Квантификација дегенерације неурита са повећаном прецизношћу и ефикасношћу у ин витро моделу Паркинсонове болести, део 2

Резултати

Успостављање модела ћелијске културе дегенерације неурита повезане са ПД

Да бисмо развили метод за истраживање дегенерације неурита у моделу ћелијске културе ПД, користили смо култивисане ЛУХМЕС ћелије, популацију условно бесмртних, хуманих мезенцефалних ћелија. Након диференцијације, ЛУХМЕС ћелије постају постмитотичне, усвајају профил експресије гена карактеристичан за зреле допаминергичке неуроне и развијају неуронску морфологију са неуритима који се протежу до 500 мм у дужину (слика 1А; Лотхариус ет ал., 2005; Сцхолз ет ал. , 2011; Краемер ет ал., 2021).

Неуродегенерација, стање у којем нервне ћелије мутирају или умиру, уско је повезано са памћењем. У моделима ћелијске културе, можемо контролисати услове културе да бисмо ублажили експресију неуродегенерације и тако побољшали перформансе памћења.

Студије су показале да хомеостаза нервних ћелија игра важну улогу у преживљавању ћелија и функционисању система. Можемо побољшати стабилност ћелија контролисањем фактора као што су хранљиве материје и фактори раста у медијуму културе. Истовремено, обратите пажњу на одржавање чистоће и контроле температуре у окружењу културе како бисте спречили да ћелије буду поремећене и оштећене околином.

Поред тога, у моделу ћелијске културе, такође можемо да убризгамо одређена једињења или лекове у ћелије да смањимо експресију неуромодулације, чиме се побољшава стопа преживљавања и перформансе памћења ћелија. Ова техника се такође широко користи у проучавању неуродегенеративних болести.

Укратко, неуродегенерација има важан утицај на стабилност ћелије и функцију система, а технологија ћелијске културе је добар метод истраживања модела, који може спровести дубинско истраживање и истраживање односа између неуродегенерације и памћења. Можемо да ублажимо перформансе неуромодулације култивисањем контроле животне средине, убризгавањем лекова у ћелије, итд., Да бисмо побољшали преживљавање ћелија и перформансе памћења и обезбедили свеобухватнију основу за проучавање неуродегенеративних болести. Види се да треба побољшати своје памћење. Цистанцхе може значајно да побољша наше памћење, јер Цистанцхе може да регулише и равнотежу неуротрансмитера, као што је повећање нивоа ацетилхолина и фактора раста, који су веома важни за памћење и учење. Поред тога, месо такође може побољшати проток крви и подстаћи испоруку кисеоника, што може осигурати да мозак добије довољну исхрану и енергију, чиме се побољшава виталност и издржљивост мозга.

Кликните на суплементе да бисте побољшали памћење

Због супериорних оптичких квалитета стакла у поређењу са пластиком, културе су постављене на стакленим предметима који садрже осам комора за медије. На основу претходних извештаја (Лотхариус ет ал., 2005; Сцхолз ет ал., 2011; Куровска ет ал., 2014), првобитно смо покушали да успоставимо културе на стакалцима у комори обложеним ПЛО и фибронектином; међутим, такве културе су показале недостатак адхезије и ниску одрживост. Као резултат тога, тестирали смо да ли би облагање додатним супстратима побољшало одрживост ЛУХМЕС ћелијских култура постављених на стакленим површинама.

ЛУХМЕС ћелијске културе су успостављене на плочицама које нису биле премазане или обложене ПЛО и фибронектином, ПДЛ и ламинином, или комбинацијом сва четири супстрата. Анализа одрживих језгара флуоресцентном микроскопијом открила је да облагање стакалца значајно утиче на одрживост култура [Фриедман к2 (3)=18, п, 0.0001], са пост хоц анализама вишеструког поређења које откривају да стакалца обложени комбинацијом сва четири горе поменута супстрата дају значајно већу стопу виталних ћелија у поређењу са стакалцима обложеним само ПЛО и фибронектином (п= 0.0437; слика 1Б, Ц).

Након идентификације оптималних супстрата за облагање за култивисање ЛУХМЕС ћелија на стакленим предметима, проценили смо ефекте густине ћелија на погодност култура за мерење дегенерације неурита. ЛУХМЕС ћелије су култивисане у медијуму за диференцијацију са густином наношења од 57.500 ћелија по бунарчићу, 115,000 ћелија по бунарчићу, или 230000 ћелија по бунарчићу, а петог дана диференцијације ћелије су су фиксирани са 4% ПФА и снимљени фазно-контрастном микроскопијом.

Густина од 57.500 ћелија по бунарчићу резултирала је културама са слабо умреженим неуритима и неправилном морфологијом неурита, док су културе успостављене са густином плоча од 230,000 ћелија, иако одрживе, садржале густину неурита превисоку за прецизно мерење неурита. Средња густина ћелија од 115,000 ћелија по бунарчићу обезбедила је високу одрживост и добро одвојене аксонске тракте што је погодно за тачна мерења дегенерације неурита (слика 1Д).

Да бисмо моделирали дегенерацију неурита повезану са ПД ин витро, изложили смо диференциране ЛУХМЕС ћелије 6-ОХДА, широко коришћеном неуротоксину који промовише оксидативни стрес и дегенерацију катехоламинергичких неурона (Бове и Периер, 2012). Излагање диференцираних ЛУХМЕС ћелија 6-ОХДА промовише дозно-зависно повећање дегенерације неурита, при чему 5,0 мМ 6-ОХДА и 7,5 мМ 6-ОХДА изазивају умерену и тешку дегенерацију неурита, респективно (Сл. 2Ф). Да бисмо квантификовали дегенерацију неурита у културама ЛУХМЕС ћелија изложених 6-ОХДА, користили смо широко цитирану методу у којој су слике култура са фазним контрастом бинаризоване, ћелијска тела на сликама се дигитално уклањају, а алгоритам анализатора честица ИмагеЈ се примењује за мерење површине фрагмената неурита. Фрагментирана подручја неурита се затим сабирају и деле са укупном површином неурита да би се одредио ДИ (Слика 2А–Е; Сасаки ет ал., 2009; Краемер ет ал., 2014; Ди Стефано ет ал., 2015; Хилл ет ал. ., 2018; Геислер ет ал., 2019).

Као што се очекивало, излагање диференцираних ЛУХМЕС ћелија 6- ОХДА је изазвало повећање ДИ (Ф(3,24)= 119.8, п=0.0001, Р{ зависно од дозе {8}}.9374; Слика 2Г). Међутим, током анализа ћелија изложених 6-ОХДА, приметили смо неколико проблема за које се чинило да негативно утичу на тачност и ефикасност мерења ДИ. Стога смо настојали да оптимизујемо ову уобичајену методу за извођење ДИ мерења, коју од сада називамо традиционалним ДИ методом, да генеришемо протокол који омогућава ефикасније мерење фрагментације неурита.

Смањење вештачке фрагментације повезане са бинаризацијом микрографа

Док смо користили традиционалну ДИ методу, често смо примећивали проблем у којем су се интактни неурити на сликама фазног контраста појављивали фрагментирани у њиховој одговарајућој бинаризованој слици (слика 3А). Ова вештачка фрагментација је првенствено утицала на неурите са малом израженошћу. Стога смо истражили да ли се проблем може смањити процедурама које побољшавају контраст слике. Да бисмо побољшали контраст слике, прво смо снимили слике неурита користећи различите интензитете светлости да бисмо одредили ниво осветљености слике који би произвео оптимални контраст.

Слике снимљене са оптималним интензитетом светлости су затим подвргнуте даљем побољшању контраста коришћењем ИмагеЈ за примену ЛУТ-а са минималним и максималним вредностима интензитета од 90 и 205, респективно. Укључивање ових побољшања контраста обезбедило је умерено тачнију репрезентацију неурита у бинаризованим сликама генерисаним из слика са фазним контрастом (слика 3Б). Ипак, квантитативна анализа бинаризованих слика здравих неурита показала је да побољшања контраста нису значајно смањила вештачку фрагментацију (п=0.9999; слика 3Д). Стога смо затим истражили да ли би употреба имунофлуоресцентног снимања произвела слике са супериорним контрастом и на тај начин олакшала производњу прецизнијих бинаризованих слика неурита са смањеном вештачком фрагментацијом.

Слајдови описани на слици 2, са фиксираним ЛУХМЕС ћелијама изложеним различитим концентрацијама 6- ОХДА, имунобојени су на протеин цитоскелета б ИИИ-тубулин, снимљени помоћу флуоресцентне микроскопије и анализирани од стране слепог истраживача за вештачку фрагментацију (Сл. 3Ц). Квантитативна анализа бинаризованих слика добијених са флуоресцентних микрографа и одговарајућих микрографа са фазним контрастом открила је да је тип микроскопије утицао на нивое вештачке фрагментације [Фриедман к2 (3)=15.44, п, 0.0001] . Конкретно, флуоресцентне микрографије су дале бинаризоване слике са значајно смањеном вештачком фрагментацијом у поређењу са онима са микрографа са фазним контрастом (п=0.0016; слика 3Д).

Као резултат тога, слике здравих култура дале су значајно ниже резултате ДИ када су коришћени флуоресцентни микрографи уместо микрографи са фазним контрастом (Ф(1,8)= 131.4, п=0.{{12} }001, Р2=0.1442; слика 3Е). Штавише, приметан свеукупни тренд је да је кратка промена између средњих вредности ДИ повезаних са здравим културама (третираним возилом) и културама које показују дегенерацију неурита (третиране са 5,0 или 7,5 мМ 6-ОХДА) већа када се мере помоћу флуоресцентних микрографа него када се добије из микрографа фазног контраста (слика 3Е). Ово се десило упркос флуоресцентним микрографијама култура са умереном дегенерацијом неурита (индукованом излагањем 5 мМ 6-ОХДА) које имају значајно ниже резултате ДИ од одговарајућих фазних слика због смањења вештачке фрагментације (п=0.0001 , д=0.6312).

Оптимизирање параметара за фрагментирану и тоталну детекцију неурита
Традиционални метод за извођење ДИ мерења укључује употребу додатка за анализу честица за ИмагеЈ са параметрима величине од 20 10,000 пиксела за откривање фрагмената неурита. Међутим, приметили смо да анализатор честица није открио велики део фрагмената неурита када су користили ове широко цитиране параметре (Схин ет ал., 2012; Ди Стефано ет ал., 2015; Сасаки ет ал., 2016; Лорето ет ал. , 2020; Схин и Цхо, 2020) за мерење дегенерације неурита на микрографијама фазног контраста ЛУХМЕС ћелија изложених 6-ОХДА, генерисаним као што је описано на слици 2.

Стога смо поново анализирали слике из тог скупа података користећи различите минималне границе величине за детекцију честица да бисмо одредили оптималне параметре за идентификацију фрагмената неурита. Од квалитативне процене бинаризованих слика генерисаних из микрографа са фазним контрастом, параметри величине од 5–10,000 пиксела су побољшали детекцију фрагмената неурита, али су такође били повезани са погрешном идентификацијом позадинског шума, артефаката слике или других малих не-неуритни материјал као фрагменти неурита. У поређењу са широко коришћеним параметрима од 20–10,000 пиксела, међутим, параметри од 10–10,000 пиксела су побољшали детекцију фрагмената неурита без значајног повећања лажно позитивних (слика 4А , лево).

Сличне анализе су такође изведене са бинаризованим сликама добијеним из флуоресцентних микрографија ЛУХМЕС ћелија имуно обележених за б ИИИ-тубулин. Параметри величине анализатора честица од 5–10,000 пиксела омогућили су најосетљивију детекцију фрагмената неурита и, пошто су флуоресцентне микрографије садржале мање ситних остатака, такви параметри нису значајно повећали погрешну идентификацију не-неуритног материјала као неуритних фрагмената (Сл. 4А, десно).

Традиционална метода за извођење ДИ мерења, коришћењем параметара величине анализатора честица од 20–10,000 пиксела, искључује објекте мање од 20 пиксела из мерења фрагмената неурита.

Међутим, такви мали објекти се обично погрешно укључују у мерења укупне површине неурита, пошто традиционална метода мерења ДИ укључује израчунавање укупне површине неурита сабирањем свих црних пиксела у бинаризованим сликама. Да бисмо превазишли овај проблем, користили смо додатак Партицле Ремовер за ИмагеЈ, који је написао програмер ИмагеЈ Ваине Расбанд, да бисмо уклонили мале, не-неуритне објекте из бинаризованих слика. Примена овог додатка приликом извођења ДИ мерења коришћењем микрографа фазног контраста ЛУХМЕС ћелија изложених 6-ОХДА, генерисаних као што је описано на Слици 2, резултирала је значајним повећањем мерења ДИ у свим концентрацијама изложености неуротоксину (Ф(1 ,8)=83.43, п=0.0001, Р2=0.0416).
Штавише, значајна интеракција је показала да је повећање ДИ узроковано употребом средства за уклањање честица постало јаче при вишим концентрацијама (Ф(1.881,15.05)=59.97, п=0.0001, Р{ {8}}.0094; Слика 4Б, Ц). Такође смо снимили исте слајдове ћелија флуоресцентном микроскопијом и проценили ефекте уклањања малих честица на мерења ДИ добијених из флуоресцентних микрографија. Док уклањање малих честица даје вредности ДИ које су теоретски тачније, такве вредности се у просеку нису значајно разликовале од оних добијених без употребе додатка за уклањање честица када су мерене коришћењем флуоресцентних микрографија (Ф(1,8)=2. 613, стр=0.1446, Р2=0.0013; слика 4Д).

Аутоматизација мерења ДИ са флуоресцентних микрофотографија

Извођење ДИ мерења коришћењем традиционалне методе захтева заморну и дуготрајну обраду слике, употребу слободног алата за дигитално уклањање појединачних ћелијских тела и мерење фрагментованих неурита и укупних неурита са сваке слике. Стога смо настојали да побољшамо ефикасност методе писањем макроа који у потпуности аутоматизује ДИ анализе. Да би аутоматизовао уклањање соме, макро, под називом АНДИ, извршава бинаризацију слика ћелијских језгара, означених преко нуклеарне боје ДАПИ, након чега следи модификација бинаризоване слике тако да се нуклеарни региони са прагом увећавају да обухвате цео регион соме. Такве слике са бинаризованим и увећаним језгрима се затим одузимају од одговарајућих флуоресцентних микрографија неурона имуно обележених за б ИИИ-тубулин, генеришући слику која искључиво садржи неурите (Слика 5А, Б).

Да би се прилагодиле променљивим нуклеарним величинама узрокованим смањењем или фрагментацијом језгра повезаних са неуродегенерацијом, бинаризоване слике језгара се увећавају комбинацијом дилатација и ерозија које комбинују нуклеарне фрагменте и проширују бинаризоване регионе како би заузели површину већу од сома диференцираних ЛУХМЕС ћелија . Слике које садрже искључиво неурите се затим бинаризују и подвргавају ДИ анализи путем серије аутоматизованих функција (Слика 5Ц, Д). Да бисмо проценили тачност макро операција повезаних са уклањањем сома са слика, упоредили смо ДИ резултате добијене након ручног уклањања ћелијских тела са флуоресцентних микрографија користећи алатку за руку од ИмагеЈ (као што је претходно приказано на слици 4Д), са ДИ резултатима генерисан из анализа идентичних слика након аутоматског уклањања тела ћелије коришћењем операција уклањања сома које су представљене у АНДИ макроу. Наше анализе су откриле да су резултати ДИ израчунати коришћењем аутоматског уклањања тела ћелије скоро идентично у корелацији са мерењима ДИ добијеним са слика подвргнутих ручном уклањању соме (р(34)=0.980, п, 0.0001; Сл. 5Е).

Да бисмо повећали тачност анализа, у АНДИ смо укључили неколико претходно описаних подешавања која побољшавају мерења ДИ. Макро садржи операције побољшања контраста, коришћење додатка Партицле Ремовер за уклањање не-неуритне материје са слика неурита и ненуклеарне материје са слика језгара и откривање фрагмената неурита помоћу параметара величине 5–10,000 за додатак за анализу честица.

Претпоставили смо да би, заједно, употреба флуоресцентне микроскопије, операција побољшања контраста, уклањања малих објеката са средством за уклањање честица и оптимизовани параметри за детекцију честица допринели прецизнијим мерењима дегенерације неурита. Да би се тестирала ова хипотеза, слике фазног контраста ЛУХМЕС ћелија изложених различитим концентрацијама 6-ОХДА, генерисане као што је описано на слици 2, анализиране су слепим и субјективним бодовањем коришћењем опсега вредности између 0. 0 и 1.0, са вредностима које представљају очигледан удео фрагментоване области неурита. Затим смо проценили корелацију између субјективних резултата и мерења ДИ добијених традиционалном методом, као и корелацију између субјективних резултата и мерења ДИ добијених коришћењем АНДИ макроа.

Док су ДИ мерења добијена традиционалном методом у корелацији са субјективним резултатима (р {{0}}.7850, п,0.0001; слика 5Ф), АНДИ макро је дао мерења која су много јаче корелирала са субјективним оценама (р 2=0.978, п, 0,0001; слика 5Г). Директна статистичка поређења су открила да су резултати добијени помоћу АНДИ Макроа значајно јаче корелирали са субјективним оценама него резултати добијени традиционалном методом (з=6.626, п, 0,0001; слика 5Ф, Г). Даље анализе су откриле да макро олакшава перформансе ДИ мерења уз робусно и значајно побољшање временске ефикасности. ДИ анализе обављене коришћењем АНДИ Макроа захтевале су просечно време од 12,75 с по анализираној слици, у поређењу са просечним временом од 5,27 минута по слици анализираној традиционалном методом [Фриедман к2 (1)=9, п {{22} }.0027]. Све у свему, ови резултати указују на то да АНДИ даје брзу генерисање ДИ мерења која, у поређењу са резултатима добијеним традиционалном методом, ближе се приближавају дегенерацији коју истраживачи примећују из квалитативне анализе слика неурита.

Након одређивања тачности и ефикасности АНДИ макроа за мерење дегенерације неурита у диференцираним ЛУХМЕС ћелијама изложеним 6-ОХДА, проценили смо прикладност макроа за експерименте који укључују друге моделе ћелијске културе. Пилот студија је прво спроведена да би се проценила тачност АНДИ у извођењу мерења ДИ коришћењем микрографа примарних симпатичких култура имуно обележених за б ИИИ-тубулин и ДАПИ. Занимљиво је, међутим, да су ћелијска тела симпатичких неурона већа од оних диференцираних ЛУХМЕС ћелија, па стога операције у АНДИ-ју које се односе на аутоматско уклањање соме нису уклониле целину соме (подаци нису приказани).

Да бисмо превазишли овај проблем, ревидирали смо АНДИ тако да садржи оквир за дијалог који корисницима омогућава да одаберу величину уклањања соме контролишући број пута проширења бинаризованих микрографија језгара. Ова верзија АНДИ, верзија 1.1, је затим коришћена за обављање ДИ мерења са микрографа који приказују здраве симпатичке неуроне третиране носачем или дегенеришуће симпатичке неуроне изложене водоник-пероксиду. Слике неурона изложених водоник-пероксиду дале су значајно веће резултате ДИ у поређењу са сликама неурона третираних возилом (Ф(1,3)=71.2, п=0.0035, Р2=0 .9301; Слика 6А, Ц). Штавише, упоредили смо ове ДИ резултате који су добијени коришћењем АНДИ до ДИ мерења добијених из истог скупа слика након ручног уклањања ћелијских тела са флуоресцентних микрографија користећи алатку за руку од ИмагеЈ. Није било значајне разлике у резултатима ДИ израчунатим након ручног уклањања сома у поређењу са резултатима добијеним коришћењем АНДИ (Ф(1,3)=0.1082, п=0.7639, Р2=0. 0000; сл. 6А–Ц). Пост хоц тестови су такође потврдили да ДИ резултати добијени коришћењем АНДИ нису били значајно различити како у случају нетретираних неурона (п=0.0972) тако и у случају неурона изложених водоник-пероксиду (п=0. 9986).

Штавише, ДИ резултати добијени од АНДИ су скоро идентично корелирали са ДИ резултатима добијеним након ручног уклањања ћелијских тела са одговарајућих микрографија (р(34)=0.991, п, 0.0001). Ови подаци показују да је АНДИ погодан за мерење дегенерације неурита у културама примарних неурона, са операцијама уклањања сома које корисник може да прилагоди тако да одговара различитим типовима неурона. Поред тога, откривање фрагмената неурита у културама изложеним водоник-пероксиду показује применљивост макроа за употребу у експериментима који укључују дегенерацију неурита изазвану изворима који нису 6-ОХДА. Да бисмо даље верификовали употребу АНДИ у откривању дегенерације неурита повезане са различитим узроцима, такође смо користили макро за мерење дегенерације неурита на микрографијама здравих симпатичких култура или култура подвргнутих повлачењу НГФ-а. Као што се и очекивало, слике култура подвргнутих повлачењу НГФ-а дале су значајно веће вредности ДИ у поређењу са сликама здравих култура (Ф(1,2)= 287, п= 0.0035, Р2=0. 958; Слика 6Д, Е). Заједно, ови налази показују да се АНДИ може користити за откривање дегенерације неурита повезане са различитим биолошким контекстима.

Пошто се бојење за ТХ обично користи за визуелизацију катехоламинергичких неурона, такође смо проценили прикладност микрографа који приказују ТХ бојење за мерење дегенерације неурита помоћу АНДИ. Културе здравих симпатичких неурона третираних раствором вехикулума или дегенеришућих симпатичких неурона изложених водоник пероксиду су фиксиране и подвргнуте имунофлуоресцентном обележавању за ТХ и б ИИИ-тубулин, као и контра-бојењу за ДАПИ. Слике неурита које приказују бојење за ТХ или б ИИИ-тубулин, и одговарајуће слике језгара које садрже ДАПИ обележавање, затим су снимљене у сличним видним пољима. Извршен је АНДИ, а слике које садрже ТХ бојење или б ИИИ-тубулин бојење су одабране као слике неурита. Наше анализе су откриле да су ДИ резултати добијени коришћењем слика ТХ бојења веома снажно корелирају са резултатима добијеним на сликама бојења б ИИИ-тубулина (р(28)= 0.962, п, 0.0001; Сл. 6Ф, Г). Ови подаци указују да се тачна мерења ДИ могу добити помоћу АНДИ користећи алтернативне процедуре бојења које обележавају целину неурита, као што је имунообележавање за ТХ.

Да бисмо демонстрирали корисност побољшане методе за извођење ДИ мерења у научном експерименту, користили смо нову методу да проценимо улогу ЈНК у дегенерацији неурита изазваној оксидативним стресом у људским мезенцефалним ћелијама. Диференциране ЛУХМЕС ћелије су претходно третиране 1 х са ЈНК инхибитором СП600125 или раствором носача. Ћелије су затим третиране 24 х са 6- ОХДА да би се индуковао оксидативни стрес или раствором носача. Фиксне ћелије су подвргнуте имунообележавању за б ИИИ-тубулин и ДАПИ бојење, а АНДИ је коришћен за добијање ДИ мерења са флуоресцентних микрографија. Док су културе које нису претходно третиране ЈНК инхибитором показале дегенерацију неурита након излагања 6-ОХДА, ЈНК инхибиција је резултирала упадљивим и значајним смањењем 6- ОХДА-индуковане дегенерације неурита (п= 0.0001 , д= 2.0209; Слика 7). Ови налази подржавају кључну улогу ЈНК сигнализације у дегенерацији неурита изазваној оксидативним стресом у људским мезенцефалним ћелијама, и што је важно, показују корисност нашег новог метода за генерисање научних открића омогућавањем брзог и тачног мерења дегенерације неурита.

Дискусија

Дегенерација неурита је повезана са различитим неуропатолошким стањима, али молекуларни механизми који леже у основи деградације неурита остају непотпуно схваћени. Методе које омогућавају тачну и ефикасну анализу дегенерације неурита су од суштинског значаја за успешну идентификацију нових фактора који регулишу овај важан ћелијски догађај. У овој студији откривамо вишеструке изворе грешака повезаних са најчешће коришћеном методом за квантификацију дегенерације неурита. Извештавамо о експерименталним подацима који подржавају процедуралне модификације које се могу применити да би се смањила грешка у анализи ДИ, а такве модификације су уграђене у нови ИмагеЈ макро да би се обезбедио алат за брзе, тачне и објективне ДИ анализе коришћењем отвореног кода и бесплатног софтвера. Штавише, показујемо како се побољшана метода може применити за мерење дегенерације неурита у моделу ћелијске културе ПД, поремећаја у којем је фрагментација аксона у допаминергичким неуронима догађај у раној фази који претходи евентуалном губитку неурона (Таглиаферро и Бурке, 2016) .

У овој студији демонстрирамо корисност АНДИ Макроа у мерењу дегенерације неурита у моделу ћелијске културе ПД који се састоји од диференцираних ЛУХМЕС ћелија изложених 6-ОХДА.

Извештавамо о експерименталним налазима који подржавају оптималне супстрате на којима треба да буду успостављене културе, као и демонстрирамо густину наношења која је најприкладнија за анализу дегенерације неурита. Употреба овог модела система за проучавање дегенерације неурита има неколико предности. Ћелије развијају неурите који су добро умрежени и типично дуги .500 мм, а културе су подложне неуродегенерацији изазваној класичним, неуротоксинским моделима ПД као што су 6-ОХДА, 1-метил{{4 }}фенилпиридинијум јон (МПП1) и ротенон (Лотхариус ет ал., 2005; Зханг ет ал., 2014; Смирнова ет ал., 2016; Краемер ет ал., 2021). Штавише, људско порекло ЛУХМЕС ћелија повећава преводљивост налаза повезаних са моделом, а условна имортализација олакшава брзо стварање и размножавање култура (Сцхолз ет ал., 2011). Стога, заједно са аутоматизованим анализама извршеним коришћењем АНДИ, ЛУХМЕС ћелије се могу користити за нова открића у вези са дегенерацијом неурита повезане са ПД, истовремено омогућавајући знатно већу пропусност у поређењу са неаутоматизованим анализама изведеним са примарним неуронским културама.

Бројне истраживачке групе су извршиле ДИ анализе користећи слике са фазним контрастом да би стекле увид у факторе који регулишу дегенерацију неурита (Пресс и Милбрандт, 20{{10}}9; Краемер ет ал., 2014. ; Ди Стефано и сар., 2015; Хилл ет ал., 2018; Геислер и сар., 2019). Овде извештавамо о важном недостатку који је повезан са овим широко коришћеним методом за мерење дегенерације неурита: бинаризација слика фазног контраста узрокује да значајан део интактних неурита изгледа фрагментирано. Иако ниво контраста који се може постићи при снимању микрографија варира у зависности од система микроскопа који је доступан истраживачима, ово питање је свеприсутно међу различитим истраживачким групама, пошто је ДИ од 0,2 уобичајено прихваћен као праг изнад којег се сматра да се културе дегенеришу. аксона, а већина научних извештаја који садрже мерења ДИ са микрографа са фазним контрастом наводе резултате ДИ за здраве неуроне између 0,1 и 0,3 (Сасаки ет ал., 2009, 2016; Ди Стефано ет ал., 2015; Хилл ет ал., 2018; Лорето ет ал., 2020). Наше ДИ анализе добијене из флуоресцентних микрографија, као и субјективни резултати заслепљених истраживача, показују да фрагментација неурита од 10–20% није уобичајена у здравим културама неурона. Уместо тога, такве културе у просеку показују само 2,5% фрагментације неурита. Дакле, наши налази подвлаче потребу за методама које побољшавају тачност анализа дегенерације неурита смањењем овог уобичајеног и значајног извора грешке мерења.

Док је већина студија које укључују ДИ мерења користила слике фазног контраста за извођење анализа дегенерације неурита, неколико истраживачких група је недавно извршило ДИ мерења користећи слике неурона имуно обележених за филаменте цитоскелета као што је полипептид неурофиламентног медија или б-б-тубулин (Вакатсуки ет ал., 2011; Ли ет ал., 2017; Пеасе-Раисси ет ал., 2017; Хернандез ет ал., 2018; Сундарамоортхи ет ал., 2020). Међутим, који облик микроскопије је најпогоднији за мерење дегенерације неурита остало је нејасно, јер су била потребна истраживања да би се разумело да ли промене у локализацији ових протеина цитоскелета током дегенерације неурита на одговарајући начин моделирају укупне промене у морфологији неурита, као и да се процени степен до којег мерења ДИ добијена флуоресцентним микрографијама корелирају са сличним мерењима добијеним из микрографа са фазним контрастом. Овде показујемо да флуоресцентне микрографије које приказују б ИИИ-тубулин бојење не само да тачно представљају фрагментацију неурита, већ такође олакшавају прецизнија мерења ДИ због њиховог супериорног контраста и смањене подложности вештачкој фрагментацији при бинаризацији. Стога, наши резултати наглашавају корисност употребе бојења б ИИИ-тубулином за мерење дегенерације неурита.

Међу објављеним студијама које укључују ДИ анализе за мерење дегенерације неурита, пријављени параметри величине и кружности који се користе за откривање фрагмената неурита су значајно варирали. На пример, недавна студија која је укључивала процену дегенерације неурита у култивисаним неуронима хипокампуса користила је параметре величине од 4–900 пиксела (Ли ет ал., 2017), док је студија која је укључивала култивисане ДРГ неуроне користила параметре детекције 0–10,000 пиксела (Вакатсуки ет ал., 2011). Један од потенцијалних разлога за такве варијације је тај што ефикасност параметара величине анализе честица у откривању фрагмената неурита варира у зависности од резолуције слике пошто су параметри величине за детекцију честица повезани са јединицама пиксела. Нажалост, већина објављених студија које укључују ДИ анализе не укључују опис резолуције слике која се користи за анализе. Стога је било потребно успостављање стандардних параметара анализе путем протокола који у потпуности открива важне детаље као што је препоручена резолуција слике. Овде извештавамо да су најчешће цитирани параметри за детекцију фрагмената неурита, 20–10,000 пиксела (Схин ет ал., 2012; Ди Стефано ет ал., 2015; Сасаки ет ал., 2016; Лорето и др. ал., 2020; Шин и Чо, 2020), доводе до тога да велики део фрагмената неурона остане неоткривен. Смањење критеријума минималне величине за детекцију фрагмената неурита повећава осетљивост детекције фрагмената, док истовремено повећава број артефаката слике и не-неуритних остатака који се лажно детектују као фрагменти неурита. У потрази за параметрима који би најбоље уравнотежили осетљивост детекције и стопе лажне позитивности, идентификовали смо параметре анализе од 10–10,000 као најтачнију детекцију фрагмената неурита на бинаризованим сликама добијеним из микрографа са фазним контрастом, док параметри од 5–10,000 олакшавају најтачнију детекцију фрагмената неурита у бинаризованим сликама добијеним из флуоресцентних микрографија. Иако су ова одређивања направљена коришћењем резолуције слике од 1280 1024, такви параметри би такође требало да омогуће прецизно откривање фрагмената неурита на сликама снимљеним у другим резолуцијама које имају вертикалну величину од 1024 пиксела, као што је уобичајена резолуција целог екрана {{ 27}}, пошто би неурони приказани на таквим сликама били сличне величине пиксела.

Бројне истраживачке групе су користиле критеријум минималне величине приликом конфигурисања параметара анализе честица како би избегли да мали остаци неурита буду укључени у мерења неуритних фрагмената (Схин ет ал., 2012; Цоскер ет ал., 2013; Ди Стефано ет ал., 2015; Сасаки и сар., 2016; Ли и сар., 2017; Лорето и сар., 2020; Шин и Чо, 2020; Сундарамоорти и сар., 2020). Међутим, такве студије су погрешно укључиле малу, нефрагментну материју у мерења укупне површине неурита, пошто се таква мерења добијају сабирањем површине свих црних пиксела на слици. Овде демонстрирамо корисност додатка Партицле Ремовер за уклањање малих остатака који нису фрагменти са слике пре ДИ анализе. Коришћење додатка значајно је повећало осетљивост мерења дегенерације неурита добијених са слика са фазним контрастом. Стога, наши резултати истичу вредност додатка за уклањање честица за истраживаче који врше ДИ анализе користећи микрографије фазног контраста. Занимљиво је да су флуоресцентне микрографије садржале мање малих остатака који нису неурити, па би се критеријум ниже величине од пет пиксела могао користити за детекцију фрагмената. Док уклањање честица неуритних остатака мање од пет пиксела није значајно утицало на ДИ мерења добијена флуоресцентним микрографијама, такве операције дају вредности које су теоретски тачније и стога су укључене у АНДИ.

Пошто се ДИ анализе морају изводити коришћењем слика које садрже искључиво неурите, примена методе анализе је првенствено била ограничена на употребу са системима културе који су подложни уклањању ћелијских тела, као што су културе експланта у којима се ћелијска тела могу физички изрезати (Цатенаццио ет ал. , 2017; Схин анд Цхо, 2020) или културе у микрофлуидним уређајима који олакшавају сегрегацију сома и аксона (Цоскер ет ал., 2013; Пеасе-Раисси ет ал., 2017; Тан ет ал., 2018). Алтернативно извођење ДИ анализа са дисоцираним културама може се постићи напорним и дуготрајним радом повезаним са дигиталним уклањањем ћелијских тела са микрофотографија (Краемер ет ал., 2014). У овој студији откривамо да АНДИ омогућава извођење ДИ мерења са микрографа са ЛУХМЕС ћелијама које су дисоциране и мозаично распоређене по систему 2Д културе. Наши налази такође показују да АНДИ олакшава 24-путоструко смањење времена потребног за обављање анализа, а операције у АНДИ које се односе на уклањање соме дају резултате ДИ анализе који корелирају 98% са сличним анализама обављеним након ручног уклањања соме помоћу слободна алатка ИмагеЈ. Дакле, макро значајно повећава ефикасност анализа извођењем аутоматизованог уклањања соме путем процеса који не жртвује тачност, а такве операције проширују погодност методе за анализу дисоцираних култура са мозаично распоређеним ћелијским телима.

Поред омогућавања аутоматизованог уклањања тела ћелије са слика, АНДИ има неколико ревизија традиционалне методе за извођење ДИ анализе, укључујући употребу флуоресцентних микрографа, ревидираних параметара анализе честица и коришћење средства за уклањање честица за уклањање малих остатака који нису неурити. од слика. Наши налази показују да ове оптимизације заједно дају ДИ вредности које су ближе вредностима добијеним слепим и подвргнутим бодовањем. Стога, поред значајног смањења времена потребног за обављање анализа, АНДИ олакшава мерења ДИ која, у поређењу са традиционалном методом, прецизније одражавају дегенерацију неурита коју истраживачи наводно примећују из квалитативне анализе слике.

Један недостатак традиционалног метода за извођење ДИ анализа је тај што такве анализе захтевају обуку у коришћењу ИмагеЈ тако да корисник буде упознат са заморним скупом ИмагеЈ операција. Штавише, да би се анализе извршиле ефикасно, потребна је даља обука за корисника да изврши групне анализе или да напише скрипте за полуаутоматизацију извршавања одређених корака. Потпуно аутоматизујући анализу, АНДИ олакшава ДИ мерења у само неколико корака који се односе на преузимање и извршавање макроа. Да би се повећао прилагођеност кориснику, макро укључује код за обезбеђење интерфејса за избор директоријума који садрже слике које треба анализирати, као и за олакшавање излаза слика резултата и табела података у директоријум који корисник одабере. Штавише, скрипта садржи бројне функције дизајниране да спрече нетачности мерења или грешке корисника, укључујући аутоматско брисање претходних ИмагеЈ резултата; уклањање информација о размери слике како би се осигурало да се мерења прецизно изводе коришћењем јединица пиксела; одговарајућа конфигурација подешавања боја ИмагеЈ, подешавања мерења и параметара анализатора честица; презентација поруке о грешци ако корисници погрешно изаберу директоријуме који садрже неједнак број слика које приказују б ИИИ-тубулин бојење и ДАПИ бојење; описи дневника који указују на напредак анализе; и кодирање за спречавање грешака повезаних са аутоматским генерисањем .ини фајла од стране Виндовс 10. Све у свему, ове карактеристике чине ДИ анализе лакшим за коришћење, што може да подстакне интересовање за студије које се односе на дегенерацију неурита.

Да бисмо демонстрирали његову корисност у експерименту, користили смо АНДИ да проценимо доприносе ЈНК дегенерацији неурита у ЛУХМЕС ћелијским културама изложеним 6-ОХДА. ЈНК је киназа активирана стресом за коју се наводи да је кључна за дегенерацију неурита у периферним неуронима неприматног порекла (Схин ет ал., 2012), али су потребне даље студије да би се разумела улога киназе у дегенерацији неурита у мезенцефалним људским ћелијама . Овде показујемо да инхибиција ЈНК значајно штити људске мезенцефалне ћелије од дегенерације неурита повезане са оксидативним стресом. Овакви налази не само да откривају важну улогу ЈНК у дегенерацији неурита која је повезана са моделом људске болести, већ такође илуструју корисност АНДИ-а за обављање аутоматизоване и објективне анализе слике за нова научна открића.

Док је АНДИ првобитно био дизајниран да омогући брзо и прецизно мерење дегенерације неурита у културама диференцираних ЛУХМЕС ћелија изложених 6-ОХДА, наши налази такође указују да се макро може користити за откривање дегенерације неурита изазване другим узроцима, као што је нпр. излагање водоник пероксиду или повлачење неуротрофина. Поред тога, верзија 1.1 макроа има оквир за дијалог који омогућава истражитељима да прилагоде операције уклањања сома за неуроне одређене величине. Наши подаци такође подржавају да се друге методе бојења осим имунообележавања за б ИИИ-тубулин могу користити за прецизно мерење дегенерације неурита. Иако препоручујемо употребу пилот студија за верификацију тачности мерења ДИ када се користи АНДИ са типовима ћелија или методама бојења које раније нису тестиране, ови налази подржавају да је макро генерално свестран алат за мерење дегенерације неурита у култивисаним неуронима. Пошто АНДИ није оптимизован за мерење дегенерације неурита у ткиву, тренутно препоручујемо његову употребу само за анализу дегенерације неурита повезане са култивисаним ћелијама. Међутим, код за АНДИ је јавно доступан и стога може бити користан за истраживаче заинтересоване да модификују скрипту тако да одговара ин виво студијама или другим апликацијама.

У закључку, овај чланак представља податке који откривају уобичајене изворе грешака у вези са широко коришћеном методом за квантификацију дегенерације неурита. Експериментални приступи су коришћени да се побољша метода, а таква побољшања су уграђена у бесплатни и отворени код ИмагеЈ макро који се може користити за брзу, тачну и објективну анализу флуоресцентних микрографија за дегенерацију неурита. Наши налази откривају ефикасност АНДИ-а за квантификацију дегенерације неурита на микрографијама које приказују модел ћелијске културе ПД, као и дају доказ о принципу да макро може открити дегенерацију неурита повезану са другим биолошким контекстима. Макро прилагођен кориснику ће смањити време потребно истраживачима да науче да квантификују фрагментацију неурита, док истовремено повећавају пропусност и тачност студија које процењују факторе који леже у основи дегенерације неурита. АНДИ макро је доступан на следећој УРЛ адреси: хттпс://гитхуб.цом/краемерб/краемерлаб.

Референце

1. Аарсланд Д, Цреесе Б, Политис М, Цхаудхури КР, Ффитцхе ДХ, Веинтрауб Д, Баллард Ц (2017) Когнитивни пад код Паркинсонове болести. Нат Рев Неурол 13:217–231.

2. Адалберт Р, Цолеман МП (2013) Преглед: патологија аксона у неуродегенеративним поремећајима везаним за узраст. Неуропатхол Аппл Неуробиол 39:90–108.

3. Бове Ј, Периер Ц (2012) Модели Паркинсонове болести засновани на неуротоксинима. Неуросциенце 211:51–76.

4. Цатенаццио А, Ллаверо Хуртадо М, Диаз П, Ламонт ДЈ, Висхарт ТМ, Цоурт ФА (2017) Молекуларна анализа аксонално-интринзичне и глијалне корегулације дегенерације аксона. Ћелијска смрт Дис 8: е3166.

5. Цоскер КЕ, Пазира-Мурпхи МФ, Фенстермацхер СЈ, Сегал РА (2013) Циљно изведени неуротрофини координирају транскрипцију.

6. Ди Стефано М, Насцименто-Ферреира И, Орсомандо Г, Мори В, Гиллеи Ј, Бровн Р, Јанецкова Л, Варгас МЕ, Воррелл ЛА, Лорето А, Тицкле Ј, Патрицк Ј, Вебстер ЈРМ, Марангони М, Царпи ФМ, Пуцциарелли С, Росси Ф, Менг В, Сагасти А, Рибцхестер РР, ет ал. (2015) Пораст прекурсора НАД никотинамид мононуклеотида (НМН) након повреде промовише дегенерацију аксона. Целл Деатх Диффер 22:731–742.

7. Фукуи К (2016) Реактивне врсте кисеоника индукују дегенерацију неурита пре индукције ћелијске смрти. Ј Цлин Биоцхем Нутр 59:155–159.

8. Геден МЈ, Десхмукх М (2016) Дегенерација аксона: контекст дефинише различите путеве. Цурр Опин Неуробиол 39:108–115.

9. Геислер С, Доан РА, Цхенг ГЦ, Цетинкаиа-Фисгин А, Хуанг СКС, Хоке А, Милбрандт Ј, ДиАнтонио А (2019) Винкристин и бортезомиб користе различите механизме узводно да активирају уобичајену дегенерацију аксона зависну од САРМ{3}} програм. ЈЦИ Инсигхт 4:е129920.

10. Хернандез ДЕ, Салвадорес НА, Моиа-Алварадо Г, Цаталан РЈ, Бронфман ФЦ, Цоурт ФА (2018) Аксонална дегенерација изазвана ексцитотоксичношћу глутамата је посредована некроптозом. Ј Целл Сци 131:јцс214684.

For more information:1950477648nn@gmail.com