Фитокемијски скрининг и естрогенска активност укупних гликозида Цистанцхе Десертицола

Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Апстрактан

Током деценија постојали су стални напори да се побољша квалитет људског живота. Постменопаузални синдром је озбиљна брига за здравље жена. Хормонска терапија је тренутно главна метода лечења овог стања. Међутим, ова терапија може довести до злоупотребе естрогена, што доводи до нежељених реакција и нежељених ефеката. Као резултат тога, хормонска терапија је била неуспешна у ублажавању постменопаузалног синдрома.Цистанцхе десертицолаје класична тоник биљка у традиционалној кинеској медицини. Показује значајну естрогенску активност. Главна активна једињења ове биљке су гликозиди. У претходном експерименту, идентификована су три важна фактора који доприносе укупном приносу гликозида, приносу актеозида и естрогенској активности, наиме концентрација елуента, пХ и запремина елуента. У овом експерименту, оптималан процес пречишћавања је одређен коришћењем централне композитне методологије дизајна и одговора површине за добијање гликозида из ове биљке. Концентрација елуента (етанола) од 85 процената и запремина од 25 БВ при пХ од 11 су била оптимална. Двадесет и једно активно једињење је идентификовано течном хроматографијом високих перформанси/квадруполном тестом масене спектрометрије времена лета. Ова студија пружа драгоцене увиде за даља дубинска истраживања која процењују естрогене активности укупних гликозидаЦистанцхе десертицола.

Кључне речи: Централни композитни дизајн; Цистанцхе десертицола укупни гликозиди; ЛЦ/К-ТОФ-МС; технологија пречишћавања; тест раста материце.

Увод

Цистанцхе десертицолаје јестива, класична тоник биљка. Први пут је поменута у Схен Нонг-овом биљном класику и уврштена у највиши разред. То је топла и слатка биљка. Има бројна лековита својства, као што су исхрана јетре и бубрега, јачање мишића и костију, и побољшање имунолошке регулације, уз анти-агинг и антитуморске активности [1-4]. Нека природна једињења су изолована и идентификована из екстраката ове биљке, од којих су главни фенилетаноидни гликозиди, лигнаноиди, иридоиди, полисахариди и алкалоиди [5-8].

Лекови добијени од лековитог биља садрже различита активна једињења, која су првенствено одговорна за њихово терапеутско дејство. Ефикасност истог лека добијеног из различитих биљних извора може варирати због разлика у врсти и количини активних једињења присутних у њему. Стога је важно идентификовати и квантификовати сва активна једињења присутна у лековима добијеним од лековитих биљака. Исто важи и за Ц. десертицола. Методологија површине одговора је експериментална метода за истраживање интеракције између различитих фактора истовремено [9-10]. Може се користити за оптимизацију параметара екстракције за фитофармацеутике и квантитативну процену активних једињења у лековима. Централни композитни дизајн (ЦЦД) је један од експерименталних дизајна корисних у методологији површине одговора. У поређењу са ортогоналним и униформним дизајном, ЦЦД има већу прецизност и бољу предвидљивост [11].

Постменопаузални синдром може значајно смањити квалитет живота код жена. Обично се естроген користи за лечење овог стања. Међутим, дуготрајна употреба естрогена може довести до злоупотребе, изазивајући на тај начин различите нежељене реакције и нежељене ефекте. Због тога је императив изабрати алтернативну терапију, пожељно биљни лек који садржи естроген као активни састојак за лечење постменопаузалног синдрома [12-13].

У прелиминарном експерименту, помоћу масене спектрометрије (МС) су идентификоване структуре различитих природних једињења добијених из Ц. десертицола [14]. Потврђено је да су гликозиди главна активна једињења која имају значајну естрогенску активност [14-15]. Да би се развио сигуран и ефикасан естрогенски активни састојак у новом леку, потребно је дубинско истраживање ТГЦД након пречишћавања. У овој студији, ЦЦД је први пут коришћен за оптимизацију пречишћавања укупних гликозида Ц. десертицола (ТГЦД). Након тога, тест раста материце је коришћен за процену естрогених активности истог гликозида. За квалитативну анализу једињења ТГЦД након пречишћавања коришћена је течна хроматографија високих перформанси/квадруполна временска масена спектрометрија (ХПЛЦ/К-ТОФ-МС). Овај процес је примењен да би се експлицитно показало присуство различитих активних једињења са естрогеном активношћу у ТГЦД. Ово може истовремено да пружи основу за његову клиничку употребу у постменопаузалном синдрому који замењује естроген.

Експериментални поступак

Инструменти

Агилент 1290 ХПЛЦ систем (Агилент Тецхнологиес, ​​Пало Алто, Калифорнија, САД), Агилент 6530 серија квадрупола ЛЦ/МС (К-ТОФ) систем (Агилент Тецхнологиес, ​​Пало Алто, Калифорнија, САД) и хемијска ХПЛЦ{ {5}}Д радне станице су коришћене као хроматографски инструменти за обраду података. Милли-К ултрачиста вода је коришћена за целу студију. АР1140 електронска аналитичка вага (Охаус Интернатионал Лтд.); 680 читач микроплочица (Био-Рад Цорпоратион); и центрифуга велике брзине 64Р (Бецкман Цоултер Аллегра) коришћена је за припрему узорака.

Лекови и хемикалије

Ц. десертицола је купљен на тржишту лекова и идентификовао га је проф. Зханг Делиан (Харбин Университи оф Цоммерце, Кина). Стандардни диетилстилбестрол (99 процената чистоће, партија бр. 60518) је набављен од Др. Ехренсторфера (Немачка). Други стандарди актеозид (111530-200505) и ехинакозид (111670-200503) набављени су од Националног института за контролу фармацеутских и биолошких производа, Пекинг, Кина. Чистоћа сваког стандарда је била > 98 процената. Ацетонитрил (АЦН), метанол и мравља киселина (МС квалитета) су набављени од Тхермо Сциентифиц Пиерце (Роцкфорд, ИЛ, САД). Ултра чиста вода је добијена од Хангзхоу Вахаха Гроуп Цо., Лтд. (Хангџоу, Кина). Сви комерцијално доступни реагенси су били аналитичког квалитета.

Припрема укупних гликозида раствора за пречишћавање Ц. десертицола

Након потапања у 75% етанол током 12 х, сирови прах Ц. десертицола (100 г) је екстрахован са 800 мЛ 75% (в/в) етанола на 80 степени током 150 минута под рефлуксом. Затим је филтриран кроз филтер са два спрата и затим екстрахован са 800 мЛ 75-постотног етанола два пута у трајању од додатних 150 мин. Након тога, филтрати су комбиновани и концентровани у вакууму на 45 степени. Екстракт се добија уклањањем растварача. Екстракту је додата одређена количина дестиловане воде да би се добила концентрација од 0,5 г/мЛ, која је коришћена за скрининг процеса пречишћавања.

За адсорпцију коришћењем АБ-8 макропорозне смоле, пХ раствора испитног узорка је подешен на 11. Прво је коришћена дестилована вода са 2 БВ да би се уклониле нечистоће. Затим је елуент у концентрацији од 25 БВ 85 процената етанола елуиран и сакупљен. Коначно, прикупљени пречишћени елуент је спојен. Екстракту је додата одређена количина дестиловане воде да би се добила концентрација од 1,5 г/мЛ која је коришћена за интрагастричну примену. За позитивну контролу, припремљен је раствор диетилстилбестрола (20 уг/мЛ) са прахом диетилстилбестрола.

Према односу пречишћавања ({{0}}}.6), одређена количина екстракта (еквивалентна 1 г Ц. десертицола) је пребачена у волуметријску тиквицу од 10 мЛ, растворен у 50% (в/в) раствору метанола у ултразвучном купатилу током 5 минута и разблажен до 10 мЛ. Лековити раствор је добијен након филтрације супернатанта кроз филтерску мембрану од 0,45 μм. Актеозид и ехинакозид (по 1 мг) су помешани и потпуно растворени у 10 мЛ 50 процентног (в/в) раствора метанола. Коначно, стандардни раствор је филтриран кроз 0,45 μм Миллипоре филтер пре анализе.

ЛЦ-МС услови

Хроматографско раздвајање је спроведено у ХПЛЦ систему (Агилент 129{{10}}), опремљеном кватернарним системом за испоруку растварача, вакуумским дегазификатором и детектором фотодиодног низа. МС/МС анализа је обављена у инструменту Агилент-1290 ХПЛЦ/6530 К-ТОФ-МС систему, опремљеном електроспреј јонизационим извором у режиму позитивних и негативних јона. За одвајање је коришћена Ватерс Симметри схиелд РП Ц18 колона (4,6 × 250 мм, 5 μм) (Ватерс Цорпоратион, Милфорд, МА, САД). Мобилна фаза је садржала 0,2 процента воденог раствора мравље киселине (в/в) (А) и АЦН (Б), и пумпана је при брзини протока од 0,5 мЛ/мин. Запремина ињекције сваког узорка била је 10 μЛ. Програм елуирања градијента је био следећи: 5-23 процената Б током 0-35 минута, 23-25 ​​процената Б током 35-65 минута и 25-5 процената Б током 65-70 минута. Температура колоне је одржавана на 30 степени. Хроматограми су праћени и забележени на 330 нм. Притисак гаса атомизације је постављен на 30 Пси, а капиларни напон је био 3,5 кВ. Брзина протока сувог гаса била је 8 Л/мин на температури од 30 степени. Температура плаштног гаса је подешена на 400 степени при протоку од 12 Л/мин. Енергија судара је постављена на 10–20 еВ за скенирање ниске енергије и 30–50 еВ за скенирање високе енергије. Подаци масеног спектра су снимљени у опсегу скенирања од 50–1000 Да у режимима скенирања позитивних и негативних јона. У овој студији, брзо и ефикасно поређење између ТГЦД и стандарда је спроведено под истим ЛЦ-МС условима.

Тест раста материце

Ово је спроведено у строгом складу са препорукама Водича за негу и употребу лабораторијских животиња Националног института за здравље. Све експерименталне процедуре прегледао је и одобрио Етички комитет за животиње Харбинског универзитета трговине, Кина.

Незреле женке Кунминг мишева (око 21 дан од рођења, одбијене) тежине 12 ± 2 г, купљене су од лабораторијског центра за животиње у националној биолошкој индустрији у Чангчуну (Чангчун, Кина). Мишеви су смештени у просторији са регулисаном температуром (22 ± 2 степена) са храном и водом ад либитум. Експериментисање на животињама је започето након пет дана аклиматизације. Мишеви су гладовали преко ноћи са водом ад либитум пре интрагастричне примене тест раствора.

Мишеви су насумично подељени у 22 групе, са по 10 животиња у свакој групи. Давали су им експерименталне лекове исте запремине два пута дневно (ујутру и увече) четири дана и то:

Група 1: Интрагастрични укупни гликозиди раствора за пречишћавање Ц. десертицола (20 мЛ/кг), (запремина раствора/тежина миша),

Група ИИ: Интрагастрична дестилована вода (негативна контролна група), и

Група ИИИ: Интрагастрични диетилстилбестрол (20 уг/мЛ) (позитивна контролна група).

Петог дана сви мишеви су жртвовани. Материце су одмах уклоњене и извагане и израчунати су коефицијенти материце.

Статистичка анализа

За идентификацију статистички значајних разлика у различитим параметрима у различитим експерименталним групама коришћен је двострани т-тест парних узорака. Анализа је извршена коришћењем СПСС статистичког софтвера (СПСС фор Виндовс в21.0, СПСС Инц., УСА). Разлике су сматране статистички значајним на нивоу поузданости од 95 процената (п <>

Резултати и дискусија

Линеарност и корелација приноса актеозида и укупних гликозида

Једначина линеарне регресије приноса актеозида била је и {{0}}к – 14,75 (где је к концентрација актеозида, а и одговарајућа површина његовог пика) са коефицијентом корелације од р=1 у опсегу концентрација од 0.12−{{10}}.72 мг/мЛ. Ово је указивало на линеарну калибрациону криву. Једначина линеарне регресије укупног приноса гликозида била је и=26.074к плус 0,0866 (где је к концентрација укупних гликозида, а и њена одговарајућа површина пика) са коефицијентом корелације р { {12}}.9982 у опсегу концентрација од 0,013-0,065 мг/мЛ. Ово је такође указивало на линеарну калибрациону криву.

Методолошко истраживање

Методолошким испитивањем испитивана је прецизност, поновљивост, стабилност и опоравак узорака. У експерименту прецизности, релативна стандардна девијација (РСД) актеозида и укупних гликозида била је 1,43 процента и 0.05 процената респективно. У експерименту поновљивости, РСД актеозида и укупних гликозида износио је 0,10 процената и 1,44 процента респективно. У експерименту стабилности од 24 сата, РСД актеозида и укупних гликозида износио је 0,14%, односно 0,90%. У експерименту опоравка, опоравак актеозида је био 100,50 одсто са 2,08 одсто динара, док је опоравак укупних гликозида био 99,12 одсто са 1,65 одсто. Све динарске вредности биле су мање од 3 одсто. Ови резултати су показали добру прецизност и поновљивост. Поред тога, узорак је био стабилан 24 х. Резултати опоравка су такође у дозвољеном опсегу (95-105 одсто). Стога се ова метода може користити за одређивање приноса актеозида и укупног приноса гликозида након пречишћавања.

Једнофакторско испитивање ТГЦД

На пречишћавање ТГЦД коришћењем макропорозне смоле могу утицати многи фактори, као што су тип смоле, статички фактори адсорпције (време адсорпције, концентрација цурења и пХ раствора узорка) и услови елуирања (брзина протока, запремина и концентрација). Коришћењем адсорпционог капацитета и брзина десорпције и елуирања ТГЦД као индекса, експериментално стање је одређено на основу резултата једнофакторских експеримената. Користећи макропорозну адсорпциону смолу типа АБ-8, одређени су следећи оптимални услови: 0.5 мг/мЛ раствора узорка, пХ од 10, време статичког адсорпције 8 х, 2 БВ дестилована вода за испирање нечистоћа, 20 БВ 80% етанол као елуент и брзина протока од 0,5 БВ/мин. Специфични резултати су приказани на сликама 1−7.

ЦЦД за оптимизацију технологије пречишћавања ТГЦД

На основу резултата једнофакторског испитивања, као индекси су одабрана три фактора који значајно утичу на методу пречишћавања, и то пХ раствора узорка (к1), концентрација елуента (к2) и запремина елуента (к3). Према принципу ЦЦД-а, сваки фактор има пет нивоа. Максимални и минимални нивои ових различитих фактора одређени су према резултатима прелиминарног експеримента. Нивои фактора су приказани у табели 1, а експериментални резултати су приказани у табели 2.

Укупни приноси гликозида и актеозида су одређени да би се оптимизовала метода пречишћавања за ТГЦД. Прво, укупни приноси гликозида и актеозида су подешени на нумеричке критеријуме пожељности (д) између {{0}}-1. Затим је израчуната укупна пожељност (ОД) [ОД=(д1, д2, д3,....,дн)1/н, где је н број индекса]. СПСС21.{{10}} софтвер и софтвер за стручњаке за дизајн коришћени су за вишеструку линеарну регресију и биномно уклапање независних променљивих и ОД, са п < 0.05="" је="" узето="" у="" обзир="" статистички="" значајан="" стандард="" једначине.="" једначина="" са="" већом="" р-вредношћу="" (вишеструки="" коефицијент="" корелације)="" изабрана="" је="" као="" модел="" који="" најбоље="" одговара.="" мултиваријантна="" линеарна="" једначина="" је="" представљена="" као="" и="–" 1.02="" –="" 0.131к1="" плус="" 0.034кс2="" плус="" 0,012кс3="" (р="" {{="" 25}}.55,="" п="0.004)." биномна="" једначина="" је="" и="–" 21,92173="" –="" 0,74079к1="" плус="" 0,62914к2="" плус="" 0,041161к3="" плус="" 0,014972к1к2="" плус="" 2,06050*10-4}к1к56="" плус="" 0,62914к2="" плус="" 0,041161к3="" плус="" 0,014972к1к2="" плус="" 2,06050*{{47}{1к56к0}{5}="" ×="" 0.к08{5}="" ×="" 56="" к="" 8="" {56}}.78730="" ×="" 10-3к22="" -="" 2.89446="" ×="" 10-3к32="" (р="0.91," п="0.012)." из="" наведених="" једначина="" се="" види="" да="" је="" коефицијент="" корелације="" мултиваријантне="" линеарне="" регресионе="" једначине="" мањи.="" корелација="" између="" независних="" и="" зависних="" варијабли="" је="" веома="" ниска="" и="" сматрало="" се="" да="" је="" неповољна="" за="" коришћење="" у="" линеарном="">

Али, коефицијент корелације биномне једначине је био висок и то је резултирало добрим уклапањем. Стога је изабран биномни модел. На основу свеобухватне анализе површинске фигуре и контурне карте комбиноване са експерименталним подацима (вредност ОД близу {{0}}.6), добијен је оптимални опсег методе пречишћавања. Са слике 8 се може видети да је максимална вредност ОД генерисана када је пХ раствора узорка (А) био у опсегу од 9–10, а концентрација елуента (Б) била у опсегу од 79–85 процената. . Слика 9 показује да је максимална вредност ОД добијена када је пХ вредност раствора узорка (А) била у опсегу 9−10, а запремина елуента (Ц) била у опсегу од 20−25 БВ. Слика 10 показује да је максимална вредност ОД добијена када је концентрација елуента (Б) била у опсегу од 80-85 процената, а запремина елуента (Ц) била у опсегу од 20-25 БВ. Из свеобухватне анализе ових података, утврђено је да пХ ​​раствора узорка, концентрација елуента и запремина елуента буду у опсегу од 9-10, 80-85 процената, односно 20-25 БВ. На основу мултиваријантне биномске једначине за резултате варијабилних деривата и оптималне шеме, утврђено је да је најбоља метода пречишћавања ТГЦД при концентрацији елуента (етанола) од 85 процената и запремини од 25 БВ при пХ од 11. Одговарајућа вредност ОД је била 0,8332 , а укупан принос гликозида био је 73,0339 одсто . Визуелни утисак са слика 8-10 идентификује најбољи метод као онај у коме су интеракције између два фактора разматране, иако најбољи метод изведен из формуле препознаје онај у који су укључене интеракције између три фактора. Два резултата су се разликовала и сматрало се да је оптимална метода пречишћавања са концентрацијом елуента (етанола) од 85 процената и запремином од 25 БВ при пХ од 11.

Мерење раста материце

Утерусни коефицијент сваке групе приказан је у табели 3. У поређењу са негативном контролном групом, резултати осталих група су се значајно разликовали. Утврђено је да ТГЦД добијен из 20 различитих метода пречишћавања испољава естрогенско дејство.

Потврдни експеримент

Свеобухватни резултати ЦЦД и теста раста материце показали су да се сматрало да је оптимална метода пречишћавања са концентрацијом елуента (етанола) од 85 процената и запремином од 25 БВ при пХ од 11. Током

процесом валидације, просечан принос укупних гликозида био је 70,9150 процената. Просечно одступање између предвиђених и стварних вредности износило је 2,1180 одсто. Стога се може сугерисати да су предвидљивост и експериментални кредибилитет овог модела добри.

Идентификација ТГЦД након пречишћавања

На основу времена задржавања и МС података, спекулисан је 21 природни састојак, укључујући кампнеозид 1, 2′-ацетилактеозид, цистанозид А, цистанозид Б, сирингалид А 3'{5}} Л-рамнопиранозид, тубулозид А, тубулозид Б, салидрозид цистанозид Г, тенипозидна киселина, декафеоилактеозид, 8-епилоганска киселина, ехинакозид, цистанозид Ф, цистантубулозид Б1, изоактеозид, актеозид, цис-актеозид, канканозид Е, османтузид Б и цистанозид Ц. Време задржавања МС и МС-а. МС информације, формула и спекулисана једињења приказани су у табели 4.

К-ТОФ-МС је посебно погодан за структурну идентификацију сложених молекуларних компоненти лекова и хране јер може да обезбеди могуће елементарне композиције кроз тачну молекулску масу и структурне карактеристике фрагментираних јона. Да би се успоставила систематска структурна карактеризација, К-ТОФ-МС, МС подаци, тражење базе података и објављена референтна литература су такође коришћени за идентификацију. Молекуларна формула сваке циљне компоненте је изведена из матичног јона и упарена је са познатим једињењима. Ова формула би се даље могла одредити из њених сродних јона фрагмената. На пример, пик 5 показао је доминантан депротонирани јон на м/з 654 (Ц30Х38О16), који је био идентичан елементарном саставу кампнеозида 1. Губитак кафеоила је формиран од фрагментног јона при м/з 493, а губитак рха део је формиран од јона фрагмента на м/з 347.

Закључак

Користећи ЛЦ-К-ТОФ-МС технологију, развијена је и у потпуности валидирана једноставна и робусна метода квалитативне анализе за ТГЦД. Подаци валидације за скрининг и идентификацију природних једињења из ТГЦД били су задовољавајући. Двадесет и једно биоактивно једињење из ТГЦД је спекулисано на следећи начин: салидрозид, цистанозид Г, генипосидна киселина, декафеоилактеозид, кампнеозид 1, 8-епилоганска киселина, 2'-ацетилактеозид, цистанозид А, цистанозид Б, сирингалид{93 }}Л-рамнопиранозид, ехинакозид, цистанозид Ф, цистантубулозид Б1, изоактеозид, актеозид, тубулозид А, цис-актеозид, канканозид Е, османтузид Б, цистанозид Ц и тубулозид Б. Структурна карактеризација ових пронађених једињења може да пружи карактеризацију ових пронађених једињења њихову контролу квалитета и даљу клиничку примену због њихове естрогене активности. Ово може понудити нову и побољшану терапијску опцију за лечење постменопаузалног синдрома, чиме се избегавају нежељени ефекти и нежељене реакције терапије естрогеном.

Скраћенице

ТГЦДЦистанцхе десертицолаукупни гликозиди ЛЦ/К-ТОФ-МС течна хроматографија/квадруполна временска масена спектрометрија

Методологија површине одговора РСМ

ЦЦД централни композитни дизајн

МС масена спектрометрија ХПЛЦ/К-ТОФ-МС течна хроматографија високих перформанси/ квадруполна масена спектрометрија времена лета

АЦН ацетонитрил

БВ запремина кревета

ОД укупна пожељност

ЛЦ-МС течна хроматографија-масена спектрометрија

К-ТОФ-МС квадруполна масена спектрометрија времена лета

ТЦМ традиционални кинески лекови

РСД релативна стандардна девијација

Признања

Овај пројекат су подржале Национална фондација за природне науке Кине (бр. 81073015), Фондација за науку о природи провинције Хеилонгјианг (ЗД2017014), план обуке младих иновативних талената Колеџа у провинцији Хеилонгјианг (УНПИСЦТ- 2017209). Аутори изјављују да не постоји сукоб интереса у вези са објављивањем овог рада.

Сукоб интереса

Аутори наводе да нема сукоба интереса.

Референце

[1] Нан ЗД, Зенг КВ, Схи СП, Зхао МБ, Јианг И., Ту ПФ, Фенилетаноидни гликозиди са антиинфламаторним деловањем из стабљика Цистанцхе десертицола узгајаних у пустињи Тарим, Фитотерапиа, 2013, 89, {{4} }.

[2] Гуо И., Цао Л., Зхао К., Зханг Л., Цхен Ј., Лиу Б., Зхао Б., Прелиминарне карактеристике, антиоксидативна и хепатопротективна активност полисахарида из Цистанцхе десертицола, Међународни часопис за биолошке макромолекуле , 2016, 293, 678-685.

[3] Нан ЗД, Зхао МБ, Зенг КВ, Тиан СХ, Ванг ВН, Јианг И., Ту ПФ, Анти-инфламаторни иридоиди из стабљика Цистанцхе десертицола узгајаних у пустињи Тарим, Кинески часопис природних лекова, 2016, 14, 61-65.

[4] Пенг Ф., Цхен Ј., Ванг Кс., Ксу Ц., Лиу Т., Ксу Р., Промене у нивоима фенилетаноидних гликозида, антиоксидативна активност и друге особине квалитета у резовима Цистанцхе десертицола парном обрадом, хемијски и Пхармацеутицал Буллетин (Токио), 2016, 64, 1024-1030.

[5] Ванг Т., Зханг Кс., Ксие В., Цистанцхе десертицола ИЦ Ма, „Десерт Гинсенг“: рецензија, Тхе Америцан Јоурнал оф Цхинесе Медицине, 2012, 40, 1123-1141.

[6] Сонг И., Сонг К., Ли Ј., Зханг Н., Зхао И., Лиу Кс., Јианг И., Ту П., Интегрисана стратегија за квантитативно разликовање камилице измеђуЦистанцхе десертицолаи Ц. тубулоса користећи течну хроматографију високих перформанси-хибридну масну спектрометрију са троструким квадруполним линеарним јонским замкама, Јоурнал оф Цхроматограпхи А, 2016, 1429, 238-247.

[7] Ли И., Пенг И., Ванг М., Зхоу Г., Зханг И., Ли Кс., Брзи скрининг и идентификација разлика између метаболитаЦистанцхе десертицолаи водени екстракт Ц. тубулоса код пацова комбинованом анализом препознавања образаца УПЛЦ-К-ТОФ-МС, Јоурнал оф Пхармацеутицал анд Биомедицал Аналисис, 2016, 131, 364-372.

[8] Ли ВЛ, Сун КСМ, Сонг Х., Динг ЈКС, Баи Ј., Цхен К., ХПЛЦ/К-ТОФ-МС идентификација апсорбованих састојака и њихових метаболита у серуму и урину пацова након оралне примене Цистанцхеа десертицола Ектрацт, Јоурнал оф Фоод Сциенце, 2015, 80, Х2079-2087.

[9] Алмаси А., Даргахи А., Мохамади М., Биглари Х., Амириан Ф., Раеи М., Уклањање пеницилина Г комбинацијом сонолизе и фотокаталитичког (соно-фотокаталитичког) процеса из воденог раствора: оптимизација процеса користећи РСМ (Методологију површине одговора), Елецтрон Пхисициан, 2016, 8,

[10] 2878-2887. Хоу В., Зханг В., Цхен Г., Луо И., Оптимизација услова екстракције за максималну фенолну, флавоноидну и антиоксидативну активност из листова Мелалеуца брацт дата користећи методологију површине одговора, ПлоС Оне, 2016, 11,

[11] е0162139. Пооралхоссини Ј., Гхаеди М., Зањанцхи МА, Асфарам А., Избор екстракције уз помоћ ултразвука у комбинацији са спектрофотометријом за брзо одређивање галне киселине у узорцима воде: Централни композитни дизајн за оптимизацију варијабли процеса, Ултрасоницс Соноцхемистри, 2017, 34 , 692- 699.

[12] Хан Л., Боакие-Ииадом М., Лиу Е., Зханг И., Ли В., Сонг Кс., Фу Ф., Гао Кс., Карактеризација структуре и идентификација фенилетаноидних гликозида изЦистанцхес десертицола ИЦ Маод УХПЛЦ/ЕСИ-КТОФ-МС/МС, Пхитоцхемицал Аналисис, 2012, 23, 668-676.

[13] Лу Д., Зханг Ј., Ианг З., Лиу Х., Ли С., Ву Б., Ма З., Квантитативна анализа Цистанцхес Херба користећи течну хроматографију високих перформанси у комбинацији са детекцијом диодног низа и високо- масена спектрометрија резолуције у комбинацији са хемометријским методама. Јоурнал оф Сепаратион Сциенце, 2013, 36, 1945-1952.

[14] Ли ВЛ, Цхен К., Ианг Б., Гао С., Зханг ЈЈ, Скрининг фитоестрогених ефикасних екстраката и дозаЦистанцхе десертицола, Кинески биљни лекови, 2013, 5, 292-296.

[15] Ли ИП, Хуанг ФР, Донг Ј., Ксиао Ц., Ксиан РИ, Ма ЗГ, Зхао Ј., Брза идентификација Цистанцхе преко технологије снимања флуоресцентног спектра у комбинацији са анализом главних компоненти и разликовањем Фисхер, Гуанг Пу Ксуе Иу Гуанг Пу Фен Кси, 2015, 35, 689-694.