. Након проширења броја кутија, сличне шупље мрежне структуре се и даље могу наћи, само са смањеном правилношћу и ортогоналношћу (Помоћне информације, слика С14). Ово може бити могући разлог за неуједначену морфологију ЦОС-БА / Це6 НП у поређењу са ЦОСБА НП. Штавише, растојање молекуларне љуске-слој је такође близу дебљини љуске (в2,35 нм) НП као што се види коришћењем ТЕМ (слика 2Х). Заједно, спекулисали смо да би се формирање ЦОС-БА/Це6 НП-ова или ЦОС-БА НП-ова у великој мери могло приписати овој тенденцији молекула да се састављају у шупље мрежне структуре љуске.

Слика 1. Израда и карактеризација нано-склопова ЦОС-БА/Це6 НП-а посредованих пролековима хитозана олигосахарида модификоване бетулинском киселином (ЦОС-БА). (А) Појачане кључне позиције 1Х НМР ЦОС-БА. (Б) Припрема ко-састављених ЦОС-БА/Це6 НП са различитим ЦОС-БА/Це6 односима. (Ц) Дистрибуција величине ЦОС-БА/Це6 НП користећи ЦОС-БА и Це6 (моларни однос, 8:1) као градивне блокове. (Д) Растворљивост у води и Тиндалов ефекат ко-склопова указују на колоидну природу. (Е) СЕМ и ТЕМ слике слободних ЦОС-БА само-састављања и ко-састављених ЦОС-БА/Це6 НП-ова. (Ф) Резиме физичкохемијских својстава ЦОС-БА/Це6 НП. (Г) ФТ-ИР спектри, (Х) УВ Вис спектри и (И) емисиони спектри флуоресценције слободних Це6, ЦОС-БА и ко-састављених ЦОС-БА/Це6 НП у води.

Слика 2 Структуре (А) ЦОС-БА самосклопа и (Е) ко-састављених ЦОС-БА/Це6 НП након симулације молекуларне динамике (МД) током 5 нс са моларним односом структурне јединице од 8:1 (ЦОС-БА /Це6, израчунато на основу ефикасности оптерећења Це6). Модел линије је коришћен за Х2О, а модели штапића представљају ЦОС-БА или Це6 молекуле, где су Ц атоми Це6 обележени љубичастом бојом. Информације о водоничној вези између молекула ЦОС-БА у (Б) његовим самосклоповима и (Ф) ко-склоповима ЦОС-БА/Це6 НП. (Ц) Очигледно симетрична структура молекуларног распореда ЦОС-БА након МД симулације. (Г) Могуће молекуларне интеракције између ЦОС-БА и Це6 показују потенцијално пп слагање. Назначена дебљина молекула љуске у "ортогоналној" шупљој мрежној структури након проширења одговарајућих МД кутија (Д) слободних ЦОСБА самосклопова и (Х) ЦОС-БА/Це6 НП косклопова.

3.3. Енергетски механизам побољшане 1 О2 генерације

Затим смо даље испитали стварање синглетног кисеоника (1 О2), једне од критичних реактивних врста кисеоника (РОС) за перформансе ПДТ користећи ДПБФ (1,3-дифенилизобензофуран) као сонду. После дуготрајног зрачења смеша раствора ЦОС-БА/ Це6 НП са ДПБФ, УВ апсорпција ДПБФ-а се смањила у интензитету, што указује на 1 О2 генерацију (слика 3А). Након поређења са референцом метилен плавог (МБ), Ф ( 1 О2) ЦОС-БА/ Це6 НП је израчунат као 0.26, нешто више од слободног Це6 (ФЗ0.19) (слика 3Б). Генерално, енергија коју апсорбују фотосензибилизатори ће се подвргнути трима релаксационим путевима који укључују флуоресценцију, ефекат загревања преко вибрационе релаксације и генерисање РОС кроз међусистемско укрштање (ИСЦ)41. У складу са значајно угашеном емисијом флуоресценције, ЦОС-БА/ Це6 НП такође нису промовисали никакав ефекат загревања у води (попратне информације, слика С15), што је имплицирало побољшани ИСЦ процес након ко-монтаже Це6 са ЦОС-БА, што је довело до на побољшану 1 О2 генерацију. Да бисмо даље разјаснили молекуларни механизам таквог ефекта, покушали смо да оптимизујемо и израчунамо могући модел са једним молекулом ЦОС-БА/Це6 који се састоји од потенцијалног пп слагања добијеног из МД симулације теоријом функционалне густине (ДФТ) (слика 3Ц) . Запањујуће, ЦОС-БА/Це6 је показао видљиву црвено-померену УВ апсорпцију од 581,24 нм од оне слободног Це6 (579,30 нм), што указује на појаву пп слагања (слика 3Д). Иако је енергетски минимализована геометрија ЦОС-БА/Це6 показала мале структурне разлике са унесеном МД конфигурацијом, карактеристично слагање између Ц]Ц или Ц]О веза ЦОС-БА са порфинским прстеном Це6 је и даље било видљиво, додатно потврђујући да изнад п‒п слагање је могуће. У међувремену, недавно је показано да повећана ефикасност донирања електрона п‒п слагањем може олакшати ИСЦ процес42, док је ИСЦ стопа (КИСЦ) пропорционална (1/ДЕСТ) 2,43. То јест, нижи енергетски јаз (ДЕСТ) фотосензибилизатора ће побољшати ИСЦ процес промовишући ефикасно генерисање РОС. Затим смо израчунали најниже побуђено синглетно стање (С1) и триплетно стање (Т1) Це6 и ЦОС-БА/Це6 (слика 3Е), респективно. Резултати су показали да је ЦОС-БА/Це6 показао смањени ДЕСТ од 1,1892 еВ у поређењу са слободним Це6 (1,2001 еВ), потврђујући побољшани ИСЦ процес. Смањење ДЕСТ-а је корисно за производњу 1 О2, што је такође верификовано у другим нанофотосензибилизаторима44. Узето заједно, чини се да п-слагање смањује ДЕСТ Це6 након заједничког састављања са ЦОС-БА, што доводи до побољшане генерације 1 О2.

Слика 3 Енергетски механизам побољшане производње 1 О2 изазваног ЦОС-БА/Це6 НП. (А) УВ Вис спектри фотодекомпозиције 1,3-дифенилизобензофурана (ДПБФ) након продуженог зрачења ЦОС-БА/Це6 НП. (Б) У дијаграмима првог реда промена ДПБФ УВ апсорпције (ДОД), принос 1 О2 је процењен коришћењем метилен плавог (МБ) (ФЗ 0.52) у ДМСО као референтног једињења. (Ц) Енергетски минимизиране структуре могућег модела ЦОС-БА/Це6 са једним молекулом гледано са стране и напред, који је добијен према почетној молекуларној конфигурацији између Це6 са ЦОС-БА након МД симулације и након ДФТ прорачуна. (Д) Предвиђени прелази спектра УВ Вис апсорпције (вертикалне траке) слободног Це6 и оптимизовани модел ЦОС-БА/Це6. (Е) Израчунати нивои енергије њиховог најнижег побуђеног синглетног стања (С1) и најнижег триплетног стања (Т1), респективно, [Гаусов 09/Б3ЛИП/6-31Г (д, п)]. Где је ДЕСТ израчунат као ЕС1 ЕТ1.

3.4. Карактеристике мировања хемотерапије

Након тога, да би се потврдио концепт дизајна у овој студији да би развој амфифилног ЦОС-БА молекула могао ефикасно повећати терапеутски ефекат БА побољшањем преузимања ћелија кроз повећање хидрофилности, а у међувремену даље конструисањем на стимулусе и потпуно хидрофилног ЦОС-БА/Це6 НП-и су олакшали његово мировање у нормалним ткивима и активацију на туморским местима. Да бисмо тестирали ову хипотезу, прво смо истражили понашање ослобађања лека ЦОС-БА/Це6 НП у различитим пуферским растворима (слика 4А). Резултати су показали да су ЦОС-БА/Це6 НП показали понашање које реагује на пХ са кумулативним ослобађањем Це6 од 88% при пХ 5,6 и 57% при пХ 7,4 после 24 х, респективно. Ова карактеристика је вероватно настала због уништавања бројних водоничних веза које су постојале у ЦОС-БА/Це6 НП након увођења киселог Хþ45, што је довело до повећаног ослобађања Це6 (слика 4Б). Ово је даље потврђено растављањем ЦОС-БА/Це6 НП након инкубације директно у киселој средини (слика 4Ц). Ова карактеристика која реагује на пХ може бити корисна за ефикасну антитуморну терапију због слабо киселог микроокружења тумора34. У међувремену, ЦОС-БА/Це6 НП су имали бољу стабилност јер се није могла приметити значајна величина или ПДИ промене након инкубације у ПБС и 1640-РМПИ медијуму ћелијске културе током 10 дана (помоћне информације, слика С16), што би било важно за њихову потенцијалну употребу за даљу биомедицинску примену. Потом су спроведена даља истраживања проценом цитотоксичности слободног липофилног БА (контактни угао к: 133,3 ) и амфифилног ЦОС-БА (к: 52 ) (слика 4Д) помоћу стандардног метил тиазолил-дифенил тетразолијум бромида (МТТ). Као што је предвиђено, било за ћелије рака 4Т1 или нормалне ЛО2 хепатоците, појединачни ЦОС у суштини нема антиканцерогену активност при релативно ниским дозама. Ово може бити последица антипролиферационих ефеката ЦОС који се активирају путем индуковања НФ-кБ сигналног пута само при високим концентрацијама (приближно на нивоу милиграма)30. Док ЦОС-БА има значајно повећану цитотоксичност са изузетно ниским вредностима ИЦ50 (6,03 мг/мЛ за 4Т1 и 9,92 мг/мЛ за ЛО2) у поређењу са онима код БА (17,63 мг/мЛ за 4Т1 и 20,53 мг/мЛ за ЛО2) чак и при истим масеним концентрацијама (сл. 4Е и Ј). Добијени резултати су имплицирали да модификација ЦОС растворљивог у води увелико повећава ефикасност ћелијске апсорпције липофилног БА, што доводи до снажног антиканцерогеног деловања ЦОС-БА. Да би се квантификовала ефикасност апсорпције, акумулација БА или ЦОС-БА унутар 4Т1 ћелија је директно одређена ХПЛЦ (Помоћне информације, слика С17). Резултати су јасно подржали да амфифилни ЦОС-БА показује значајно већи унос од слободног БА (отприлике 36-пута након 3 х инкубације), показујући повећану хемотерапеутску активност ЦОС-БА. Горњи закључак је додатно поткријепљен значајно побољшаном цитотоксичношћу амфифилне ЦОСБА против ћелија рака ХепГ2 и МЦФ-7 (Помоћне информације, слика С18), које су добро у складу са концептом дизајна. Након заједничког састављања са Це6, открили смо да ЦОС-БА/Це6 НП без зрачења показују значајно инхибирану цитотоксичност против 4Т1 ћелија рака у поређењу са еквивалентним ЦОС-БА, посебно при 11,5 мг/мЛ, али основна активност ПДТ није била погођена ( Слика 4Ф). Да бисмо потпуније потврдили овај феномен, даље смо истражили ин витро цитотоксичност ЦОС-БА/Це6 НП-ова против других ћелија рака, укључујући МЦФ-7 и ХепГ2. Занимљиво је да је амфифилни ЦОС-БА показао веома јачу цитотоксичност према МЦФ-7 ћелијама (слика 4Г), али се хемотерапеутска активност значајно смањила након ко-састављања са Це6, односно, неозраченим ЦОС-БА/Це6 НП. Слични резултати су такође примећени у ХепГ2 ћелијама само уз благи пад (слика 4Х). Да бисмо додатно подржали горње закључке, такође смо проценили хемотерапеутске ефекте нано-склопова и ЦОС-БА против нормалних ћелија Л929 фибробласта миша и хуманих ЛО2 хепатоцита (слика 4И). Резултати су показали да састављени ЦОС-БА/Це6 НП значајно смањују оригинални високотоксични амфифилни лек ЦОС-БА, показујући одличну биокомпатибилност. Анализом цитотоксичности, ИЦ50 вредности амфифилног ЦОС-БА биле су значајно ниже од вредности ко-састављених ЦОС-БА/Це6 НП без обзира на канцер или нормалне ћелије (слика 4Ј). Односно, конструисање потпуно хидрофилних и нано косклопова који реагују на стимулусе може унапред ефикасно потиснути високу цитотоксичност амфифилног лека ЦОС-БА. Узимајући у обзир карактеристичну карактеристику која реагује на пХ, чини се да ће ЦОС-БА/Це6 НП бити неактивни у нормалним ткивима са жељеном ниском токсичношћу хемотерапије, али активни у туморским ткивима због њиховог стимулативног ослобађања високо токсичног ЦОС-БА у слабо киселом тумору. микроокружење. Узети заједно, за разлику од широко пријављене неофункционализације хемотерапеутских реагенса који имају појачану активност против рака22,23, амфифилни нано-склопови посредовани ЦОС-БА не само да показују паметну карактеристику „успавања“ са подмуклим ефектима хемотерапије, већ такође задржавају специјализовану потенцијалну активност ПДТ-а. за паметну антитуморску терапију.

Слика 4 (А) Профили ослобађања Це6 ин витро из ЦОС-БА/Це6 НП у ПБС (пХ 7,4, 6,5 или 5,6) који садрже Твеен 80 (0,5%, в/в) на 37 Ц. (Б) Могући механизам који реагује на пХ који Хþ покреће растављање НП-а. (Ц) Растављање ЦОС-БА/Це6 НП након директне инкубације у води са приближно пХ 4.0. (Д) Контактни угао слободних БА, Це6, ЦОС-БА и ЦОС-БА/Це6 НП, респективно. (Е) Ћелијска цитотоксичност слободног БА, ЦОС и амфифилног ЦОС-БА против репрезентативних ћелија рака 4Т1 и нормалних ЛО2 ћелија. Вијабилност ћелија (Ф) 4Т1, (Г) МЦФ-7, (Х) ХепГ2 ћелија рака након инкубације са слободним ЦОС-БА, ЦОС-БА/Це6 НП са/без зрачења при назначеној еквивалентној концентрацији ЦОС-БА за 24 х. (И) Ћелијска цитотоксичност слободних ЦОС-БА, неозрачених ЦОС-БА/Це6 НП против нормалних ћелија ЛО2 и Л929. (Ј) ИЦ50 анализа ЦОС-БА против рака и нормалних ћелија. Подаци су изражени као средња вредност СД (н З 6). *П ˂ 0.05, **П ˂ 0,01 и ***П ˂ 0,001 показују значајне разлике.

Да би се истражили могући разлози који стоје иза ове карактеристике мировања хемотерапије, временско зависно ћелијско понашање ЦОС-БА/Це6 НП је процењено сукцесивно инкубацијом са 4Т1 ћелијама рака. Резултати су показали да, иако су ЦОС-БА/Це6 НП-ови показали изванредно гашење флуоресценције, они су и даље показали побољшану фагоцитну ефикасност у поређењу са слободним Це6 захваљујући јачој цитоплазматској црвеној флуоресценцији, као што је утврђено квантитативном анализом проточне цитометрије (слика 5А). Ова побољшана ћелијска интернализација НП-а може се приписати ендоцитози21. Узети заједно, спекулисали смо да, иако високо растворљиви у води ко-склопови ЦОС-БА/Це6 НП (контактни угао к: 36,7 ) показују побољшану ћелијску ендоцитозу од липофилног Це6 (к: 132,6, близу БА), смањену ефикасност фагоцитозе НП-ови се могу појавити у поређењу са амфифилним молекулом ЦОС-БА, чиме се чини да потискују хемотерапеутску цитотоксичност ЦОС-БА/Це6 НП. Односно, ефикасност преузимања ћелија од високе до ниске као таква секвенца: амфифилни ЦОС-БА, хидрофилни ЦОС-БА/Це6 НП, липофилни БА или Це6. Што је још важније, неадекватно растављање ћелијских НП-а може бити још један важан разлог за ослабљен хемотерапеутски ефекат, а све то може бити повезано са паметним мировањем хемотерапије ЦОС-БА/Це6 НП-а. Осим тога, пошто је растављање НП-а посебно спроведено у киселом окружењу туморских ћелија, да бисмо демонстрирали карактеристику која реагује на пХ, покушали смо да упоредимо ефекте преузимања ЦОС-БА/Це6 НП у нормалним ЛО2 ћелијама (Слика 5Б) . Међутим, ЦОС-БА/Це6 НП нису показали значајно инхибирану Це6 црвену флуоресценцију у ЛО2 ћелијама. Супротно томе, понашање ЛО2 при преузимању било је слично оном код ћелија рака 4Т1, што сугерише да се ЦОС-БА/Це6 НП такође могу раставити чак и у нормалним ћелијама, што може бити резултат слабо киселих пХ интрацелуларних одељака (ендозома/лизозома) који постоје унутар и рака и нормалних ћелија46. Пошто ћелијски унос НП-а зависи од процеса ендоцитозе, директна инкубација лека можда неће истаћи пХ-одговор ЦОС-БА/Це6 НП-а на ћелијском нивоу. Ипак, микроокружење тумора (ТМЕ) је високо кисело у поређењу са нормалним ткивима47. Без обзира на интрацелуларни карцином или ТМЕ, ЦОС-БА/ Це6 НП-ови могу бити осетљиви на пХ и растављени да би покренули ослобађање високо токсичног ЦОС-БА. Док, у нормалним ткивима, ЦОС-БА/Це6 НП се могу раставити тек након уласка у нормално ћелијско окружење, смањујући вероватноћу ослобађања ЦОСБА. Стога закључујемо да је мировање хемотерапије карактеристично за ЦОС-БА/Це6 НП у микроокружењу тумора валидно и поуздано, а идеја дизајна у овој студији је изводљива.

3.5. Ин витро хемотерапија/ПДТ антиканцерогена ефикасност ЦОС-БА/ Це6 НП

Поред тога, пре детаљне ин витро хемотерапије/ПДТ антиканцерогене ефикасности ЦОС-БА/Це6 НП и да бисмо даље открили механизам ендоцитозе, проучавамо четири главна пута ендоцитозе додавањем одговарајућих ендоцитних инхибитора, укључујући хлорпромазин (посредује клатрином), хлорокин (хлорокин). инхибитор ацидификације лизозома), нистатин (посредује кавеолама) и инхибитор макропиноцитозе ЕИПА (етилизопропил амилорид) (Слике 5Ц и Д). Примећујемо да би увођење нистатина и хлорпромазина могло ефикасније да инхибира фагоцитну ефикасност од ЕИПА и хлорокин фосфата, показујући значајно смањену ћелијску флуоресценцију у поређењу са нормалном 37 Ц. Ови резултати указују да су ЦОС-БА/Це6 НП-ови интернализовани вишеструким механизмима, углавном путеви ендоцитозе посредовани клатрином и кавеолама. Пошто је повећана генерација 1 О2 путем интермолекуларних интеракција, ЦОС-БА/Це6 НП показују значајно повећани међућелијски принос РОС од приноса Це6, што показује јача зелена флуоресценција ДЦФХ сонде (слика 5Е), што имплицира већу фотодинамичку ефикасност. МТТ тестови показују да ЦОС-БА/Це6 НП под зрачењем врше значајно појачан инхибицијски ефекат на 4Т1 ћелије него код еквивалентног Це6, док са релативно умереном цитотоксичношћу без зрачења (слика 5Ф). Значајно је да је ИЦ50 Це6 (0,53 мг/мЛ) у ЦОС-БА/Це6 НП био много нижи од слободног Це6 (1,39 мг/мЛ) (Слика 5Г), што указује на значајно побољшану ефикасност ПДТ, која је била даље савршено демонстрирано цитотоксичношћу ЦОСБА/Це6 НП против хуманих ћелија рака МЦФ-7 и ХепГ2 (попратне информације, слика С19). Исто тако, у поређењу са слободним Це6, релативно ниже вредности ИЦ25, ИЦ50 и ИЦ75 такође су примећене у косклоповима (слика 5Г). У међувремену, у поређењу са само Це6 ПДТ и једном хемотерапијом НП у мраку, ЦОС-БА/Це6 НП под зрачењем су постигли ефикаснију комбиновану хемотерапију/ПДТ против горње три ћелије рака, показујући синергизам (комбинациони индекс: ЦИ ˂ 1) ( Слика 5И). Осим тога, двоструко бојење флуоресценције живе/мртве ћелије коришћењем калцеин-ацетоксиметил естра (калцеин-АМ) и пропидијум јодида (ПИ) додатно је потврдило да ЦОС-БА/Це6 НП могу ефикасно индуковати ћелијску апоптозу и некрозу, пошто су третиране ћелије биле скоро обојене. са црвеним ПИ флуоресцентним сигналом када се култивише додатних 10 х након зрачења (слика 5Х). У међувремену, неозрачени ЦОС-БА/Це6 НП (већа доза Це6: 3,2 мг/мЛ) такође су имали одређену хемотерапеутску активност што се види истовремено по АМ и ПИ сигналима. Ова изузетно побољшана ПДТ активност ЦОС-БА/Це6 НП је даље потврђена бојењем АМ/ПИ након третмана у трајању од додатних 20 х (Попратне информације, слика С20). Штавише, при додавању натријум азида (СА) и Д-манитола (ДМ), посебно специјалног гаситеља 1 О2 и $ОХ48, ћелијама 4Т1 третираним ЦОС-БА/Це6 НПс-ПДТ, очигледно повећана виталност ћелија имплицира да Фотореакције типа И ($ОХ) и типа ИИ (1 О2) догодиле су се истовремено у ПДТ процесу посредованом ЦОСБА/Це6 НПс (слика 5Ј). Штавише, ЦОС-БА/Це6 НП посебно поседују бољу компатибилност са крвљу на шта указује занемарљива хемолиза црвених крвних зрнаца (слика 5К), што сугерише потенцијал за биомедицинску примену путем интравенске примене.

3.6. Ин виво биодистрибуција ЦОС-БА/Це6 НП

Након тога, пре испитивања ин виво дистрибуције, ми смо затим проценили фармакокинетику ЦОС-БА/Це6 НП праћењем концентрације Це6 у крви након интравенозне ињекције са еквивалентним Це6 или ЦОС-БА/Це6 НП. Профили концентрације и времена Це6 у крви (слика 6А) и упоредни фармакокинетички параметри (табела пратећих информација С1) јасно потврђују да ЦОС-БА/Це6 НП имају продужену циркулацију у крвотоку, што може омогућити већу акумулацију на тумору сајтови. Конкретно, ЦОС-БА/Це6 НП су показали брзу елиминацију крви у року од 2 х, што имплицира повољну биоразградљивост. Сходно томе, ми смо затим истражили ин виво биодистрибуцију и способност акумулације тумора ЦОС-БА/Це6 НП (слике 6Б и Ц). Слично универзално пријављеним Це6 нанокомпозитима33, ЦОС-БА/Це6 НП се могу брзо дистрибуирати по целом телу. Нарочито током прва 4 х, склопови су показали очигледно јачу емисију флуоресценције на местима тумора од слободног Це6, што сугерише побољшану ретенцију и способност акумулације ЦОС-БА/Це6 НП-а на тумор, вероватно приписану ефекту пасивне повећане ретенције пермеабилности (ЕПР) које пружају наночестице14. Након 6 х након ињекције, интензитет флуоресценције на местима тумора постепено се брзо смањивао. Значајно је да за разлику од уобичајено пријављених нанокомпозита са значајно повећаном акумулацијом тумора у поређењу са слободним позитивним леком29, ЦОС-БА/Це6 НП нису показали веома изражену акумулацију на месту тумора 24 сата након ињекције него слободни Це6 (слика 6Ц), који је био додатно подржано снимањем изрезаног тумора (слике 6Д и Е). Одлична биоразградивост НП-а може бити одговорна за увођење природних малих органских молекула. Ово је такође примећено код других терпеноидних нано-склопова посредованих малим молекулима49. Осим тога, ЦОС-БА/Це6 НП су такође показали сличну дистрибуцију ткива као слободни Це6 (слика 6Е), а ек виво просечни интензитет флуоресценције је генерално био нижи од оног представљеног ин виво, што даље указује на добру биоразградљивост. Поред тога, узимајући у обзир блиску разлику у нивоу флуоресценције између 2 и 4 х након ињекције НП-а и Це6, као и експерименталну оперативност која дозвољава довољне интервале за зрачење, 4 х након примене је изабрано као временска тачка за наредну ПДТ терапију.

Узимајући у обзир не баш изражену акумулацију тумора за 24 сата од слободног Це6, да бисмо даље потврдили повећани ЕПР ефекат који ЦОС-БА/Це6 НП имају, одмах смо пратили ек виво флуоресцентне слике тумора у различито време након ињекције интравенозно са нанолековима ( Слика 6Ф и Г). Изванредно, било 20 мин или 12 х након ињекције, ЦОС-БА/Це6 НП су заиста показали јачу емисију флуоресценције на местима тумора него слободни Це6, показујући одличну и побољшану способност акумулације тумора. У међувремену, како је време пролазило, интензитети флуоресценције задржани у туморском ткиву постепено су слабили (слика 6Г), што је у потпуности у складу са резултатима ин виво флуоресцентног снимања животиња. Јасно је да су овај брзи биолошки метаболизам и појачана акумулација тумора избегли потенцијалну дугорочну токсичност акумулације, гарантујући високо ефикасну антитуморну терапију са бољом биобезбедношћу.

Слика 5 Ин витро антиканцерогена ефикасност ЦОС-БА/Це6 НП. Ћелијска интернализација (А) 4Т1 ћелија рака и (Б) ЛО2 нормалних ћелија инкубираних у слободним Це6 или ЦОС-БА/Це6 НП током 0.5 и 3 х, и одговарајућа проточна цитометријска анализа интензитета флуоресценције. (Ц) Инхибиција апсорпције студија специфичних ендоцитних путева и (Д) одговарајући интензитет флуоресценције ћелија мерен проточном цитометријом након инкубације са ЦОСБА/Це6 НП са/без ендоцитних инхибитора укључујући хлорпромазин, хлорокин, нистатин и етилизопропил (ЕИПА). Скала траке З 20 мм. (Е) Генерисање РОС ћелија изазвано слободним Це6 или ЦОС-БА/Це6 НП (еквивалент Це6: 1,6 мг/мЛ). Скала траке З 20 мм. (Ф) Вијабилност ћелија 4Т1 ћелија након различитих третмана током 24 сата. (Г) ИЦ25, ИЦ50, ИЦ75 анализа слободних Це6 и ЦОС-БА/Це6 НП против 4Т1, МЦФ-7 и ХепГ2 ћелија, респективно. (Х) Калцеин-АМ/пропидијум јодид (ПИ) живо/мртво бојење ЦОС-БА/Це6 НПс (Це6: 1,6 мг/мЛ) третираних 4Т1 ћелија након инкубације од додатних 10 х, као и неозрачених ЦОС- БА/Це6 НП (Це6: 3,2 мг/мЛ). Скала бар З 50 мм. (И) Комбинациони индекс (ЦИ) ЦОС-БА/Це6 НП на 4Т1, МЦФ-7 и ХепГ2 ћелијама, као што је одређен прорачуном Цхоу Талалаи теореме. (Ј) ПДТ механизми (Тип И и Тип ИИ) индуковани зрачењем ЦОС-БА/Це6 НП и процењени специфичним 1 О2 и $ОХ гаситељем натријум азида (СА) и Д-манитола (ДМ), респективно. (К) Проценат хемолизе црвених крвних зрнаца након инкубације са ЦОС-БА/Це6 НП током 4 х. Подаци су изражени као средња вредност СД (н З 3). *П ˂ 0,05, **П ˂ 0,01 и ***П ˂ 0,001 показују значајне разлике.

Слика 6 Ин виво циркулација крви и биодистрибуција ЦОС-БА/Це6 НП. (А) Профили концентрације и времена Це6 у крви након ив ињекција еквивалентног Це6 или ко-састављених ЦОС-БА/Це6 НП (н З 3). (Б) Флуоресцентне слике целог тела мишева са тумором 4Т1 након ив ињекција назначених лекова у различитим временским тачкама. (Ц) Просечан интензитет флуоресценције добијен са туморских места у (Б). (Д) Ек виво флуоресцентне слике тумора и главних органа изрезаних од горњих мишева у 24 х, и одговарајући (Е) квантитативни резултат интензитета флуоресценције (н З 3). (Ф) Ек виво флуоресцентне слике тумора и главних органа у различито време након ив ињекција Це6 или ЦОС-БА/Це6 НП, и (Г) одговарајућа анализа интензитета флуоресценције тумора. Подаци су изражени као средња вредност СД (н З 3).

3.7. Комбиновани антитуморски третман ин виво хемотерапија/ПДТ 

Мотивисана јединственом карактеристиком мировања, добром биоразградљивошћу и ПДТ активношћу, испитивана је ин виво комбинована антитуморска терапија хемотерапије/ПДТ. Мишеви са тумором 4Т1 су насумично подељени у 6 група и интравенозно им је убризган еквивалентни Це6 (3,5 мг/кг тела) свака 2 дана за укупно три дозе. 4 х након ињекције, места тумора мишева у светлосним групама су озрачена 15 минута (слика 7А). У међувремену, одговарајуће запремине тумора или телесне тежине су забележене сваки други дан. После 14 дана лечења (слика 7Б), слободни Це6 са зрачењем и слободни ЦОС-БА су били неефикасни у супресији тумора, вероватно због ограничене акумулације лека у туморском ткиву. Насупрот томе, након зрачења ЦОС-БА/Це6 НП, примећена је најзначајнија инхибиција тумора, што потврђује одличну ефикасност комбинације хемотерапије/ПДТ. Просечна тежина тумора (слика 7Д) и одговарајуће фотографије сецираних тумора (слика 7Е) су показале најбољу антитуморну ефикасност ЦОС-БА/Це6 НП под зрачењем, пошто су третирани мишеви показали најмању величину тумора од оних у другим групама. Просечан однос инхибиције тумора ЦОС-БА/Це6 НП третираних ПДТ-ом достигао је 80,3%, већи од оних код слободног Це6 ПДТ (42,4%) и слободног ЦОС-БА (38,5%). Приметно, иако су претходне ин витро студије показале да су ЦОС-БА/Це6 НП без светлости показали успавану функцију хемотерапеутске активности, они и даље имају повећану антитуморску ефикасност (49,5%) у поређењу са слободним ЦОС-БА (слика 7Д). Спекулисали смо да два могућа разлога доприносе овом резултату, један је већа акумулација тумора ЦОС-БА/Це6 НП-а због широко пријављеног ЕПР ефекта. Други фактор је слабо кисело микроокружење тумора које је стимулисало ослобађање високо токсичног ЦОС-БА. Због веће критичне концентрације мицела (ЦМЦ, 187 мг/мЛ) ЦОС-БА (Попратне информације, слика С21), он би могао постојати у стању мономера у окружењу тумора, чиме се фаворизује побољшана хемотерапија неозраченог ЦОС-а. БА/Це6 НП. Осим тога, да би се даље верификовала супериорна антиканцерогена ефикасност ЦОС-БА/Це6 НП, извршено је бојење тумора хематоксилином и еозином (Х&Е) (слика 7Г).

Слика 7 Студија ефикасности са моделом поткожног 4Т1 ксенографта. (А) Шематска илустрација ин виво ПДТ третмана. (Б) Профили раста тумора, (Ц) промене телесне тежине и (Д) изрезане тежине тумора које садрже однос инхибиције тумора код мишева који носе 4Т1- након различитих третмана у назначеним групама (н З 5 за сваку групу). (Е) Слике изрезаних тумора репрезентативних мишева након третмана. (Ф) Биохемијска анализа серума након третмана са ЦОС-БА/Це6 НП током 14 дана. (Г) Репрезентативно Х&Е бојење изрезаних туморских секција након различитих третмана. Скала шипки З 50 мм. (Х) ТУНЕЛ бојење слободних Це6 и ЦОС-БА/Це6 НПс ПДТ третираних секција тумора. Скала бар З 20 мм **П < 0,01 указује на значајне разлике.

Резултати су показали да су секције тумора третиране ЦОС-БА/Це6 НПс-ПДТ показале озбиљно пропадање ткива и недостатак језгара, док је у другим групама примећена умерена некроза ткива. Истовремено, у поређењу са слободним Це6 светлом, ЦОС-БА/Це6 НП под зрачењем значајно су повећали број ТУНЕЛ-позитивних ћелија које показују јаче смеђе нуклеарно бојење (слика 7Х), додатно потврђујући одличну комбинацију хемотерапије/ПДТ терапије. Штавише, нису примећене очигледне варијације телесне тежине у свим групама (слика 7Ц). Чак и ако су ЦОСБА/Це6 НП или Це6 лаке групе имале скроман губитак телесне тежине током примене, телесне тежине су се вратиле у нормалу након неколико дана. Није било евидентног оштећења или инфламаторних лезија у главним органима узетим на крају третмана (Попратне информације, слика С22), што указује на ниску/нема системске токсичности и добру биосигурност ЦОС-БА/Це6 НП. Штавише, иако се ЦОС-БА/Це6 НП углавном акумулирају у ткиву јетре, одговарајући маркери функције јетре (АЛТ, АСТ и АЛП) нису показали значајне промене у поређењу са нормалним здравим мишевима (слика 7Ф), што указује на бољу биокомпатибилност. Поред тога, чинило се да су маркери бубрежне функције (БУН, ЦРЕ и УА) и биохемијски параметри (АЛБ и ТБИЛ) слични нормалним мишевима, што даље указује на бољу биосигурност. Јасно је да овај органски мали молекул који посредује ЦОС-БА ЦОС-БА/Це6 НП поседују вишеструке повољне терапеутске карактеристике које отварају атрактивне могућности за примену у клиничкој медицини.

3.8. Антитуморски имунитет комбиноване хемотерапије/ПДТ и блокаде анти-ПД-Л1

Недавно су бројне иновативне студије показале да би комбинација имунотерапије канцера са другим модалитетима лечења могла ефикасно да подстакне имуне одговоре специфичне за тумор на елиминацију примарних или удаљених тумора1. Охрабрени јединственом функцијом мировања хемотерапије и одличном хемотерапијом/ПДТ антитуморском ефикасношћу ЦОС-БА/Це6 НП, стога се питамо да ли би то такође могло да изазове имунолошке одговоре уз помоћ имуног адјуванса анти-ПД-Л1 да изазове високо ефикасну антитуморну терапију . Да ли може да лечи удаљене туморе који се не могу директно лечити коришћењем ПДТ третмана, пружајући на тај начин алтернативну стратегију за клиничке примене против рака? Да би се тестирала ова хипотеза, у овој студији је успостављен модел "два тумора" и детаљне експерименталне процедуре су приказане на слици 8А. Типично, два 4Т1 тумора су инокулисана и на левом и на десном боку сваког миша. С обзиром да сам анти-ПД-Л1 нема упадљив имунотерапеутски ефекат50, експерименти су подељени у 5 група укључујући нетретирану групу, ЦОС-БА/Це6 НП, ЦОС-БА/Це6 НП са анти-ПД-Л1, ЦОС- БА/Це6 НП са светлом, ЦОС-БА/Це6 НП са светлом и анти-ПД-Л1. Након једне ив ињекције НП (Це6: 3,5 мг/кг), десни тумори (примарни тумор) у лаким групама су зрачени 15 минута да би се проценили имунолошки ефекти ПДТ/хемотерапије, док су леви тумори (удаљени тумори) у свим групама без икаквог лечења одабрани су за индивидуалну хемотерапију. Након тога, 2., 4. и 6. дана, мишевима у имунолошким групама је ив убризгано анти-ПД-Л1 антитело (15 мг по мишу по ињекцији) за укупно три дозе. Значајно, без обзира на ПДТ третман или не, ЦОС-БА/Це6 НП плус анти-ПД-Л1 могу ефикасно инхибирати прогресију примарног тумора (слика 8Б). А одговарајући просечни односи инхибиције тумора су одвојено достигли 86,7% (зрачење) и 76,5% (без зрачења), далеко више од индивидуалне хемотерапије (5,7%) или хемотерапије/ПДТ (27,4%) третмана (слика 8Ц) . Фотографије сецираних тумора (слика 8Д) и мишева који носе 4Т1-(помоћне информације, слика С23) након 14 дана третмана такође су визуелно подржале горњи закључак. Ови резултати сугеришу да и хемотерапија заснована на НП и хемотерапија/ПДТ могу ефикасно активирати антитуморски имунитет. У међувремену, што је најупечатљивије, блокада анти-ПД-Л1 плус НП такође је понудила изузетан ефекат инхибиције тумора на неозрачене удаљене (леве) туморе (слике 8Е и Ф), генерално јаче од самих ЦОС-БА/Це6 НП, што је било такође потврђено одговарајућим сецираним туморима и сликама мишева након третмана (слика 8Д и слика С23), што даље показује ефикасан антитуморски имуни одговор изазван ЦОС-БА/Це6 НП.

Да би се у потпуности истражио овај ефикасан антитуморски имуни одговор, ЦД8þ цитотоксични Т лимфоцити (ЦТЛ), критични имуноцит за имунотерапију рака4, даље су процењени анализом имуних ћелија у десном или левом тумору након 14 дана лечења. Утврђено је да ЦОС-БА/Це6 НП плус анти-ПД-Л1 са или без ПДТ третмана изазивају робусну ЦД8þ ЦТЛ инфилтрацију у примарним туморима (Слика 8Х и Ј). ЦД8þ ЦТЛ инфилтрација је била до 11,3% након хемотерапије засноване на ЦОС-БА/Це6 НПс/ПДТ плус третмана против ПД-Л1, нешто више од ЦОС-БА/Це6 НП плус анти-ПД-Л1 (9,63%), и много већа од оне у другим групама без анти-ПД-Л1, укључујући лечење хемотерапијом заснованом на ЦОС-БА/ Це6 НПс (5,12%) или само хемотерапијом/ПДТ (4,07%). Слично, у поређењу са неимуним групама, значајно повећана ЦТЛ инфилтрација је такође примећена у левим (удаљеним) туморима код мишева после ЦОС-БА/Це6 НП плус антиПД-Л1 са или без ПДТ третмана (Слика 8И и К), даље што подразумева високо ефикасне имуне одговоре изазване хемотерапијом или комбинованом терапијом хемотерапије/ПДТ. У међувремену, након увођења анти-ПД-Л1, и хемотерапија заснована на ЦОС-БА/Це6-и хемотерапија/ПДТ довели су до снажне производње вишеструких цитокина који играју кључну улогу у регулисању цитотоксичних функција ЦТЛ8, укључујући тумор фактор некрозе-алфа (ТНФ-а) (слика 8Л) и интерферон-гама (ИФН-г) (слика 8М) у узорцима серума мишева после 14 дана третмана, што даље потврђује да је постојао ефикасан антитуморски имуни одговор. Осим тога, нису примећене очигледне промене у телесној тежини у различитим групама лечења (слика 8Н), што указује на повољну биобезбедност ове комбиноване хемотерапије/ПДТ/имунотерапија. Узети заједно, открили смо да иако анти-ПД-Л1 плус ЦОСБА/Це6 НП са светлом показују нешто већи однос инхибиције тумора (86,7%) него група која није озрачена (76,5%) у односу на праве туморе због утицаја ПДТ (Слика 8Б‒Д), нису примећене значајне разлике у терапијским ефектима на туморе леве стране у присуству (77,8%) или одсуству (78,4%) ПДТ (Слика 8Е‒Г). Претпостављамо да следећи могући разлози доводе до овог феномена. Прво, за механизам хемотерапије или ПДТ који појачавају имунолошке ефекте блокаде анти-ПД-Л1 контролне тачке, акумулиране студије су показале да ови модалитети лечења могу изазвати акутну упалу у подручју тумора, чиме се повећава презентација антигена повезаних са тумором на Т. ћелије, изазивајући тако ћелије рака да се подвргну ИЦД8,9. Туморске ћелије које су подвргнуте ИЦД би појачале регулацију сигнала „поједи ме“ излагањем калретикулина (ЦРТ) на површинама имуногено умирућих туморских ћелија и сигналима „опасности“ ослобађањем кутије 1 групе високе покретљивости (ХМГБ1), промовишући активацију дендритских ћелија да се активирају ЦТЛ, чија активност може бити појачана анти-ПД-Л1, што резултира значајно побољшаном имунотерапијом против рака51.

Слика 8 Антитуморски ефекат хемотерапије/ПДТ засноване на ЦОС-БА/Це6 НПс плус блокада контролне тачке анти-ПД-Л1 имунотерапије. (А) Шематска илустрација хемотерапије/ПДТ засноване на ЦНПс са анти-ПД-Л1 терапијом. (БеД) (Б) Профили раста тумора, (Ц) просечне тежине тумора и (Д) слике изрезаних тумора репрезентативних мишева за примарне (десне) туморе након различитих третмана током 14 дана како је назначено. (ЕеГ) (Е) Криве раста тумора, (Ф) просечне тежине тумора и (Г) слике ексцидираних тумора за неозрачене удаљене (леве) туморе након различитих третмана како је индицирано. (Х) Популације ЦД8þ Т ћелија у десним туморима и (Ј) проценти ЦТЛ инфилтрације су квантитативно детектовани проточном цитометријом након 14 дана третмана. (И, К) Популације ЦД8þ Т ћелија у левим туморима 14. дана су квантитативно детектоване проточном цитометријом (н З 3). Секреција цитокина у серумима после 14 дана третмана укључујући (Л) ИФН-г и (М) ТНФ-а мерено ЕЛИСА тестом (н З 3). (Н) Промене телесне тежине мишева током различитих третмана. *П < 0.05, **П < 0.01 и ***П < 0,001 показују значајне разлике.

Друго, у овом раду, ЦОС-БА/Це6 НП-ови могу бити распоређени на леви и десни тумор истовремено, и лева хемотерапија и десна хемотерапија/ПДТ имају огроман потенцијал да индукују туморске ћелије које пролазе кроз ИЦД. У међувремену, ЦОС-БА/Це6 НП се примењују у само једној дози, имунотерапија углавном зависи од три дозе анти-ПД-Л1, било да се ради о хемотерапији или хемотерапији/ПДТ, они су само прајмери. Терапијске разлике у изазивању ИЦД ћелија тумора између појединачне хемотерапије и комбинованих хемотерапије/ПДТ третмана можда неће бити веома изражене. Проценат ЦД8þ ЦТЛ-ова на левој (сл. 8И и К) и десним туморима (сл. 8Х и Ј) је такође подржао горњу спекулацију, није примећена значајна разлика у ЦД8þ ЦТЛ-овима у присуству или одсуству ПДТ-а. Стога су ЦОС-БА/Це6 НП плус анти-ПД-Л1 са или без зрачења постигли сличну антиканцерогену ефикасност против левих тумора. Штавише, пошто 4Т1 ћелије експримирају ниске нивое ПД-Л152, широко је доказано да сам анти-ПД-Л1 има било какав упадљив имунотерапијски ефекат на 4Т1 карцином дојке53,54. Упркос томе што ИЦД ефекти посредовани ЦОС-БА/Це6 НП-има захтевају даље истраживање, представљени резултати су показали да ЦОС-БА/Це6 НП постижу значајно појачане имуне одговоре уз помоћ анти-ПД-Л1. Заједно, чини се да су ЦОС-БА/Це6 НП заиста потенцирали имунотерапију рака анти-ПД-Л1, а не само комбиновану терапију. Иако анти-ПД-Л1 плус ЦОС-БА/Це6 НП са или без ПДТ третмана нису показали значајне разлике у терапијским ефектима, оба су показала очигледно повећану антитуморну ефикасност у поређењу са једном дозом ЦОС-БА/Це6 НП. Односно, чак и без светлосног третмана, након што је уведен имуни адјуванс антиПД-Л1, имуногеност остатака тумора после хемотерапије ЦОС-БА/Це6 НПс може бити појачана, што доводи до изванредних системских антитуморских имуних одговора, што доводи до ефективне супресије примарних или удаљених тумора. Дакле, требало би да буде могуће елиминисати примарне и метастатске туморе током клиничке антиканцерогене имунотерапије уз поновљене третмане НП. Јасно је да ови резултати заједно пружају доказе о високо ефикасним и синергистичким антитуморским имуним одговорима изазваним ЦОС-БА/Це6 НП у комбинацији са анти-ПД-Л1 блокадом, било са само хемотерапијом или у комбинацији са хемотерапијом/ПДТ.

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

4. Закључци

Укратко, наменски смо дизајнирали, синтетизовали и развили биокомпатибилан, биоразградив, ниско токсичан, али високо ефикасан и клинички доступан трансформисани фото-хемотерапеутски нано-пролек ЦОС-БА/Це6 НП комбиновањем три мултифункционалне компоненте само-састављене природне мале молекуле бетулинске киселине (БА), ЦОС растворљив у води и нискотоксични фотосензибилизатор Це6 за комбиновану хемотерапију/ПДТ. Он затим покреће високо ефикасне и синергистичке антитуморске имуне одговоре у комбинацији са блокадом анти-ПД-Л1, било са само хемотерапијом или у комбинацији са хемотерапијом/ПДТ. Конкретно, показујемо да молекуларни распоред шупље мреже може олакшати формирање наночестица структурираних у шкољки. Модификације ЦОС растворљивог у води могу у великој мери да побољшају антиканцерогену активност липофилних природних малих молекула конструисањем амфифилног пролека. Такође показујемо да су резултујући нанолекови показали вишеструке повољне терапеутске карактеристике, посебно паметну функцију „успавања“ са подмуклим ефектима хемотерапије. У комбинацији са карактеристичном реакцијом на пХ, ови ко-склопови имају ниску токсичност и биолошку сигурност са нормалним ткивом, али су високо токсични за туморска ткива. Заједно са побољшаном генерацијом 1 О2, добром биоразградљивошћу и биокомпатибилношћу, све то је допринело високо ефикасној, синергистичкој и безбедној хемотерапији против рака/ПДТ/ имунотерапији. Посебно, индивидуална хемотерапија без ПДТ третмана може активирати системске антитуморске имуне одговоре, отварајући атрактивне могућности за клинички синергистичку имунотерапију хемотерапије против рака. Све у свему, овај рад пружа обећавајући увид за развој природних мултифункционалних високо биоактивних и ниско токсичних нано-имуностимуланата за клиничку имунотерапију.

Референце

1. Санг В, Зханг З, Даи ИЛ, Цхен КСИ. Недавни напредак у синергистичкој комбинованој имунотерапији рака заснованој на наноматеријалима. Цхем Соц Рев 2019;48:3771е810.

2. Ли КСИ, Гуо КСМ, Линг ЈБ, Танг З, Хуанг ГН, Хе ЛЗ, ет ал. Имунотерапија рака заснована на наномедицини развијена репрограмирањем макрофага повезаних са тумором. Наносцале 2021;13:4705е27.

3. Цхао И, Ксу ЛГ, Лианг Ц, Фенг ЛЗ, Ксу Ј, Донг ЗЛ, ет ал. Комбинована локална имуностимулациона радиоизотопна терапија и системска блокада имунолошких контролних тачака дају снажне антитуморске одговоре. Нат Биомед Енг 2018;2:611е21.

4. Вен ИИ, Цхен Кс, Зху КСФ, Гонг ИЦ, Иуан ГЛ, Кин КСИ, ет ал. Интегрисане наночестице фототермалне хемотерапије са одговором микроокружења тумора побољшале су индукцију имуногене ћелијске смрти за ефикасан третман колоректалног карцинома. АЦС Аппл Матер интерфејси 2019;11:43393е408.

5. Пенг ЈР, Ксиао И, Ианг К, Лиу КИ, Цхен И, Схи К, ет ал. Унутарћелијска агрегација наносклопова малих молекула репрограмираних пептидима побољшава хемотерапију рака и комбинаторну имунотерапију. Ацта Пхарм Син Б 2021;11:1069е82.

6. Сонг В, Куанг Ј, Ли ЦКС, Зханг МК, Зхенг ДВ, Зенг Кс, ет ал. Побољшана имунотерапија заснована на фотодинамичкој терапији за ерадикацију тумора примарних и метастаза у плућима. АЦС Нано 2018;12: 1978е89.

7. Ванг Ц, Ксу ЛГ, Лианг Ц, Ксианг Ј, Пенг Р, Лиу З. Имунолошки одговори изазвани фототермалном терапијом угљеним наноцевима у комбинацији са анти-ЦТЛА-4 терапијом за инхибицију метастаза рака. Адв Матер 2014;26:8154е62.

8. Хе ЦБ, Дуан КСП, Гуо НН, Цхан Ц, Поон Ц, Веицхселбаум РР, ет ал. Координациони полимери језгра и љуске комбинују хемотерапију и фотодинамичку терапију да би појачали имунотерапију рака код блокаде контролних тачака. Нат Цоммун 2016; 7:12499.

9. Галлуззи Л, Букуе А, Кепп О, Зитвогел Л, Кроемер Г. Имуногена смрт ћелија код рака и заразних болести. Нат Рев Иммунол 2017; 17: 97е111.

10. Цхианг ЦС, Лин ИЈ, Лее Р, Лаи ИХ, Цхенг ХВ, Хсиех ЦХ, ет ал. Комбинација магнетних наночестица на бази фукоидана и имуномодулатора побољшава имунотерапију локализовану на тумору. Нат Нанотецхнол 2018;13:746е54.

11. Зхенг КСЛ, Ге ЈЦ, Ву ЈС, Лиу ВМ, Гуо Л, Јиа КИ, ет ал. Биоразградиви дериват хипокретина нановезикула као тераностик вођен скоро инфрацрвеним светлом за двоструко фотоактивно снимање рака и терапију. Биоматеријали 2018;185:133е41.

12. Спицер ЦД, Јумеаук Ц, Гупта Б, Стевенс ММ. Наночестице пептида и протеина коњугирају разноврсне платформе за биомедицинске апликације. Цхем Соц Рев 2018;47:3574е620.

13. Меи ИЛ, Ванг РБ, Јианг В, Бо И, Зханг ТФ, Иу ЈЛ, ет ал. Недавни напредак у наноматеријалима за испоруку нуклеинске киселине у имунотерапији рака. Биоматер Сци 2019;7:2640е51.

14. Зхенг ИЛ, Ие ЈКС, Ли ЗИ, Цхен ХЈ, Гао И. Недавни напредак у соно фото динамичкој терапији рака: од развијених нових сензибилизатора до стратегија за повећање ефикасности заснованих на нанотехнологији. Ацта Пхарм Син Б 2021;11:2197е219.

15. Ли СК, Зоу КЛ, Ли ИКС, Иуан ЦК, Ксинг РР, Иан КСХ. Паметни супрамолекуларни фотодинамички метало-нано лекови засновани на пептидима дизајнирани вишекомпонентном координацијом самосастављања. Ј Ам Цхем Соц 2018; 140:10794е802.

16. Зхи КК, Ванг ЈЦ, Зхао ХТ, Ианг Кс. Гел природног производа са малим молекулима који се самостално склапа за испоруку лекова: пробој у новој примени природних производа малих молекула. Ацта Пхарм Син Б 2020; 10: 913е27.

17. Ианг Кс, Ма Ц, Цхен ЗМ, Лиу Ј, Лиу ФИ, Ксие РБ, ет ал. Наночестице састављене са малим молекулима посредују ефикасној оралној испоруци лека. Нано Рес 2019;12:2468е76.

18. Зхи КК, Зхао ХТ, Ианг Кс, Зханг Х, Ванг ЈЦ, Ванг Ј, ет ал. Гелатори природних производа и општа метода за њихово добијање из организама. Наносцале 2018;10:3639е43.

19. Цхенг ЈЈ, Фу СИ, Кин З, Хан И, Ианг Кс. Самосастављене природне мале молекуле дитерпенске киселине са повољном антиканцерогеном активношћу и биолошком безбедношћу за синергистички побољшану антитуморну хемотерапију. Ј Матер Цхем Б 2021;9:2674е87.

20. Ванг ЈЦ, Зхао ХТ, Зхи КК, Ианг Кс. Истраживање природног активног процеса пуњења лека малим молекулима и високоефикасне синергистичке антитуморске ефикасности. АЦС Аппл Матер интерфејси 2020;12:6827е39.

21. Цхенг ЈЈ, Зхао ХТ, Иао Л, Ли И, Ки БК, Ванг Ј, ет ал. Једноставни и мултифункционални природни само-састављени стероли са супрамолекуларним фотосензибилизаторима посредованим антиканцерогеном активношћу за побољшану антитуморну фотодинамичку терапију. АЦС Аппл Матер интерфејси 2019;11: 29498е511.

22. Цхенг ЈЈ, Зхао ХТ, Ванг ЈЦ, Хан И, Ианг Кс. Биоактивна природна мала молекула подешена коасамблирање фотосензитивних лекова за високо ефикасну синергистичку и побољшану фотохемотерапију типа И. АЦС Аппл Матер интерфејси 2020;12:43488е500.

23. Ванг ЈЦ, Зхао ХТ, Киао ВС, Цхенг ЈЈ, Хан И, Ианг Кс. Наномедицина-цум-носач ко-састављањем природних малих производа за синергистички појачан антитумор са заштитним деловањем ткива. АЦС Аппл Матер интерфејси 2020;12:42537е50.

24. Кси ЈЦ, Лиу ХП. Недавни напредак у дизајну амфифилних лекова и вакцина који се самостално испоручују. Адв Тхер 2019;3:1900107.

25. Зханг РС, Кин КСФ, Конг ФД, Цхен ПВ, Пан ГЈ. Побољшање ћелијске апсорпције терапеутских ентитета кроз интеракцију са компонентама ћелијске мембране. Друг Делив 2019;26:328е42.

26. Пујалс С, Гиралт Е. Пролином богати пептиди који продиру у амфипатске ћелије. Адв Друг Делив Рев 2008;60:473е84.

27. Карими М, Гхасеми А, Саханди Зангабад П, Рахигхи Р, Моосави Басри СМ, ​​Мирсхекари Х, ет ал. Паметне микро/наночестице у системима за испоруку лекова/гена који реагују на стимуланс. Цхем Соц Рев 2016; 45: 1457е501.

28. Цхенг ЈЈ, Ли КСИ, Ванг С, Хан И, Зхао ХТ, Ианг Кс. Тритерпенски пролекови без носиоца са одговором на глутатион и биобезбедношћу за синергистички побољшану фотохемотерапију. АЦС Аппл Матер интерфејси 2021;13:245е56.

29. Ли КСС, Лее СИ, Иоон Ј. Супрамолекуларни фотосензибилизатори подмлађују фотодинамичку терапију. Цхем Соц Рев 2018;47:1174е88.

30. Зоу П, Иуан СЈ, Ианг Кс, Гуо ИЗ, Ли ЛН, Ксу ЦВ, ет ал. Структурна карактеризација и антитуморски ефекти хитозанских олигосахарида против ортотопског тумора јетре путем НФ-кБ сигналног пута. Ј Фунцт Фоодс 2019;57:157е65.

31. Зхаи КСЦ, Иуан СЈ, Ианг Кс, Зоу П, Ли НЛ, Ли ГИ, ет ал. Хитозан олигосахариди индукују апоптозу у хуманом карциному бубрега путем стреса ендоплазматског ретикулума зависног од реактивног кисеоника. Ј Агриц Фоод Цхем 2019; 67:1691е701.

32. Денг Г, Ма Ц, Зхао ХТ, Зханг СК, Лиу Ј, Лиу ФИ, ет ал. Комбинована терапија против едема и антиоксиданса за исхемијски мождани удар путем наночестица бетулинске киселине напуњених глибуридом. Тхераностицс 2019; 9: 6991е7002.

33. Лиу К, Ксинг РР, Зоу КЛ, Ма ГХ, Мо¨хвалд Х, Иан КСХ. Једноставно пептидно подешено самосастављање фотосензибилизатора ка фотодинамичкој терапији против рака. Ангев Цхем Инт Ед Енгл 2016;55:3036е9.

34. Ли И, Лин ЈИ, Ванг ПИ, Луо К, Лин ХР, Зханг И, ет ал. Самоциљајући вирус који реагује на микроокружење тумора нанолек је инспирисао нанолек за скоро инфрацрвену-ИИ фототермалну хемотерапију вођену сликањем. АЦС Нано 2019;13:12912е28.

35. Савада СИ, Сато ИТ, Кавасаки Р, Иасуока ЈИ, Мизута Р, Сасаки И, ет ал. Наногел хибридни склоп за интрацелуларну испоруку егзосома: ефекти на ендоцитозу и фузију инжењерингом површинских полимера егзосома. Биоматер Сци 2020;8:619е30.

36. Цхоу ТЦ. Теоријска основа, експериментални дизајн и компјутеризована симулација синергизма и антагонизма у студијама комбинација лекова. Пхармацол Рев 2006;58:621е81.

37. Зхао ИП, Зхао ИН, Ма КС, Сун Б, Ванг КП, Динг З, ет ал. Двоструко функционалне наношипке без носача путем самосастављања чистих молекула лека за синергистичку хемофотодинамичку терапију. Инт Ј Наномед 2019;14:8665е83.

38. Ма Кс, Зхао ИЛ. Биомедицинске примене супрамолекуларних система заснованих на интеракцијама домаћин-гост. Цхем Рев 2015;115:7794е839.

39. Кин КСХ, Зханг МЗ, Ху Кс, Ду К, Зхао ЗП, Јианг И, ет ал. Наноинжењеринг новодизајнираног деривата хлорина е6 за појачану фотодинамичку терапију путем регулисања метаболизма лактата. Наносцале 2021;13:11953е62.

40. Ду К, Кин КСХ, Зханг МЗ, Зхао ЗП, Ли К, Рен КСМ, ет ал. Нанолек без носача који може регулисати митохондријски метаболизам за појачавање осетљивости фототермалне терапије. Цхем Цоммун (Цамб) 2021;57:8993е6.

41. Ли КСС, Иу С, Лее Д, Ким Г, Лее Б, Цхо И, ет ал. Лакши супрамолекуларни приступ активирајућим нанотераностицима вођеним нуклеинским киселинама који превазилазе недостатке фотодинамичке терапије. АЦС Нано 2018; 12:681е8.

2. Гилсон РЦ, Блацк КЦ, Лане ДД, Ацхилефу С. Хибридни ТиО2-рутенијум нано-фотосензибилизатор синергистички производи реактивне врсте кисеоника иу хипоксичним и у нормоксичним условима. Ангев Цхем Инт Ед Енгл 2017;56:10717е20.

43. Ксу СД, Иуан ИИ, Цаи КСЛ, Зханг ЦЈ, Ху Ф, Лианг Ј, ет ал. Подешавање синглет-триплет енергетског јаза: јединствени приступ ефикасним фотосензибилизаторима са карактеристикама емисије изазване агрегацијом (АИЕ). Цхем Сци 2015; 6:5824е30.

44. Ву ВБ, Мао Д, Ксу СД, Кенри, Ху Ф, Ли КСК, ет ал. Фотосензибилизација појачана полимеризацијом. Цхем 2018;4:1937е51.

45. Кунду ПК, Саманта Д, Леизровице Р, Маргулис Б, Зхао Х, Бо¨рнер М, ет ал. Светлосно контролисано самосастављање наночестица које не реагују на фото. Нат Цхем 2015; 7:646е52.

46. ​​Мииазаки М, Иуба Е, Хаиасхи Х, Харада А, Коно К. пХ-осетљиви полимер-модификовани липозоми на бази хијалуронске киселине за ћелијски-специфичне интрацелуларне системе испоруке лекова. Биоцоњуг Цхем 2018; 29:44е55.

47. Зханг ЈИ, Лиу ЗН, Лиан П, Киан Ј, Ли КСВ, Ванг Л, ет ал. Селективно снимање и смрт ћелија рака преко пХ променљиве блиске инфрацрвене флуоресценције и фототермалних ефеката. Цхем Сци 2016; 7:5995е6005.

48. Цхенг ЈЈ, Тан ГХ, Ли ВТ, Зханг ХИ, Ву КСД, Ванг ЗК, ет ал. Лака синтеза мултифункционалних магнетних Фе3О4@ СиО2@ЦС@пиропхеопхорбиде-а флуоресцентних наночестица уз помоћ хитозана за фотодинамичку терапију. Нев Ј Цхем 2016; 40:8522е34.

49. Цхенг ЈЈ, Ванг С, Зхао ХТ, Лиу И, Ианг Кс. Истраживање механизма самосастављања и ефикасне синергистичке антитуморске хемофототерапије биоразградивог фотосензитивног нанолека који посредује пролекове урсолне киселине који реагује на глутатион. Биоматер Сци 2021; 9: 3762е75.

50. Ианг И, Ксу Ј, Сун И, Мо ЛТ, Лиу Б, Пан КСС, ет ал. Логичка рачунарска реакција заснована на аптамеру на живим ћелијама да би се омогућила терапија блокаде контролних тачака имуног система без антитела. Ј Ам Цхем Соц 2021; 143: 8391е401.

51. Куаи Р, Иуан ВМ, Сон СЈ, Нам Ј, Ксу И, Фан ИЦ, ет ал. Елиминација установљених тумора комбинованом хемоимунотерапијом на бази нанодиска. Сци Адв 2018;4:еаао1736.

52. Лесниак ВГ, Цхаттерјее С, Габриелсон М, Лисок А, Вхаррам Б, Помпер МГ, ет ал. Детекција ПД-Л1 у туморима коришћењем [(64)Цу]атезолизумаба са ПЕТ-ом. Биоцоњуг Цхем 2016;27:2103е10.

53. Сагив-Барфи И, Кохрт ХЕК, Цзервински ДК, Нг ПП, Цханг БИ, Леви Р. Терапијски антитуморски имунитет блокадом контролне тачке је побољшан ибрутинибом, инхибитором и БТК и ИТК. Проц Натл Ацад Сци УСА 2015;112:Е966е72.

54. Лианг Ц, Цхао И, Ии Кс, Ксу Ј, Фенг ЛЗ, Зхао К, ет ал. Интерна радиоизотопска терапија посредована наночестицама за локално повећање пермеабилности васкулатуре тумора за синергистички побољшане терапије рака. Биоматеријали 2019;197:368е79.