Протеомика и анализе цитокина разликују случајеве мијалгијског енцефаломијелитиса/синдрома хроничног умора од контролног дела 2.

Корелације нивоа протеина са клиничким метаподацима указују на њихов значај у болесном стању

Сви протеини су анализирани на корелације са клиничким метаподацима коришћењем истих метода које су претходно описане. Само значајни резултати након прилагођавања за вишеструка поређења (к<0.1) are shown in Table 2. There were significant correlations between plasma cytokines, plasma proteomics, and the clinical metadata, but none were found with the EV cytokine dataset (Table 2).

Цистанцхе може деловати као средство за побољшање умора и издржљивости, а експерименталне студије су показале да децокција од Цистанцхе тубулоса може ефикасно заштитити хепатоците јетре и ендотелне ћелије оштећене код мишева који пливају са тежином, појачати експресију НОС3 и промовисати гликоген у јетри. синтезу, чиме се постиже ефикасност против умора. Екстракт Цистанцхе тубулоса богат фенилетаноидним гликозидима може значајно смањити серумску креатин киназу, лактат дехидрогеназу и нивое лактата и повећати ниво хемоглобина (ХБ) и глукозе код ИЦР мишева, а то би могло играти улогу против умора смањујући оштећење мишића и одлагање обогаћивања млечне киселине за складиштење енергије код мишева. Таблете са спојем Цистанцхе Тубулоса значајно су продужиле време пливања током ношења тежине, повећале резерву гликогена у јетри и смањиле ниво урее у серуму након вежбања код мишева, показујући ефекат против умора. Декокција цистанцхиса може побољшати издржљивост и убрзати отклањање умора код мишева који вежбају, а такође може да смањи повишење серумске креатин киназе после оптерећења и да одржи ултраструктуру скелетних мишића мишева нормалном после вежбања, што указује да има ефекте. за јачање физичке снаге и против умора. Цистанцхис је такође значајно продужио време преживљавања мишева отрованих нитритима и побољшао толеранцију на хипоксију и умор.

Кликните на умор

Зашто ћемо бити уморни? Како можемо да решимо проблеме са умором?

【Контакт】Имејл: george.deng@wecistanche.com / ВхатсАпп:008613632399501/Вецхат:13632399501

У оквиру скупа података о цитокини у плазми, и фактор стимулације колоније 2 (ЦСФ2) и лептин су били у негативној корелацији са полом и у позитивној корелацији са БМИ у МЕ/ЦФС и контролним групама (Слика 6а). Занимљиво је да особе са МЕ/ЦФС и ИБС имају веће концентрације ЦСФ2 и лептина од људи са МЕ/ЦФС и без ИБС, а ове корелације нису примећене у контролној групи (слика 6б).

МЕ/ЦФС кохорта је такође открила јединствене значајне корелације са подацима здравственог упитника који се односе на физичку функцију (СФ{{0}}) и умор (МФИ-20) које нису пронађене у контролној групи. ЦСФ2 и лептин су били у негативној корелацији са физичком функцијом (р=− {{10}}.539, к=0.002 за ЦСФ2; р{{9 }}− 0,558, к=0.002 за лептин) и сажетак физичких компоненти (р=− 0,459, к=0,035 за ЦСФ2; р=− 0,445 , к=0.035 за лептин) и позитивно корелира са општим умором (р=0.439, к=0.047 за ЦСФ2; р=0.436, к =0.047 за лептин) (табела 2, слика 6ц).

Пронашли смо друге значајне корелације између цитокина и клиничких података код МЕ/ЦФС субјеката које нису нађене у контролама: ЦЦЛ2, ЦКСЦЛ1{{30}} и ЦЦЛ11 су били у позитивној корелацији са годинама (р{{3} }.440, к=0.060 за ЦЦЛ2; р=0.394, к=0.099 за ЦКСЦЛ10; р=0.431, к=0 .060 за ЦЦЛ2) (слика 6д). Оба (ТНФ и ИЛ1РА су били у позитивној корелацији са БМИ (р=0.543, к=0.001 и р=0.468, к=0.010 респективно), и у негативној корелацији са категоријом физичке функције СФ-36 (р=− 0,508, к=0.004 и р=− 0,480, к=0. 007 за ТНФ и ИЛ1РА респективно) (слика 6е). На крају, ИЛ13 је у позитивној корелацији са резултатом смањене активности из упитника МФИ- 20 (р=0.482, к=0.025 ).

Као што је горе поменуто, пронађене су додатне значајне корелације између скупа података о протеомици плазме и клиничких метаподатака. Било је 9 значајних корелација у контролној групи и само две код испитаника МЕ/ЦФС (Табела 2, доњи део). У контролним узорцима, протеин С (ПРОС1) и Фц рецептор сличан 3 (ФЦРЛ3) имали су негативну корелацију са виталношћу (р=− 0.590, к=0 .015 за ПРОС1, р=− 0.538, к=0.039 за ФЦРЛ3). Поред тога, ПРОС1 је имао негативну корелацију са резимеом физичке компоненте СФ-36 (р=− 0,608, к=0.008) и позитивну корелацију са МФИ-20 оценом општег умора (р=0.590, к=0.016). Протеин за трансфер холестерола (ЦЕТП) је био у позитивној корелацији са општим умором (р=0.547, к=0.032) и укупним резултатима МФИ-20 (р{{35} }.557, к=0.025), а подјединица хемоглобина Алфа 1 (ХБА1) је била у негативној корелацији са два иста резултата (р=− 0.558, к=0.046 и р=− 0,556, к=0.025 респективно) (слика 7а). У МЕ/ЦФС групи, члан породице Серпин 5 (СЕРПИНА5) је био у позитивној корелацији са општим здрављем (р=0.646, к=0.004) и друштвеним функционисањем (р=0 .593, к=0.027) из СФ-36 упитника (слика 7б).

Робусна линеарна регресија открива додатне односе између одређених протеина и клиничких информација

Да бисмо боље разумели однос између протеина и метаподатака, извршили смо робусну линеарну регресију и т-тестове за процењене коефицијенте. Извршена је робусна линеарна регресија за ЕВ цитокине, цитокине плазме и плазма протеомику, респективно. Сваки модел је укључивао одређени ниво протеина као предвиђену варијаблу и кохорту (МЕ/ЦФС или контрола), пол, старост, БМИ и синдром иритабилног црева (ИБС) као коваријату. Интеракције између кохорте и коваријата метаподатака су такође укључене у модел. Интеракције тестирају хипотезу да је однос између метаподатака и нивоа протеина другачији у МЕ/ЦФС него у контролној групи. Значајни ефекти су сажети у табели 3. Стандардна пракса у биостатистици је да се оба главна ефекта укључе кад год две варијабле имају статистички значајну интеракцију. Образложење је да интеракција показује да варијабле имају ефекте чак и ако главни ефекат не постигне статистички значај. Пратили смо ову праксу. У табели 3, мушкарац је лажна (индикатор или 0–1) променљива која је једнака 1 за мушкарце и 0 за жене. Слично томе, МЕ/ЦФС је лажна променљива која је 1 или 0 за случајеве или контроле, респективно, а ИБС је лажна променљива једнака 1 или {{10}} за субјекте са или без ИБС, респективно. МЕ/ЦФС: Старост је производ МЕ/ЦФС и Старост и тако је једнака 1 за случајеве МЕ/ЦФС и једнака 0 за контроле. МЕ/ЦФС: Мушки је производ две лажне варијабле и тако је једнак 1 за мушкарце у МЕ/ЦФС групи и једнак 0 за све остале субјекте. МЕ/ЦФС:(+) ИБС је једнак 1 за случајеве МЕ/ЦФС са ИБС и 0 у супротном.

У узорцима ЕВ цитокина, старост је била значајна за предвиђање нивоа ЦКСЦЛ1 ( =− 0.013, к=0.035) и нивоа ЦЦЛ11 ( =0.032, к{ {9}}.035). Дакле, ЦКСЦЛ1 се смањује са годинама, али ЦЦЛ11 расте са годинама. (Табела 3).

У цитокинима плазме, и БМИ и мушкарци су значајно предвидели нивое лептина и ЦСФ2. Ефекат за лажну варијаблу Мале је разлика између средњих вредности за мушкарце и жене. На пример, средња вредност варијабле Лептин (или ЦСФ2) је, све остало једнако, 1,119 (или 1,230) нижа за мушкарце у поређењу са женама. И за ЦЦЛ2 и за ЦСФ3, главни ефекат старости и термин интеракције између старости и кохорте били су значајни. Пресретци за регресију ЦЦЛ2 на старост су 0.690 и 0.690− 2.696= − 2.{{27} }06 за контроле и случајеве, респективно. За свако једногодишње повећање старости, просек ЦЦЛ2 ће се смањити за 0.037 у контролама и повећати за 0.075–0.037=0.038 у случајевима. Интерцепти за регресију ЦСФ3 на старост су 0,576 и 0,576−1.994=− 1,418 за контроле и случајеве, респективно. За свако једногодишње повећање старости, просек ЦФС3 ће се смањити за 0,047 у контролама и повећати за 0,075–0.047=0.028 у случајевима.

У подацима о протеомици плазме, старост је такође била значајна за предвиђање нивоа САА1 ( =0.047, к=0.049). За ПФН1, интеракција између МЕ/ЦФС и секса је била значајна (=− 1,901, к=0.03{{20} }). Средња вредност ПФН1 је 0.809 за женске контроле, 0.809−0.996=− 0.187 за женске случајеве, 0.809+0 .081=0.890 за мушке контроле и 0.809+0.081−0.996−1.901=− 2.007 за мушке случајеве. Дакле, средњи ПФН1 је већи у контролама него у случајевима за оба пола, али је разлика много већа код мушкараца (0.809+0.187=0.996 за жене наспрам 0.890+2. 007=2.897 за мушкарце).

За ИГХА2, интеракција између МЕ/ЦФС и ИБС је била значајна (=3.467, к < 0.001). Средња вредност ИГХА2 је 0.454 за контроле без ИБС, {{20}}.454−2.048=− 1.594 за случајеве МЕ/ЦФС без ИБС, {{33 }}.454−2.811=− 2.357 за контроле са ИБС-ом и 0.45 4−2.048−2.811+3.{101} {26}}− 0.938 за случајеве са ИБС. Према томе, средња вредност ИГХА2 је већа за контролну групу него за случајеве за субјекте без ИБС-а, али виша за случајеве од контрола за субјекте са ИБС. За ЛРГ1, интеракција између МЕ/ЦФС и ИБС је била значајна (=3.093, к < 0.001). Средња вредност ЛРГ1 је 0,261 за контроле без ИБС, 0,261−1.082=− 0,821 за случајеве МЕ/ЦФС без ИБС, 0,261−2.502=− 2,241 за контроле са ИБС и 0,261−1,082 −2.502+3.093= 0.230 за случајеве са ИБС. Видимо да је средња вредност ЛРГ1 већа у контролама од случајева за субјекте без ИБС, али већа у случајевима од контрола за субјекте са ИБС (Табела 4).

ИБС има супротне ефекте у случајевима и контролама на ИГХА2 и ЛРГ1 (Табела 4). Иако су ове разлике статистички значајне, треба напоменути да је постојао само један контролни субјект са ИБС.

Три приступа машинском учењу резултирају предиктивним и дискриминативним моделима

Прва 20 протеинска аналита и вредности значаја карактеристика за сваки од три приступа машинском учењу могу се наћи у табели 5. Све три методе су имале одличне перформансе у разликовању МЕ/ЦФС од контрола које користе прва 2{{ 16}} протеинских аналита са 250 реплика петоструке унакрсне провере. Слика 8 приказује РОЦ криве и АУРОЦ вредности из ова три класификатора са 20 најбоља протеина рангираних у мерењима важности. КСГБоост класификатор је показао најбоље резултате са високим степеном тачности (86.1%, Додатни фајл 1: Слика С3а) са унакрсно валидираном АУРОЦ вредношћу од 0.947 (95% ЦИ { {26}}.895–0.998). Штавише, коришћењем 8 најбољих протеина из сваког класификатора, логистичка регресија (ЛАССО) је дала најбоље резултате са АУЦ од 0.873 (95% ЦИ 0.792–0.953) и прецизношћу од 78.6% (Слика 8б и Додатни фајл 1: Слика С3б). Коначно, Рандом Форест са 7 протеинских аналита заједничких за све три листе 20 најбољих (подебљани протеини у табели 5) разликовао је МЕ/ЦФС од контрола са АУРОЦ вредношћу од 0,891 (95% ЦИ 0,817–0,966) и прецизношћу од 79,1% (Сл. 8ц и Додатни фајл 1: Слика С3ц).

Дискусија

У овој студији користили смо узорке и податке од 98 од 100 испитаника који су претходно дали узорке који су анализирани на фекалну метагеномику и цитокине плазме [26], као и на протеине плазме анализиране масеном спектрометријом [14]. Штавише, екстрацелуларни везикули су изоловани из ових 98 узорака и открили смо да су средња величина и концентрације честица значајно веће у МЕ/ЦФС (слика 2). Иако је претходни извештај користећи исти метод пречишћавања ЕВ као и ова студија открио да је средња величина МЕ/ЦФС ЕВ смањена [42], аутори су анализирали ЕВ изоловане од 10 МЕ/ЦФС пацијената и 5 здравих контрола наспрам 49 МЕ/ ЦФС и 49 контрола у овој студији, нису користиле тромбин за уклањање фибриногена и користиле су ниске центрифугалне силе за пелетирање ЕВ (1500 г наспрам 12,000 г у овој студији). Све заједно ово може објаснити различите резултате уочене у нашој тренутној студији. Коначно, наши резултати су потврдили друге налазе који извештавају о већим концентрацијама везикула у МЕ/ЦФС [24, 25, 42] и ова запажања се такође виде у стањима као што су Алцхајмерова болест [17] и цереброваскуларна болест [20].

Наш рад показује вредност коришћења вишеструких тестова на истим узорцима, као и важност корелације са клиничким подацима. То нам је омогућило да идентификујемо неколико асоцијација одређених протеина са симптомима пацијента. Важно је да демонстрирамо да подаци могу да разликују пацијенте и контроле са високом прецизношћу. Неки су дуго времена на МЕ/ЦФС погрешно гледали као на психолошку болест. Могућност раздвајања пацијената и контрола кроз анализе плазме је снажна демонстрација биолошке природе болести. Резиме наших експерименталних тестова и кључних налаза приказан је на слици 9.

Наша тренутна анализа 98 узорака слаже се са претходним поређењем цитокина плазме у 100 МЕ/ЦФС и контролама, које нису идентификовале никакве значајне разлике између кохорти након прилагођавања за вишеструко тестирање [26]. Насупрот томе, идентификовали смо 17 ЕВ цитокина који разликују пацијенте и контролне групе са прилагођеним п-вредностима мањим од 0,2, што је више код МЕ/ЦФС субјеката. Од ових 17 протеина, за већину (10 од 17) се зна да су проинфламаторни цитокини/хемокини (ТНФ, ИЛ1, ЦКСЦЛ8, ЦКСЦЛ1, ИЛ15, ЦЦЛ7, ИЛ17, ЦЦЛ5, ИЛ1 и ИЛ1Р1), 5 су сродни на адаптивни имунитет (ИЛ2, ЦСФ2, ИЛ3, ИЛ4 и ИЛ7), ИЛ12п40 има антиинфламаторна својства, а НГФ је и про- и антиинфламаторни. Виши нивои проинфламаторних цитокина су у складу са претходним извештајима [43–45].

Иако разлике у нивоима ЕВ цитокина нису достигле статистички значај након корекције за вишеструка поређења у претходној пилот студији са само 38 субјеката, 13 од 17 ЕВ цитокина у овој студији такође је пронађено на вишим нивоима у ЕВ код МЕ/ЦФС субјеката у поређење са контролама [25]. Најзначајнија разлика је била ИЛ2 (к=0.007, слика 3). ИЛ2 је излучени цитокин који производе активирани ЦД4+ и ЦД8+Т лимфоцити и промовише снажну пролиферацију активираних Б-ћелија и последично производњу имуноглобулина. Он игра кључну улогу у регулисању адаптивног имуног система тако што контролише опстанак и пролиферацију регулаторних Т-ћелија. Утврђено је да су нивои ИЛ2 виши у цереброспиналној течности [46] и плазми пацијената са МЕ/ЦФС [47]. Виши нивои ИЛ2 пронађени у ЕВ у овој студији могу бити део специфичног имунолошког одговора у МЕ/ЦФС. Неколико цитокина/хемокина за које је примећено да су дисрегулисани или производе Б ћелије или су такође регулатори Б ћелија (нпр. ЦКСЦЛ1 и ЦКСЦЛ12).

Корелације цитокина са другим цитокинима пружају информације о мрежама интеракција између сигналних молекула. Неколико других студија је показало да се мреже цитокина из плазме или екстрацелуларних везикула разликују између МЕ/ЦФС субјеката и контрола [25, 41, 44, 48]. Одабрали смо да прикажемо корелације између три типа података: плазма и ЕВ цитокини и плазма протеомика — користећи корелограме. Инспекција визуелног приказа ових интеракција протеин-протеин одмах открива да постоје позитивне корелације између ЕВ цитокина и између цитокина у плазми које се јављају у случајевима, али не и у контроли и обрнуто (слика 5). Посебно упечатљиво запажање је већи број позитивних корелација између цитокина у плазми у МЕ/ЦФС него у контролама (Слика 5б), што указује да је сигнализација цитокина значајно другачија, што можда одражава инфламаторно окружење.

Седамдесет један протеин окарактерисан масеном спектрометријом показао је значајну корелацију са другим протеинима плазме (слика 5ц). На пример, Ф2 је показао 31 позитивну корелацију са другим протеинима, од којих је једанаест примећено у случајевима, али не и контролама. Ф2 је фактор коагулације ИИ или тромбин и претвара фибриноген у фибрин и активира факторе В, ВИИ, ВИИИ и КСИИИ. Тромбин подстиче активацију и агрегацију тромбоцита, али се такође сматра да има и друге функције током упале и зарастања рана [49].

Упркос томе што нисмо приметили значајне разлике у нивоима цитокина у плазми између две кохорте, приметили смо корелације цитокина у плазми са клиничким подацима. ЦСФ2, такође познат као фактор стимулације колоније гранулоцитних моноцита (ГМ-ЦСФ), нижи је код мушкараца иу МЕ/ЦФС иу контролама и повећава се са БМИ у обе кохорте према робусној линеарној регресији и корелационим анализама (слика 6а, табеле 2 и 3). У МЕ/ЦФС кохорти, са повећањем ЦСФ2, резултати на СФ36 Физичкој функцији и МФИ скали замора указују на већи утицај физичких и симптома умора, респективно. Повећање ГМ-ЦСФ повезано је са хроничном инфламацијом [50]. ГМ-ЦСФ индукује класичне моноците да се диференцирају у дендритичке ћелије и макрофаге изведене из моноцита ин витро [51]. Класични моноцити показују јединствени образац експресије гена у МЕ/ЦФС у поређењу са контролама [52], а повишени ГМ-ЦСФ би могао бити сигнални фактор укључен у овај одговор.

Повећање нивоа три цитокина, ЦЦЛ2, ЦКСЦЛ10 и ЦЦЛ11, било је повезано са повећањем старости само у МЕ/ЦФС кохорти, према Спеармановим корелацијама. ЦЦЛ2, такође познат као МЦП-1 (Моноците Цхемоаттрацтант Протеин-1), привлачи моноците преко ендотела у ткива [53], а такође може бити фактор у измењеном профилу експресије моноцитног гена [54]. Такође је примећено да се ЦЦЛ2 смањује са годинама у укупној кохорти и робустном линеарном регресијом и Спеармановом корелацијом, али се повећава у МЕ/ЦФС кохорти са повећањем старости, према Спеармановој корелацији (Слика 6д, Табела 3). Користећи робусну линеарну регресију, ЦЦЛ11 у плазми се није значајно повећавао са годинама, али се предвиђало да ће ЕВ ЦЦЛ11 бити већи са повећањем старости. ЦКСЦЛ10 (ИП10) је такође укључен у миграцију ћелија, посебно у привлачење макрофага, моноцита и активираних Т и НК ћелија [55]. Познато је да се ЦЦЛ11, такође познат као еотаксин, повећава са годинама, а виши нивои су повезани са смањеном неурогенезом [56]. Две велике студије су претходно приметиле повезаност лептина, ГМ-ЦСФ, ИП10 и еотаксина са озбиљношћу МЕ/ЦФС [43] или већом еотаксином у дуготрајним случајевима МЕ/ЦФС [41]. Скоро сви субјекти МЕ/ЦФС у овој студији били су болесни више од 3 године.

Виши лептин је у корелацији са женским полом и вишим БМИ и код пацијената и код контролне групе помоћу робусне линеарне регресије и корелационе анализе (Табеле 2 и 3). Виши лептин је такође повезан са ИБС-ом у кохорти пацијената (слика 6б). Пораст лептина је такође у корелацији са лошијим резултатима на мерама физичке функције СФ36 и скали замора МФИ (Слика 6ц). Лептин је раније био у корелацији са умором и озбиљношћу у МЕ/ЦФС [43, 54]. Повећани нивои другог инфламаторног цитокина, ТНФ, такође корелирају са нижим резултатима физичке функције пацијената на СФ36 и раније је пријављено да су повишени у МЕ/ЦФС [41, 57, 58] (Слика 6е).

Виши нивои ИЛ1-РА, који антагонизује ИЛ1 инфламаторне цитокине, били су повезани са вишим БМИ и нижом физичком функцијом СФ-36 у случајевима МЕ/ЦФС (слика 6е). Иако се ИЛ1-РА може сматрати антиинфламаторним, познато је да су нивои ИЛ1-РА виши код гојазности [59] и да се виши нивои сматрају маркером за метаболичку дисрегулацију [60]. , што би могло резултирати нижом физичком способношћу.

Приметили смо да су нижи нивои антиинфламаторног цитокина ИЛ13 повезани са нижом активношћу у случајевима МЕ/ЦФС. Раније је пријављено да је ИЛ-13 нижи код жена са МЕ/ЦФС у односу на контролне групе [61]. Насупрот томе, већи ИЛ13 је био у корелацији са повећаном озбиљношћу симптома у једној студији [43], док у другој није примећена разлика између случајева и контрола [41].

【Контакт】Имејл: george.deng@wecistanche.com / ВхатсАпп:008613632399501/Вецхат:13632399501