Поновно повезивање метаболизма глукозе и липида изазваног Г протеином спојеним рецептором 17 Утишавање омогућава транзицију олигодендроцитних прогенитора у мијелинизирајуће ћелије Ⅱ

3. Резултати

3.1. Утишавање ГПР17 у диференцирању ОПЦ-а значајно је променило експресију гена укључених у метаболизам липида и глукозе

Да бисмо истакли биолошке процесе на које значајно утиче експресија ГПР17 током ОЛ диференцијације, ометали смо његову експресију трансфекцијом ОПЦ-ова пацова са СМАРТ-поол сиРНА специфичним за ГПР17 пацова. Након што смо потврдили успешно обарање ГПР17 помоћу кРТ-ПЦР-а (слика С1), извршили смо анализу микромрежа 30.584 транскрипта пацова у ГПР17-утишаним у односу на контролни ОПЦ и анализирали различито експримиране гене (ДЕГ) помоћу различитих биоинформатичких алата. Прво, 640 ДЕГ је проучавао Мета-Цоре, да би извршио анализу обогаћивања пута и идентификовао процесе за које се предвиђа да ће бити значајно погођени. Ова анализа је предложила промену мТОР сигнализације, за коју се већ показало да је повезана са функцијом ГПР17 [37], и других процеса за које се зна да су релевантни за сазревање ОПЦ, као што су "ремоделирање цитоскелета" и„регулација метаболизма липида" (Табела 1).

плус

Кликните овде да бисте сазнали Цистанцхе за раст костију

Табела 1. Софтвер МетаЦоре је коришћен за извођење анализе обогаћивања путања на ДЕГ након утишавања ГПР17. Табела приказује најзначајније путеве који су резултат анализе, број повезаних гена и уобичајених гена укључених у скуп података

Затим је алатка Ингенуити патхваи аналисис (ИПА) коришћена за извршење подударања анализе, која аутоматски идентификује одабране ИПА скупове података са значајним сличностима и разликама у поређењу са скупом података упита. Ова анализа јача предвиђену везу између експресије ГПР17 и метаболизма липида, показујући да су промене експресије 38 гена у нашем скупу података (Табела С1) повезане са измењеном синтезом масних киселина (Слика 1). Међу њима, утишавање ГПР17 изазвало је повећање регулације ЛКСР-а (алфа Кс рецептор јетре, НР1Х3 на слици 2 и табели С1, нуклеарни рецептор који реагује на оксистероле) и СРЕБП1 (протеин 1 који везује регулаторни елемент стерола, СРЕБФ1 на слици 1 и табели С1), два кључни играчи у синтези масних киселина и холестерола. У нашем скупу података, такође смо приметили да је неколико измењених гена, укључујући ПДХ (пируват дехидрогеназа), Лдха (лактат дехидрогеназа алфа) и Пдк1 (пируват дехидрогеназа киназа 1), повезано са метаболизмом глукозе и Кребсовим циклусом, што сугерише потенцијално учешће ГПР17 рецептор у регулацији ових метаболичких процеса. Према овоме, анализа обогаћивања заснована на онтологији гена (ТоппГене пакет) на ДЕГс открила је промену „метаболичког процеса монокарбоксилне киселине“ (ГО:{{20}}032787, п- вредност: 0,02), поред других процеса који се односе на развој ЦНС-а и метаболизам ћелија, као што су „регулација развоја нервног система“ (ГО:0051960, п-вредност: 0,033) и „сфинголипидни метаболички процеси“ (ГО:0006665, п-вредност : 0,043) (слика 2; комплетна листа у табели С2).

Глобално, ове промене сугеришу да утишавање ГПР17 може деловати као окидач за обраћање ћелија на мијелинизацију, подешавањем неколико гена укључених у транскрипциону регулацију хомеостазе липида и глукозе, као и у коришћењу холестерола и липида за производњу мијелина.

Слика 1. Алат за анализу путање генијалности (ИПА, Киаген) је коришћен за анализу скупа података и истраживање болести и биолошких процеса за које се предвиђа да ће се повећавати или смањивати на основу обрасца различито експримираних гена у скупу података. Из ове анализе смо екстраполирали шему на слици која укључује гене повезане са синтезом липида различито изражене у нашем скупу података (п-вредност=9.67 × 10−4). Пуна имена ових гена, заједно са релативном променом набора (лог2 однос) приказана су у табели С1. У црвеним, навише регулисаним генима; у зеленим генима са смањеном регулацијом

Слика 2. Топпгене пакет је коришћен за анализу обогаћивања на ДЕГ-овима засновану на ГО. Слика приказује неке од значајних биолошких процеса у вези са централним нервним системом и ћелијским метаболизмом који су потенцијално измењени утишавањем ГПР17. Плаве траке означавају укупне гене повезане са сваким термином; црвене траке означавају гене који су заједнички са нашим скупом података за сваки термин. Комплетна листа биолошких процеса који су резултат ове анализе и релативне п-вредности су приказане у табели С2.

3.2. Метаболомска анализа током ОПЦ диференцијације ин витро

Да бисмо проценили корелацију између експресије ГПР17 и активације специфичних метаболичких путева, извршили смо метаболомску анализу култивисаних ОПЦ током њиховог физиолошког сазревања. ОПЦ су одржавани у медијуму за диференцијацију, а затим лизирани у четири различите временске тачке (после 0, 1, 3 и 5 дана диференцијације, ДИД), које одговарају различитим фазама сазревања ОЛ-а. Паралелно, да би се проценило да је у свим експериментима сазревање наступило са очекиваним временом, ОПЦ су култивисани и обојени за ГПР17 и МБП. Резултати су показали да је број ћелија које експримирају ГПР17- достигао свој максимум на 3 ДИД, а затим се вратио ка базалним нивоима на 5 ДИД, док се број МБП-позитивних ћелија прогресивно повећавао током сазревања (Слика 3а), у складу са претходни резултати [37]. ОПЦ метаболомска процена је извршена помоћу течне хроматографије-тандем масене спектрометрије (ЛЦ-МС/МС) као што је претходно описано [38], фокусирајући се на енергетске метаболите укључене у гликолизу, пут пентозе фосфата, Кребсов циклус, оксидацију масних киселина, њихове кофакторе НАДХ, НАД плус, НАДПХ, НАДП плус, АТП, АДП, АМП, аминокиселине и неки њихови деривати. Метаболомски профили анализираних четири временске тачке приказани су на слици 3б. Дана 0, нивои неколико метаболита који припадају и/или повезани са Кребсовим циклусом (нпр. сукцинат, малат, алфа-кетоглутарат, глутамат, аспартат, аланин и пролин) били су виши, као што се очекивало од ћелија које долазе из стања високе пролиферације (Слика 3ц). У средњим фазама (од ДИД 1 до 3), ОПЦ су показали изражену регулацију молекула укључених у синтезу масних киселина и холестерола. Сходно томе, приметили смо повећане нивое ацетил-ЦоА (Слика 3ц), који представља прекурсор холестерола и масних киселина и малонил-ЦоА, специфичног интермедијера у синтези масних киселина. На ДИД 5, приметили смо повећане нивое неколико ацил-карнитина и аминокиселина паралелно са значајним повећањем слободне интрацелуларне глукозе (слика 3ц). Такође смо приметили смањене нивое АМП и АДП од дана 0 до ДИД 5 и пролазно повећање АТП између ДИД 1 и ДИД 3. Ови подаци указују да од дана 0 до ДИД 3, што одговара У временском прозору током којег ГПР17 достиже своју максималну експресију, ОПЦ су углавном користили глукозу и аминокиселине за одржавање биосинтезе холестерола и масних киселина. На ДИД 5, као што је истакнуто повећаним нивоима ацил-карнитина, ОПЦ се вероватно ослањају на искоришћење масних киселина. Заједно, ови подаци указују на то да током физиолошке диференцијације ОПЦ прогресивно мењају свој енергетски метаболизам како би постали зрели мијелинизирајући ОЛ.

3.3. Метаболомска анализа након утишавања ГПР17 током сазревања ОПЦ ин витро

Да бисмо открили допринос ГПР17 рецептора у покретању енергетских метаболичких промена које се дешавају током ћелијске диференцијације, извршили смо метаболомику на ГПР17- утишаним ОПЦ-овима, у поређењу са контролним ОПЦ-има који примају шифровану РНК. Прво смо испитали утицај утишавања ГПР17 на сазревање ОПЦ имунофлуоресцентним бојењем за ГПР17 и МБП. Као што се очекивало, након утишавања рецептора, пронашли смо смањење бојења ГПР17, јасно видљиво на 3 ДИД. Такође смо приметили значајно повећање броја зрелих МБП-позитивних ОЛ-а на 3 ДИД (није приказано) и 5 ​​ДИД (Слика С2). Паралелно, детаљна кПЦР анализа је извршена у пет временских тачака (0, 1, 2, 3 и 5 дана у диференцијацији, ДИД), откривајући, у контролним ОПЦ, снажно повећање експресије ГПР17 након 1 ДИД, који достиже значајне нивое почевши од 2 ДИД, прогресивно повећање експресије МБП до 5 ДИД и значајно смањење раног маркера НГ2 (Слика 4а). Супротно томе, након утишавања ГПР17 (слика 4б), мРНА ГПР17 је достигла ниже нивое на ДИД1, а затим је остала стабилно ниска, експресија МБП се даље повећала, а НГ2 се додатно смањио. Директно поређење експресије НГ2 и МБП у ГПР17-утишаним у односу на контролни ОПЦ у свакој временској тачки приказано је на слици 4ц. Узети заједно, ови резултати сугеришу да је, под овим експерименталним условима, утишавање ГПР17 у ОПЦ-има убрзало њихов процес диференцијације. Затим је ОПЦ метаболомика изведена помоћу ЛЦ-МС/МС у пет одабраних временских тачака. Поређење метаболомских података добијених од ГПР17-утишаних и контролних ОПЦ-а у свакој временској тачки омогућило нам је да идентификујемо метаболите на које значајно утиче утишавање ГПР17

Слика 3. (а) Графикон приказује промене у проценту ГПР17 плус и МБП плус ћелија током диференцијације. н=3 по групи; једносмерна АНОВА са Тукијевим тестом. * п < 0.05, ** п < 0.01) (б) Мапа топлоте показује обиље метаболита у сваком појединачном узорку заустављеном на 0, 1 , 3 или 5 ДИД. Обиље анализираних метаболита је представљено хроматском скалом у распону од тамноплаве (веома ниска заступљеност) до тамно браон (веома висока заступљеност). н=4–5 по групи. (ц) Метаболити са обиљем који се значајно разликује међу условима (0, 1, 3 и 5 дана у диференцијацији, ДИД; једносмерна АНОВА са Фишеровим ЛСД тестом).

На ДИД 1 (слика 5а) нисмо пронашли значајне промене. На ДИД 2 (Слика 5б), пронашли смо значајно повећање неких метаболита Кребсовог циклуса (малат, фумарат цитрат), скромно повећање слободног карнитина (ЦО), ацетил-карнитина (Ц2), пропионил-карнитина (Ц3: 0), бутирил-карнитин (Ц4:0), валерил-карнитин (Ц5:0), хексадеканоил-карнитин (Ц16:0и значајно смањење глукозе , лактат, креатин и орнитин. Редукција уљаног лактата и креатина и повећање пропионил-карнитина (Ц3) је такође примећено на ДИД3 (слика 5ц). На ДИД 5 (слика 5д) и даље смо открили повећање слободног карнитина ( ЦО), ацетилкарнитин (Ц2), пропионил-карнитин (Ц3:0), бутирил-карнитин (Ц4:{{30}}), валерил-карнитин (Ц5:0 )тетрадеканоил-карнитин (Ц14:0), хексадеканоил-карнитин (Ц16:0), октадеканоил-карнитинЦ18:0), октадеценоил-карнитин (Ц18:1), слично ономе што је првобитно примећено у више диференцираних ћелија (види слику 3), повећање дихидроксиацетон-3-фосфата/глицералдехид3-фосфата (ДХАП/ГАП), фумарата и цитрата и смањење ацетил-ЦоА, Мет-СОкреатина, таурина и карнозин.

Слика 4. Утицај утишавања ГПР17 на сазревање ОПЦ. Нивои експресије ГПР17 (зелено), НГ2плаво) и МБП (црвено) процењени су ПЦР-ом у реалном времену током диференцијације у контролним условима (ћелије трансфектоване скрамбле РНК и након утишавања ГПР17 (б), и нормализоване у односу на експресију на Т{{ 6}} (подешено на 0). н=6 за сваку временску тачку. Једносмерна АНОВА са Тукеијевим тестовима вишеструких поређења (а): ** п < {{10} }.001 ВС. ДИД 0-2-3-5, @ п < 0.05 против ДИД 3-5; ## п < 0.01 у односу на дан 0; ССС п < {{30}}.001 ПРОТИВ ДИД{ {21}}; (б): *** п < 0.001 против ДИД 0-2-3-5, @@@ п < 0 .001 наспрам дана 0, # п < 0,05, ### п < 0,001 наспрам дана 0.С п < 0,05, СС п < 0,01, ССС п < 0,001 В. ДИД 5. (Ц) Експресија НГ2 и МБП у ГПР17-утишаним ОПЦсвс. контролним ОПЦ-овима (подешено на 0) у свакој временској тачки. Промена преклопа (ФЦ) је пријављена као ЛОГ,(ФЦ). Један узорак т-тест, * п < 0,05, * п < 0,01; *** п < 0,001 у односу на релативни ДИД у контролним ОПЦ-овима.

Слика 5. Метаболомске промене изазване утишавањем ГПР17 у ОПЦ. (а-д) Бројност сваког метаболита након утишавања ГПР17 нормализована је на ону у релативном контролном узорку. Резултирајуће промене набора коришћене су за генерисање графикона вулкана за сваку временску тачку (1, 2, 3, 5 дана у диференцијацији). Тачке изнад испрекидане хоризонталне линије представљају метаболите који су показали статистички значајну промену (Фишеров ЛСД коригован ФДР; п.адј < 0.1). У зеленој, метаболити са нижом експресијом, црвеном, они са већом експресијом, након утишавања ГПР17. н=7–9 по свакој групи. ДИД: дана у диференцијацији.

3.4. ГПР17 Модулише ослобађање лактата током ОПЦ сазревања

На основу метаболомских резултата описаних горе, утврђено је да утишавање ГПР17 смањује интрацелуларне нивое лактата. Да бисмо проценили да ли ово смањење одражава опште смањење метаболизма лактата или повећано ослобађање овог метаболита, измерили смо његове нивое у ћелијским лизатима и у одговарајућим медијима у различитим временским тачкама. Као што је приказано на слици 6, у контролним условима, интрацелуларни лактат је достигао највећу количину на ДИД 2 (слика 6а) (када је експресија ГПР17 рецептора такође максимална), а затим се смањио када су ћелије постале зреле. Уместо тога, након утишавања ГПР17, пораст интрацелуларног лактата је укинут, а његови нивои су се даље смањивали према диференцијацији. Заиста, поређење нивоа лактата у ГПР17-утишаним ОПЦ у односу на контролне ОПЦ у свакој временској тачки је истакло смањење нивоа лактата у ДИД 2 и 3 (Слика 6б). Екстрацелуларни лактат је пратио различиту кинетику, показујући значајно смањење у поређењу са ДИД 1 на ДИД 2-3-5 у контролним условима, док је у ГПР17-утишаним ОПЦ-има остао стабилно виши, а затим се значајно смањио на ДИД 5 (Слика 6ц ). Међутим, када се упоређују нивои лактата у различитим временским тачкама између два експериментална услова, утишавање ГПР17 омета физиолошку редукцију,повећање присуства лактатау медијуму на ДИД 2 и 3 (слика 6д),што сугерише повећано ослобађање.

Слика 6. Утишавање ГПР17 у ОПЦ мења метаболизам лактата. (а) Обиље лактата током сазревања ОПЦ у контролним условима (зелена линија) и након утишавања ГПР17 (наранџаста линија). н=7–9 по групи. Једносмерна АНОВА са Тукијевим тестом вишеструких поређења. * п < 0.05, ** п < 0.01 у односу на ДИД2 ЦТЛ; §§ п < 0.01, §§§ п < {{30}}.001 наспрам ДИД1 сиГПР17 (б ) Нивои лактата након утишавања ГПР17 су нормализовани у односу на контролне узорке (подешене на 1) у свакој временској тачки (н=7–9). ** п < 0,01; један узорак т-тест. Кондиционирани медијуми из ГПР17-утишаних и контролних ОПЦ-а сакупљени су из исте културе коришћене за метаболомску анализу. Нивои лактата у медијуму су процењени помоћу ЛЦ-МС/МС. (ц) Обиље лактата у екстрацелуларном простору током сазревања ОПЦ у контролним условима (зелена линија) и након утишавања ГПР17 (наранџаста линија). Једносмерна АНОВА са Тукијевим тестом вишеструких поређења. ** п < 0,01, *** п < 0,001 у односу на ДИД1 ЦТЛ; § п < 0,05 у односу на ДИД5 сиГПР17. (д) Екстрацелуларни нивои лактата након утишавања ГПР17 су нормализовани у односу на контролне узорке (подешене на 1) у свакој временској тачки. * п < 0,05; ** п < 0,01; један узорак т-тест. Ефекат инхибиције МЦТ1 у контролним (е,г) и ГПР{45}}утишаним (ф,х) ОПЦ-има је процењен анализом експресије МБП, у узорцима третираним инхибиторима у односу на релативне контроле (третиране возилом) , на 3 и 5 дана диференцијације. н=6 по групи.

Један од механизама којимОПЦ могу ослободити лактатје преко монокарбоксилатног транспортера МЦТ1. Штавише, недавне студије су известиле да сами ОПЦ могу да стекну екстрацелуларни лактат преко МЦТ рецептора, промовишући њихов ћелијски циклус и диференцијацију [39]. Стога смо се питали да ли повећано ослобађање лактата изазвано утишавањем ГПР17 може бити посредовано МЦТ1 и да ли то може бити делимично одговорно за ефекат примећен на сазревање ОПЦ у истим условима (Слика 4). У том циљу, лечили смо ОПЦ са АР-Ц155858, селективним инхибитором МЦТ1, током нормалне диференцијације и након утишавања ГПР17. Као што се очекивало, ослобађање лактата је успешно инхибирано у оба стања (слика С3). Ефекат инхибиције МЦТ1 на сазревање ОПЦ у различитим експерименталним условима је процењен анализом нивоа експресије МБП. Скромно смањење генске експресије МБП, које је близу статистичке значајности (п=0.07), нађено је само у узорцима трансфицираним специфичном сиРНА за ГПР17 (Слика 6е–х); међутим, није се појавила значајна варијација у узорцима трансфицираним контролном РНК (сиНЕГ). Ови резултати сугеришу да повећање екстрацелуларног лактата посредовано смањењем ГПР17 подстиче сазревање ОПЦ; међутим, мали степен смањења МБП указује да овај метаболит није једини фактор укључен у процес.

3.5. Липидомска анализа након утишавања ГПР17 током ОПЦ сазревања

Резултати транскриптомске анализе након утишавања ГПР17 такође су истакли потенцијалну везу између његове функције и синтетичких путева липида и холестерола, који су главне компоненте мијелина. Да бисмо даље истражили улогу ГПР17 у метаболизму липида, применили смо ЛЦ-МС/МС на липидомску анализу ГПР17-утишаних ОПЦ после 2, 3 и 5 дана диференцијације, у поређењу са даном 0. Списак анализираних липида, релативне промене набора и п-вредности приказани су у табели С4. Две најзаступљеније класе липида у експерименталним групама биле су масне киселине и породица диацил-фосфатидилхолина (ПЦаа). Током диференцијације контролних ОПЦ, нисмо пронашли никакве значајне промене у обиљу било које класе липида. Уместо тога, ГПР17-утишани ОПЦс су показали тренд ка измењеном обиљу слободних масних киселина, церамида, ацил-алкил-фосфатидилхолина (ПЦае) и фосфатидилинозитола (ПИ) у поређењу са контролним ОПЦ, посебно на ДИД 3 и 5, али су само диацил-фосфатидилетаноламин (ПЕаа) и сфингомијелин (СМ) показали статистички значајну промену (слика 7).

Слика 7. Промене у обиљу липидних класа изазване утишавањем ГПР17 током диференцијације ОПЦ. Пријављена је заступљеност сваке класе липида у контролним условима у различитим временским тачкама (а) Анализирана је кинетика сваке класе липида након утишавања ГПР17: (б) масне киселине, (Ц) церамиди (д) ЛисоПЦ (лизофосфатидил-холини), (е) лизоПЕ (лизофосфатидилетаноламини), (ф) ПЦаа (диацил-фосфатидил-холини), (г) ПЦае (ацил-алкил-фосфатидил-холини), (х) ПЕаа (ди-ацилфосфатидил-етаноламини), (и) ПЕла (ацил-алкил-фосфатидил-етаноламини), (и) ПИ (фосфатидилинозитоли), (к) ПС (фосфатидил-серини), (Д СМ (сфингомијелини). н=5 за сваку групу. Кинетика: двосмерна АНОВА праћена Тукеијевим тестом вишеструког поређења сиГПР17: Двосмерна АНОВА праћена Сидаковим тестом вишеструког поређења * п.ади < 0.05, ** п.ади < 0,01.

Поређење липидомских података добијених из ГПР{0}}утишавања и контрола у свакој временској тачки омогућило нам је да идентификујемо липиде на које је значајно утишало ГПР17. Након 2 ДИД, нису пронађене значајне промене (подаци нису приказани). Након 3 ДИД, диацилфосфатидилхолин (ПЦаа) Ц40:4 је био мање заступљен, а диацил-фосфатидилетаноламинПЕаа) Ц34:3 је био у већој количини у ГПР17-утишаним ОПЦ (слика 8а). Након 5 дана диференцијације, утишавање ГПР17 довело је до неколико промена у обиљу липида: смањење неколико диацил-ПЦ и диацил-ПЕ и истовремено повећање неколико плазмалогена (ацил алкил-ПЦ) заједно са сфингомијелином (СМ) Ц18:1 и СМ (ОХ) Ц16:1 (Слика 8б). Ови подаци указују на то да смањење ГПР17 мења профил липида главне компоненте мијелина као ПЦ и ПЕ.

Фигура 8.Липидомске промене изазване утишавањем ГПР17 у ОПЦ. (а, б) Обиље сваког липида након утишавања ГПР17 је нормализовано на ону у релативном контролном узорку. Добијене промене набора коришћене су за генерисање графикона вулкана за сваку временску тачку (3, 5 дана у диференцијацији). Тачке изнад испрекидане хоризонталне линије представљају метаболите који су показали статистички значајну промену (Фишеров ЛСД коригован ФДР; п.адј < 0.1). Зеленим су липиди са нижом експресијом, црвеном, они са већом експресијом, након утишавања ГПР17. н=5 по групи.

Тражи више:

Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com

Вхатсапп/тел: плус 86 15292862950

ПРОДАВНИЦА:

хттпс://ввв.кјцистанцхе.цом/цистанцхе-схоп