Улога реналног андрогеног рецептора у полним разликама у метаболизму амонијака

Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Аутумн Н. Харрис ет ал

Апстрактан

Постоје полне разлике у метаболизму и структури бубрежног амонијака, од којих су многе посредованетестостерон. Циљ ове студије био је да се утврди улога бубрежне експресијетестостеронаканонски рецептор, андрогени рецептор (АР), у овим сексуалним диморфизмима. Проучавали смо мишеве сабубрега-специфично АР брисање [КС-АР-нокаут (КО)] генерисано коришћењем Цре/локП техника; контролни мишеви су били Цре-негативни легла (дивљи тип). Код мужјака, али не и женки мишева, КС-АР-КО је повећао излучивање амонијака, што је елиминисало полне разлике. Иако структурна величина бубрега типично одговара излучивању амонијака, КС-АР-КО се смањиобубрегавеличина, запреминска густина кортикалних проксималних тубула и висина ћелија кортикалних проксималних тубула код мушкараца – ниједна није промењена код женки, а густина запремине сабирних канала је била непромењена код оба пола. Анализа кључног протеина укљученог у руковање амонијаком показала је код мужјака мишева да КС-АР-КО повећава и фосфоенолпируват карбоксикиназу (ПЕПЦК) и На þ -К þ -2Цл котранспортер (НКЦЦ2) експресију и смањује На þ/Х þ измењивач изоформа 3 (НХЕ3) и електрогени На þ -бикарбонат котранспортер 1 (НБЦе1)-А експресија. Код женки мишева, КС-АР-КО није променио ове параметре. Ови ефекти су се десили иако КС-АР-КО није променио плазмутестостерон, унос хране или серум На þ, К þ или ХЦО3 значајно код оба пола. У закључку, сигнални путеви зависни од АР код мушкараца, али не и код жена,бубрезирегулишу експресију ПЕПЦК и НКЦЦ2 и доводе до сексуалних разлика у излучивању амонијака. Супротстављени ефекти на НХЕ3 и НБЦе1-Израз вероватно ограничава величину промена излучивања амонијака. Како АР није присутан у дебелом узлазном екстремитету, ефекат КС-АР-КО на експресију НКЦЦ2 је индиректан. Коначно, АР посредује у већембубрегавеличина и запреминска густина проксималних тубула код мужјака у поређењу са женкама мишева.

НОВО И ЗНАЧАЈНОСексуални диморфизми у метаболизму амонијака укључују сигналне путеве зависне од андрогеног рецептора (АР) код мушкараца, али не и код жена,бубрезикоји доводе до промене експресије проксималног тубула (ПТ), фосфоенолпируват карбоксикиназе и дебелог узлазног екстремитета На þ -К þ -2Цл котранспортер. Адаптивни одговори у На þ/Х þ измењивачу 3 и електрогеном На þ -бикарбонатном котранспортеру 1-Израз ограничава величину ефекта на излучивање амонијака. Коначно, већа величина бубрега и запреминска густина ПТ код мужјака мишева је резултат ПТ андрогеног сигнализирања преко АР.

кључне речи: ацидобазна; амонијак; андрогени рецептор; полне разлике;тестостерон

цистанцхе повећава тестостерон

УВОД

The presence of sex differences in many aspects of mammalian biology has been well established with sexual dimorphisms in structure and/or function have been identified in nearly every organ, including the kidney (1–3). Sex affects many aspects of kidney function and disease. Sex differences in blood pressure are widely recognized and thought to be related to sex-specific variations in nitric oxide, the renin-angiotensin-aldosterone system, and inflammation (4, 5). There are also differences in the expression of many renal epithelial cells Naþ transporters (6, 7). Understanding these differences can identify new disease mechanisms and/or new and improved therapeutic opportunities. The kidney regulates acid-base homeostasis, which is critical for normal health (8, 9). Renal ammonia Fn1 1 metabolism has a major role in acid-base homeostasis; ammonia excretion is the predominant component of basal net acid excretion, and changes in ammonia metabolism account for >80 процената одговора на егзогене стимулусе (10–16). Дисрегулација ацидо-базне хомеостазе директно утиче на сваки главни систем органа, убрзава напредовање хроничне болести бубрега и корелира са повећаним морталитетом (17–19).

Наше студије су показале да постоје важни сексуални ефекти и на метаболизам амонијака и на структуру бубрега. Мушки бубрег излучује мање амонијака него женски бубрег и то упркос томе што је мушки бубрег већи и има већи кортикални волумен од женског бубрега (20). Ова разлика у излучивању амонијака корелира са варијацијама у вишеструким бубрежним аспектима, укључујући неколико ензима укључених у стварање и рециклирање амонијака, у величини проксималних тубула, у дебелом узлазном краку петље Хенле (ТАЛ) Наþ -Кþ - 2Цл - експресија котранспортера (НКЦЦ2), и у сабирном каналу интеркалирана величина ћелије и експресија резус (Рх) гликопротеина (20). Коначно, постоје полне разлике у одговору на оптерећење киселином (21). Многе од ових полних разлика се поништавају орхиектомијом кроз механизам који је укинут физиолошкимтестостеронзамена, сугеришући да они укључујутестостерон-зависни сигнални путеви (22).

Канонски пут којимтестостеронпосредује биолошке ефекте укључује везивање за андрогени рецептор (АР) (23, 24). Експресија АР протеина и мРНК примећена је иу мушким и у женским бубрезима деценијама (25–28). Недавно смо показали да се АР протеин експримира специфично у проксималном тубулу и да се експресија није могла детектовати ни у ТАЛ ни у сабирном каналу (22), где су познате полне разлике у протеинима укљученим у руковање амонијаком. Наше студије су даље показале да је експресија АР проксималних тубула била присутна и у мушким и у женским бубрезима, при чему је експресија била отприлике двоструко већа у мушком бубрезу него у женском бубрезима (22). Ова запажања сугеришу да АР може посредовати у неким, али не у свим, ефектима секса на структуру бубрега и на стварање и транспорт амонијака. Они такође постављају питање о улози АР у женском бубрегу.

Стога је сврха ове студије била да се утврди улога бубрежног АР у посредовању ових идентификованих полних диморфизама у метаболизму амонијака у бубрегу и структури бубрега. Пошто АР активација има бројне биолошке ефекте, који могу индиректно да измене кисело-базну хомеостазу и тиме руковање амонијаком, тумачење студија коришћењем фармаколошке АР инхибиције и/или глобалног брисања АР је компликовано. Према томе, ова студија је користила мишеве са делецијом АР специфичном за бубреге [КС-АР-кноцкоут (КО)] генерисаном коришћењем Цре-локП техника. Упоредили смо Цре-позитивне мишеве са њиховим Цре-негативним леглима да бисмо утврдили ефекат КС-АР-КО. И мушки и женски мишеви су процењени да би се омогућило разумевање улоге АР код оба пола.

корени цистанцхе тубулоса

МЕТОДЕ

Животиње

Користили смо мишеве са локП местима која окружују ексон 2 АР гена (АРфлфл/флфл), који су претходно описани (29–31). Индуковали смо делецију АР целог бубрега узгајањем мишева који су експримирали Цре-рекомбиназу под контролом Пак-8 промотора (Пак8Цре; 32). КС-АР-КО мишеви су били АРфлфл/флфл, Пак8-Цре þ; контролни мишеви су били АРфлфл/флфл, Пак8-Цре. Сви мишеви су били на позадини Ц57/Бл6. Генотипизирали смо све мишеве користећи ДНК екстраховану из узорака репних исјечака. Мишеви коришћени у овим експериментима били су одрасли мужјаци и женке мишева старости -4 месеца. Мишеви су држани на стандардној исхрани глодара (18 процената протеина, Харлан Теклад, Мадисон, ВИ) са слободним приступом води. Институционални одбори за негу и употребу животиња Универзитета Флориде и Северне Флориде/Јужне Џорџије одобрили су све протоколе за животиње. Узгој животиња је обављен на Медицинском колеџу за рак и генетику на Универзитету у Флориди за трансгено језгро животиња од стране обученог особља.

Експерименти са метаболичким кавезом

Мишеви су смештени у метаболичке кавезе 3 дана и храњени нормалном исхраном у праху (18 процената протеина, Харлан Теклад) помешаном 1:1 са водом. Измерена је дневна потрошња хране и прикупљени су дневни 24-х узорци урина. Узорци урина су сакупљени у епрувете које садрже минерално уље уравнотежено водом да би се спречило испаравање и губитак молекула гаса. Забележени су дневни волумен урина и пХ. Узорци урина су чувани на - 20 степени до даље анализе.

Анализа крви

Крв је добијена канулацијом абдоминалне аорте код мишева анестезираних изофлураном, увучена у хепаринизовани шприц и одмах анализирана на концентрације Наþ, К þ и бикарбоната коришћењем Сиеменс Мицроаналитиц Блоод Гас Анализер (РАПИДЛаб 348 Муницх, Немачка Анализер, ). Тестостерон у серуму је мерен у Центру Медицинског факултета Универзитета Вирџиније за истраживање репродукцијског лиганда теста и језгра за анализу (ИБЛ Америца тестостерон ЕЛИСА миша, Минеаполис, МН)

Анализа урина

Амонијак у урину је мерен коришћењем модификације комерцијално доступног комплета (А7553, Поинте Сциентифиц, Цантон, МИ), као што је претходно описано (20, 33). пХ урина је мерен помоћу микро-пХ електроде (РОСС семи-мицро пХ, Орион 8103БН, Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА). Титрациона екскреција киселине је одређена коришћењем претходно описаних стандардних техника (20, 33).

Антитела

Табела 1 приказује антитела коришћена у овој студији, њихове добављаче и њихове каталошке/идентификационе бројеве.

екстракт цистанцхе тубулоса повећава тестостерон и повећава сексуалну способност

Припрема протеина

Животиње су анестезиране инхалационим изофлураном, а бубрези су испрани ин виво срчаном перфузијом са ПБС (пХ 7,4) који садржи 6,000 У/Л На-хепарина и 120 мг/Л лидокаина. Десни бубрег је брзо уклоњен, а кортекс, спољашња и унутрашња медула су изоловани на хладном нивоу под микроскопом за сецирање. Узорци су брзо замрзнути у течном азоту и чувани замрзнути на - 80 степени до употребе. Ткива су хомогенизована у реагенсу за екстракцију протеина ткива Т-ПЕР (Пиерце Биотецхнологи, Роцкфорд, ИЛ) коришћењем тучака за микроепрувете (УСА Сциентифиц, Оцала, ФЛ), а протеин је екстрахован према препорукама произвођача. Аликвот је коришћен за квантификацију укупног протеина коришћењем теста бицинхонинске киселине (БЦА), а остатак је чуван замрзнут на 80 степени до употребе.

Имуноблот процедуре Десет микрограма бубрежног протеина је подвргнуто електрофорези на 10 процентном ПАГЕ РеадиГелу (Био-Рад, Херцулес, ЦА). Гелови су електрофоретски пребачени на нитроцелулозне мембране, блокирани са 5 г/дЛ немасног сувог млека разблаженог у Блотто пуферу (50 мМ Трис, 150 мМ НаЦл, 5 мМ На2ЕДТА и 0,05 процената Твеен 20, пХ 4 Ццуба преко ноћи на 7,6) са примарним антителом у немасном сувом млеку. Еквивалентност оптерећења и преноса је процењена помоћу Понцеау С бојења и проценом експресије кућног протеина б-актина. Након испирања, мембране су биле изложене секундарном антителу (козји анти-зечји ИгГ, Целл Сигналинг Тецхнологи, Беверли, МА) коњугованом са пероксидазом рена у разблажењу од 1:5,000. Места реакције антитело-антиген су визуелизована коришћењем побољшане хемилуминисценције (СуперСигнал Вест Пицо Субстрате, Пиерце) и Кодак Имаге Статион 440ЦФ дигиталног система за снимање. У одабраним експериментима, мрље су скинуте. Густина трака је нормализована тако да је средња густина у региону (кортекс или спољна мождина) у мушком ткиву дивљег типа (ВТ) била 100. Оба пола (мушки и женски) и оба генотипа (ВТ и КО) били су учитани на исто гел за ове експерименте. Одсуство засићења потврђено је испитивањем дистрибуције интензитета пиксела у свим имуноблотовима.

Имуноблот процедуре

Десет микрограма бубрежног протеина је подвргнуто електрофорези на 10 процентном ПАГЕ РеадиГел-у (БиоРад, Херцулес, ЦА). Гелови су електрофоретски пребачени на нитроцелулозне мембране, блокирани са 5 г/дЛ немасног сувог млека разблаженог у Блотто пуферу (50 мМ Трис, 150 мМ НаЦл, 5 мМ На2ЕДТА и 0,05 процената Твеен 20, пХ 4 цуба на 7,6) и уЦ преко ноћи са примарним антителом у немасном сувом млеку. Еквивалентност оптерећења и преноса је процењена помоћу Понцеау С бојења и проценом експресије кућног протеина б-актина. Након испирања, мембране су изложене секундарном антителу (козји анти-зечји ИгГ, Целл Сигналинг Тецхнологи, Беверли, МА) коњугованом са пероксидазом рена у разблажењу од 1:5,000. Места реакције антитело-антиген су визуелизована коришћењем побољшане хемилуминисценције (СуперСигнал Вест Пицо Субстрате, Пиерце) и Кодак Имаге Статион 440ЦФ дигиталног система за снимање. У одабраним експериментима, мрље су скинуте. Густина трака је нормализована тако да је средња густина у региону (кортекс или спољна мождина) у мушком ткиву дивљег типа (ВТ) била 100. Оба пола (мушки и женски) и оба генотипа (ВТ и КО) били су учитани на исто гел за ове експерименте. Одсуство засићења потврђено је испитивањем дистрибуције интензитета пиксела у свим имуноблотовима.

Припрема ткива за имунохистохемију

Мишеви су анестезирани инхалацијским изофлураном. Бубрези су сачувани ин виво срчаном перфузијом са ПБС (пХ 7,4) који садржи 6,000 У/Л На-хепарина и 120 мг/Л лидокаина, а затим перјодат-лизин-2 проценат параформалдехида, исеците попречно на неколико кришки дебљине од 2- до 3- мм, а затим потопите 24–30 х на 4 степена у исти фиксатив. Узорци бубрега сваке животиње су уграђени у полиестерски восак направљен од полиетилен гликол 400 дистеарата (Полисциенцес, Варрингтон, ПА) са 10 процената 1-хексадеканола и 2- мм дебљине пресеке су исечене и монтиране на желатином обложене слајдова.

корист цистанцхе тубулоса: повећање сексуалне способности

Имунохистоцхемистри

Имунолокализација за Рх фамилије Б гликопротеина (Рхбг), Рх фамилије Ц гликопротеина (Рхцг), Наþ /Хþ измењивача изоформе 3 (НХЕ3), глутамин синтетазе (ГС), НКЦЦ2 и АР је обављена коришћењем претходно описаних процедура имунопероксидазе22,20, 34–37). Укратко, секције су депаратизоване у етанолу, рехидриране, загрејане у Трилоги (Целл Маркуе, Роцклин, ЦА) на 88 Ц током 30 минута, а затим на 96 степени током 30 минута, охлађене 30 минута и испране у ПБС. Активност ендогене пероксидазе је блокирана инкубацијом секција у 3% Х2О2 у дестилованој води током 45 минута. Секције су блокиране 15 минута протеинским блоком без серума (Дако Цитоматион), а затим инкубиране преко ноћи на 4 Ц са примарним антителом. Секције су испране у ПБС, инкубиране 30 минута са коњугираним ИгГ коња против зеца коњу везаним с пероксидазом (ИммПРЕСС, Вецтор Лабораториес, Бурлингаме, ЦА), поново испрани ПБС, а затим изложени диаминобензидину 5 мин. Секције су испране дестилованом водом, дехидриране ксилелом, монтиране и посматране светлосном микроскопијом. Направљена су поређења обележавања између делова из истог имунохистохемијског експеримента. Секције су прегледане на Зеисс Акио Имагер А2 микроскопу опремљеном ДИЦ оптиком и фотографисане коришћењем дигиталног фотоапарата у боји Акиоцам 305 и софтвера Зен 2.3 (Зеисс).

Имунолокализација за фосфоенолпируват карбоксикиназу (ПЕПЦК) је обављена коришћењем модификованих имунопероксидазних процедура као што је претходно описано (20, 22, 38–40). Укратко, секције су депаразиране у етанолу, рехидриране, загрејане у Трилоги (Целл Маркуе, Роцклин, ЦА) на 96 Ц током 60 мин, охлађене 30 мин и испране у ПБС. Активност ендогене пероксидазе је блокирана инкубацијом пресека у 3% Х2О2 у метанолу током 45 мин. Секције су третиране са 0.5 процената Тритон Кс-100 у ПБС-у током 15 минута. Секције су затим подвргнуте неколико испирања у ПБС-у који садржи 1 проценат БСА, 0.05 процената сапонина и 0,2 процента желатина, након чега је уследило блокирање током 15 минута са протеинским блоком без серума (ДАКО Цитоматион) и затим инкубирано преко ноћи на 4 Ц са примарним антителом. Секције су испране у ПБС-у који садржи 0,1 процената БСА, 0,05 процената сапонина и 0,2 процента желатина, а затим ПБС и инкубирани 60 минута са козјим анти-зечјим ИгГ коњугованим са полимером повезаним са пероксидазом (МАЦХ2, Биоцаре Медицал, Цонцорд, ЦА), поново испран у ПБС, а затим изложен диамино-бензидину 5 мин.

Негативе Цонтрол

Сваки имунохистохемијски експеримент укључивао је део који је био изложен поступцима имунообележавања без примарних антитела како би се осигурало да је обележавање последица само примарног везивања антитела.

Морфометријска анализа

Запреминска густина проксималног тубула у кортексу и спољашњој траци спољашње мождине, као и сабирног канала у кортексу и унутрашње траке спољашње мождине је одређена коришћењем стандардних техника бројања тачака као што је претходно описано (20–22, 41 ).

Квантитативна имунохистохемија

Квантитативна имунохистохемија је изведена као што смо претходно описали и потврдили (20, 22, 33, 37, 42). Сегменти проксималних тубула су проучавани у секцијама обележеним под идентичним условима у истом експерименту имунообележавања од стране посматрача који је заслепио третирану групу. Измерени специфични сегменти проксималног тубула били су почетни проксимални увијени тубул (ПЦТ), дефинисан као ПЦТ сегменти који су континуирани са Бовмановом капсулом, проксимални равни тубул (ПСТ) у медуларном зраку и ПСТ у спољној траци спољашње мождине. Користили смо дигиталне микрофотографије високе резолуције снимљене насумично одабраних поља кортекса бубрега и спољне траке спољашње мождине помоћу Зеисс Акио Имагер А2 микроскопа опремљеног дигиталном камером у боји Акиоцам 305 и софтвером Зен 2.3 (Зеисс) без употребе техника побољшања слике. . Користећи софтвер ИмагеЈ (в, 1.34ј, Национални институт за здравље, Бетхесда, МД), измерили смо интензитет пиксела преко праве линије повучене од лумена тубула кроз појединачну ћелију. Ови подаци су затим анализирани коришћењем прилагођеног софтвера који је изведен у програму Мицрософт Екцел 2016. Нето интензитет на сваком пикселу на линији је затим одређен као разлика између апсолутног интензитета и средњег интензитета позадинског пиксела измереног ван ћелије. Укупна ћелијска експресија одређена је интегрисањем нето интензитета пиксела у целој ћелији. Висина ћелије је одређена као растојање у пикселима између апикалних и базолатералних ивица ћелија и претворена у апсолутну дужину коришћењем калибрисаног одређивања величине појединачних пиксела. Анализирано је најмање 15 појединачних ћелија са најмање четири микрофотографије из сваког бубрега. Подаци из свих испитиваних ћелија датог типа сегмента проксималног тубула су усредњени да би се добила једна тачка података по животињи за статистичку анализу.

Одредили смо да интеркалирана величина ћелије типа А и експресија протеина специфична за ћелију као што је претходно описано (20, 22). Укратко, добили смо дигиталне микрографије велике снаге унутрашње траке спољашње мождине делова ткива који су били подвргнути имунохистохемији за интеркалирани ћелијски специфични маркер Рхбг или Рхцг. Појединачне интеркалиране ћелије су ограничене коришћењем софтвера ИмагеЈ (в. 1.34ј, Национални институти за здравље). Величина ћелије је одређена као број пиксела унутар наведених региона и конвертована у површину коришћењем калибрисаног мерења пиксела по микрометру. Интензитет имуноознаке на сваком пикселу одређен је као разлика између апсолутног интензитета пиксела и средњег интензитета позадине, а интензитет имуноознаке једне ћелије је одређен интегрисањем нето интензитета пиксела унутар ћелије коришћењем прилагођеног софтвера који је изведен у Мицрософт Екцел 2016.

цистанцхе лечи болест бубрега како би повећао сексуалну способност

РЕЗУЛТАТИ

Верификација брисања АР специфичног за бубреге

Фармаколошка блокада АР или глобална делеција индукује широк спектар фенотипских промена (43), које могу индиректно да измене бубрежне структурне и реакције амонијака. Да бисмо избегли ове проблеме, генерисали смо КС-АР-КО мишеве користећи Цре локП технике. Потврдили смо ефикасност реналне АР делеције помоћу имунохистохемије (слика 1). Код ВТ мишева, имунохистохемија је показала нуклеарну АР имуноознаку ограничену на проксимални тубул; ово је било слично нашим налазима код нормалног мишјег бубрега (22). У КО бубрегу, није било детектабилне имуноознаке АР ни код једног пола (слика 1). Ови налази показују генерацију мишева са брисањем АР бубрега.

статистичка анализа коришћењем софтвера СПСС (26.2) и Мицрософт Екцел 2016.

Пошто тестостерон има бројне ванбубрежне ефекте, који би индиректно могли да промене бубрежне ацидо-базне механизме, размотрили смо могућност да КС-АР-КО може да промени нивое тестостерона или естрадиола у плазми. Међутим, концентрације тестостерона и естрадиола у плазми нису се значајно разликовале између ВТ и КО мишева оба пола (Табела 2).

Физиолошка карактеризација брисања АР специфичне за бубреге Телесна тежина била је већа код ВТ мужјака него код ВТ женки мишева упркос томе што није било полне разлике у уносу хране, као што је раније објављено (22), што је у складу са познатим екстрареналним ефектима пола на телесну тежину. Међутим, КС-АР-КО није променио дневни унос хране или телесну тежину ни код једног пола (табела 2).

Тежина бубрега била је значајно већа код мужјака ВТ мишева него код женки ВТ мишева (слика 2), слично ономе што смо раније пријавили код нормалних мишева (22). КС-АР-КО је значајно смањио тежину бубрега код мужјака КС-АР-КО мишева, до те мере да се тежина бубрега код мужјака КС-АР-КО није значајно разликовала од тежине бубрега ВТ или КС-АР-КО код женке (слика 2) . Код женки мишева, КС-АР-КО није значајно променио тежину бубрега. Дакле, ефекат пола на тежину бубрега захтева експресију АР у мушком бубрегу.

Ни концентрације Наþ, К þ, ни концентрације бикарбоната у плазми нису се значајно разликовале између ВТ и КС-АР-КО мишева оба пола (Табела 2). Клиренс урее, коришћен као маркер брзине гломеруларне филтрације, није се значајно разликовао између ВТ и КС-АР-КО мишева оба пола (Табела 2).

Нето излучивање киселине

Нето излучивање киселине укључује два процеса: излучивање амонијума (НХ4þ ) и излучивање киселине која се може титрирати. Код мужјака мишева, КС-АР-КО је значајно повећао излучивање амонијака, што је елиминисало полну разлику у излучивању амонијака (слика 2). КС-АР-КО није значајно променио излучивање амонијака код женки мишева. КС-АР-КО није значајно променио излучивање киселине за титрацију ни код једног пола (Табела 2). пХ урина је значајно смањен КС-АР-КО код мужјака мишева, али не и код женки мишева (Табела 2); међутим, ефекат КС-АР-КО на излучивање амонијака је опстао након статистичког разматрања пХ урина (П < 0.001="" према="" анова).="" дакле,="" проксимални="" тубул="" ар="" посредује="" у="" полним="" разликама="" у="" излучивању="" амонијака="" код="" мужјака="" мишева,="" али="" његово="" брисање="" није="" имало="" значајан="" утицај="" на="" излучивање="" амонијака="" код="" женки="">

Ефекат брисања АР специфичне за бубреге на структуру проксималних тубула

Проксимални тубули чине већи удео запремине коре у мушком бубрегу него у женском бубрегу, и то зависи од тестостерона (20, 22). Тако смо утврдили ефекте делеције КС-АР код мужјака и женки мишева на структуру проксималних тубула. Користећи ПЕПЦК имуноознаку као маркер специфичног за проксималне тубуле, имунохистохемија је квалитативно показала да КС-АР-КО смањује удео кортекса који је био проксимални тубул (слика 3А). Квантитативна анализа, коришћењем формалних техника бројања тачака (41), показала је да КС-АР-КО значајно смањује запреминску густину проксималних тубула у кортексу мушкараца, што је паралелно са променом тежине бубрега (слика 3Б). Насупрот томе, у спољној траци спољашње мождине, КС-АР-КО није значајно променио запреминску густину проксималних тубула код мужјака мишева (слика 3Б). Код женки мишева, КС-АР-КО није квалитативно променио удео кортекса који је био проксимални тубул (слика 3А) и квантитативно није променио запреминску густину проксималног тубула ни у кортексу ни у спољашњој медули (слика 3Б). Полна разлика у запреминској густини кортикалних проксималних тубула присутна код ВТ мишева није била присутна код КС-АР-КО мишева. Дакле, у мушком бубрегу, АР посредује у полним разликама у запреминској густини проксималних тубула у кортексу. У спољашњој медули, изгледа да експресија АР не утиче на запреминску густину проксималних тубула ни код једног пола.

Чини се да ове промене у структури проксималних тубула код мушких КС АР-КО мишева укључују промене у величини ћелије. Код мужјака мишева, КС-АР-КО је значајно смањио висину ћелије проксималних тубула и у ПЦТ и у кортикалном ПСТ, тј. у целом кортексу (слика 3Ц). Висина ћелије у ПСТ у спољашњој медули није значајно промењена (слика 3Ц). Ови резултати су паралелни налазима запреминске густине. Брисање АР специфично за бубреге код женки мишева није променило висину ћелија проксималних тубула ни у ПЦТ, ни у кортикалном ПСТ, ни у ПСТ у спољашњој медули, што је паралелно са недостатком ефекта на запреминску густину и укупну величину бубрега у женском бубрегу (Сл. 2Б).

Тежина бубрега, запреминска густина кортикалних проксималних тубула и висина ћелије у ПЦТ-у и кортикалном ПСТ-у били су већи у ВТ мушком бубрегу него у ВТ женском бубрегу, што је паралелно са нашим претходним запажањима (20, 22). Код мужјака КС-АР-КО мишева, ова полна разлика више није постојала, и сваки од ових параметара се није значајно разликовао од оног уоченог ни код ВТ ни КС-АР-КО женки мишева. Дакле, полне разлике у тежини бубрега, запреминској густини кортикалних проксималних тубула и висини ћелије у ПЦТ и кортикалном ПСТ зависе од АР експресије.

Ефекат брисања АР специфичног за бубреге на структуру сабирног канала

Постоје важне полне разлике у сабирном каналу, при чему је запреминска густина сабирног канала већа у односу на пропорцију кортекса или спољашње мождине која је била сабирни канал код мужјака или женки мишева (слика 4А). Квантитативна морфометријска анализа је показала да КС-АР-КО није значајно променио запреминску густину сабирних канала ни у кортексу ни у спољашњој медули ни код једног пола (слика 4Б). Дакле, бубрежни АР не посредује у сексуалном диморфизму у запреминској густини сабирних канала.

Експресија амонијачног ензима Резултати у нето излучивању киселине показују да делеција АР-а специфично за бубреге повећава излучивање амонијака код мужјака мишева иако смањује запреминску густину проксималних тубула и висину ћелија у кортексу. Ово указује да се ефекти на излучивање амонијака не могу приписати једноставно хипертрофији проксималних тубула која доводи до повећане генезе амонијака, већ су резултат одвојених и специфичних ефеката на генезу амонијака и/или транспорт амонијака. Стога смо затим испитали кључне протеине који су укључени у настанак амонијака и транспорт амонијака.

ПЕПЦК је кључни ензим проксималних тубула потребан за настанак амонијака и налази се искључиво у проксималним тубулима у бубрегу (16, 44). Код мужјака мишева, КС-АР-КО је значајно повећао експресију кортикалне ПЕПЦК; није било ефекта КС-АР-КО код женки мишева (слика 5А). Повећање експресије ПЕПЦК код мушких КС-АР-КО мишева елиминисало је полну разлику код ВТ мишева (слика 5А). Испитивање експресије ПЕПЦК имунообележака показало је да су мушки КС-АР-КО мишеви имали већи интензитет ПЕПЦК имуноознаке у ПЦТ и кортикалном ПСТ од ВТ мишева (слика 5Б). У спољној траци спољашње мождине, није било видљиве разлике у интензитету ПЕПЦК имуноознаке (слика 5Б). Квантитативна имунохистохемија мужјака мишева показала је да КС-АР-КО значајно повећава интензитет ПЕПЦК имуноознаке у ПЦТ и кортикалном ПСТ, али не и у спољашњој траци спољашње мождине (Слика 5Ц). Дакле, код мужјака мишева, али не и код женки мишева, експресија АР проксималних тубула смањује експресију ПЕПЦК у сегментима кортикалних проксималних тубула, али не и у ПСТ у спољашњој медули.

Проксимални тубул има способност рециклаже амонијака укључујући ГС (37, 42, 45, 46). Ни код мужјака ни код женки мишева КС-АР-КО није значајно променио ГС експресију (слика 5Д). Дакле, изгледа да бубрежни АР не модулише експресију ГС.

Ефекат брисања АР специфичне за бубреге на експресију НБЦе1

НБЦе1 је протеин интегралне мембране проксималног тубула са главном улогом у реапсорпцији филтрираног бикарбоната који такође регулише метаболизам амонијака (47–49). Две варијанте спајања НБЦе1, НБЦе1-А и НБЦе1-Б, присутне су у бубрезима миша (50, 51). Користећи пан-НБЦе1 антитело, које препознаје обе варијанте НБЦе1, открили смо да КС-АР-КО значајно смањује експресију НБЦе1 у кортикалном ткиву у мушком, али не и женском бубрегу (слика 6А).

Ефекат делеције АР специфичне за бубреге на транспортере амонијака Бубрежно излучивање амонијака укључује координирани транспорт НХ3/НХ4þ специфичним мембранским протеинима (10, 16, 52). Ово укључује транспортере у проксималном тубулу (НХЕ3), ТАЛ Хенлеове петље (НКЦЦ2), а имуноознака сабирног канала није била детектована у сегментима спољашњих медуларних проксималних тубула (слика 6Ц), као што је раније објављено (48). Затим смо користили квантитативну имунохистохемијску анализу да квантификујемо промене специфичне за сегмент у експресији НБЦе1-А. Ово је показало да КС-АР КО код мужјака мишева смањује експресију НБЦе1-А у ПЦТ и кортикалном ПСТ-у, тј. у целом кортексу (слика 6Д). Дакле, експресија АР регулише НБЦе1-израз кортикалног проксималног тубула у мушком бубрегу, али не и у женском бубрегу.

(Рхбг и Рхцг). Полне разлике у излучивању амонијака корелирају са разликама у експресији сваког од њих (6, 20), а тестостерон регулише експресију и НХЕ3 и НКЦЦ2 (22). НКЦЦ2 посредује у реапсорпцији ТАЛ амонијака (10, 16, 52). Код мужјака мишева, КС-АР-КО је значајно повећао експресију протеина НКЦЦ2 коришћењем имуноблот анализе; код женки мишева није било значајне промене (слика 8). Ова промена у експресији код мужјака мишева вероватно доприноси измењеном ранжирању медуларног амонијака и на тај начин олакшава ефекат КС-АР-КО на повећање излучивања амонијака код мужјака мишева.

Рх гликопротеини Рхбг и Рхцг су примарни протеини који посредују у излучивању амонијака у сабирним каналима, а њихова експресија је генерално паралелна променама у излучивању амонијака (10, 16, 52). Међутим, КС-АР-КО није значајно променио експресију Рхбг протеина ни код мужјака ни код женки КС-АР-КО мишева ни у кортексу ни у унутрашњој траци спољашње мождине (слика 9). Ефекти на експресију Рхцг били су слични. Рхцг имунохистохемија, процењена квалитативно и коришћењем квантитативне имунохистохемије, није показала значајне промене у интензитету Рхцг имуноознаке у интеркалираним ћелијама спољашње траке спољашње мождине код оба пола (Слика 10). Дакле, изгледа да бубрежни АР не модулира ни Рхбг ни Рхцг експресију.

ДИСКУСИЈА

Ова студија пружа важне нове информације у вези са механизмом како АР модулира сексуалне диморфизме у бубрезима. Пошто АР има бројне ван-бубрежне улоге, што би могло да закомпликује разумевање његове улоге у бубрезима, креирали смо првог КС-АР-КО миша. КС-АР-КО код мужјака мишева повећао је излучивање амонијака, али је смањио укупну величину бубрега, запреминску густину проксималних тубула и висину ћелија проксималних тубула, елиминишући претходно идентификоване полне разлике. Експресија вишеструких кључних протеина (ПЕПЦК и НКЦЦ2) укључених у руковање амонијаком повећана је КС-АР-КО, вероватно доприносећи повећаном излучивању амонијака. Истовремено, смањена је експресија других протеина (НХЕ3 и НБЦе1-А), што ће имати тенденцију да ублажи промене у излучивању амонијака. КС-АР-КО није имао уочљив ефекат код женки мишева или у сабирним каналима оба пола. Табела 3 показује ове ефекте. Ови налази сугеришу да руковање бубрежним амонијаком и структура проксималних тубула укључују реналне АР-зависне сигналне путеве у кортексу мушког бубрега, али не и у женском бубрегу и не у спољашњој медули оба пола.

Први велики налаз у овој студији је да експресија АР посредује полне разлике у величини бубрега. Претходне студије на људима, пацовима и мишевима су показале да је мушки бубрег већи од женског (3, 56, 57). Први доказ да је ово укључивало сигнални пут зависан од тестостерона било је запажање да прекомерна примена андрогена квалитативно повећава величину проксималних тубула пацова (57). Додатни докази код одраслих мушкараца сугеришу да постоји дозно-зависно повећање запремине бубрега, са процењеним повећањем од 404-цм3 на 100 мг недељног додатка тестостерона (58). Недавно смо показали да мушки мишеви имају већу величину бубрега и проксималних тубула него женке (20, 22) и да су ове разлике зависне од тестостерона (22). У складу са овим претходним налазима, ова студија показује да код мушких мишева, бубрежна АР експресија регулише и цео бубрег и величину проксималних тубула. Штавише, КС-АР-КО доводи до тога да је величина бубрега код мушкараца иста као код жена са интактном експресијом АР. Дакле, код мужјака мишева, тестостерон који делује преко бубрежних АР-зависних сигналних путева може у потпуности да објасни сексуални диморфизам у бубрезима и величини проксималних тубула.

Други главни налаз је да су полне разлике у излучивању амонијака посредоване путем путева зависних од АР код мужјака мишева. Наше претходне студије су показале да женке мишева излучују приближно двоструко више амонијака у урину него мужјаци мишева (20–22), користе различите путеве одговора да реагују на оптерећење киселином (21) и да разлика у базалном излучивању амонијака укључује зависност од тестостерона. механизам (22). Ова студија проширује ове налазе показујући да КС-АР-КО елиминише сексуални диморфизам у излучивању амонијака. Промене у исхрани фиксних киселинских оптерећења могу променити излучивање амонијака, али промене у излучивању амонијака код мишева са брисањем АР не могу се приписати овом механизму јер КС-АР-КО није променио унос хране. Већина промена које се јављају у метаболизму амонијака, као што се дешава са метаболичком ацидозом или хипокалемијом, резултирају променама у величини бубрега и проксималних тубула које су паралелне са излучивањем амонијака (59–61). Међутим, мужјаци мишева са бубрежном АР делецијом имају повећано излучивање амонијака, али смањену укупну величину бубрега и проксималних тубула, што указује да ефекат на излучивање амонијака није неспецифичан одговор на промене у бубрежној маси. Ова неконгруентна величина бубрега и одговор на амонијак као одговор на реналну АР делецију су паралелни налазима у нашим претходним студијама коришћењем модела гонадектомије који је проценио ефекат тестостерона (22). Дакле, код мужјака мишева, тестостерон који делује преко бубрежне АР код мужјака регулише излучивање амонијака путем путева који нису повезани са ефектима на величину бубрега, величину проксималних тубула и ендогено оптерећење киселинама повезано са уносом хране.

Већина стварања амонијака се јавља у проксималном тубулу. Наш претходни рад је идентификовао сексуалне диморфизме у стварању амонијака у проксималним тубулима који зависе од тестостерона добијеног из тестиса (22). Резултати ове студије додатно проширују ове налазе показујући да бубрежни АР код мужјака мишева регулише експресију ензима који ствара амонијак ПЕПЦК, али не и ензима за рециклажу амонијака ГС. Овај ефекат на експресију ПЕПЦК није неспецифичан ефекат који се односи на промене у величини проксималних тубула, пошто су ефекти делеције реналне АР на величину проксималних тубула супротни његовим ефектима на експресију ПЕПЦК. Штавише, налаз да брисање АР бубрега не мења експресију ГС указује на то да је ГС регулисан механизмима који се разликују од оних који се користе за ПЕПЦК.

Амонијак произведен у проксималном тубулу се првенствено лучи у луминалну течност преко апикалног механизма који зависи од НХЕ{0}}а (54, 55). Претходне студије су показале да губитак тестостерона смањује експресију НХЕ3 (22, 62). Налази ове студије даље проширују ове налазе показујући да ренална АР делеција код мужјака мишева смањује експресију НХЕ3. Дакле, чини се да тестостерон који делује кроз АР активацију повећава експресију НХЕ3 кортикалних проксималних тубула. Међутим, важно је препознати да ови ефекти нису паралелни са излучивањем амонијака и уместо тога би се предвиђало да минимизирају уочене промене у излучивању амонијака. Уместо тога, пошто је НХЕ3 такође критичан за реапсорпцију филтрираног НаЦл и воде, ови ефекти могу допринети већој реапсорпцији НаЦл у проксималним тубулима присутној код мушкараца (6, 7).

Реапсорпција амонијака у ТАЛ-у успоставља интерстицијски градијент амонијака неопходан за сакупљање лучења амонијака у каналима (63, 64). Претходне студије наше групе су показале да је експресија НКЦЦ2 већа код женки мишева него код мужјака мишева (20–22), да постоји сексуални диморфизам у одговору НКЦЦ2 на оптерећење киселином (21) и да је разлика у базалној експресији НКЦЦ2 укључује механизам зависан од тестостерона (22). Ова студија показује да је губитак бубрежног АР код мушких мишева повећао експресију НКЦЦ2. Величина овог ефекта била је скоро идентична разлици коју смо идентификовали између мужјака и женки мишева (20, 21) иу тренутној студији је елиминисао сексуални диморфизам експресије НКЦЦ2. Штавише, идентификована разлика између мужјака мишева са интактном бубрежном АР и делецијом АР паралелна је са нашим претходно идентификованим разликама између мужјака мишева са орхиектомијом у поређењу са нетакнутим и лажно оперисаним контролама (24). Дакле, чини се да тестостерон који делује кроз АР посредује у сексуалном диморфизму у експресији НКЦЦ2. Међутим, чини се да је ова регулација индиректна, пошто није било детектабилне експресије АР у ТАЛ-у ни у нашем претходном извештају (22) ни у овој студији. Један од могућих индиректних механизама који објашњава ово запажање је да код мушкараца, АР делеција доводи до смањене величине проксималних тубула што у комбинацији са смањеном експресијом НХЕ3 проксималног тубула повећава повећану испоруку растворене супстанце у ТАЛ, што стимулише експресију НКЦЦ2.

Секреција амонијака у сабирним каналима је главна детерминанта излучивања амонијака у урину, а Рх гликопротеини Рхбг и Рхцг су примарни транспортери амонијака у сабирним каналима (16, 65–68). Раније смо показали сексуалне диморфизме у запреминској густини сабирних канала и експресији Рх гликопротеина, при чему су женке мишева имале већу запреминску густину сабирних канала, интеркалирану величину ћелије и експресију Рхбг и Рхцг (20). Ова студија није пронашла уочљиве промене у запреминској густини сабирних канала или експресији Рхбг и Рхцг као одговор на КС-АР-КО код мужјака или женки мишева. Ово је паралелно са недостатком ефекта недостатка тестостерона, изазваног орхиектомијом, на запреминску густину сабирних канала, интеркалисану величину ћелија и експресију Рхбг и Рхцг (22). Закључујемо да се полни диморфизам у сабирном каналу јавља кроз механизме који не укључују тестостерон и сигналне путеве зависне од АР.

Чини се да спољашња медула другачије реагује на секс, тестостерон и АР него кортекс. За разлику од кортекса бубрега, у спољашњој медули нема полног диморфизма у запреминској густини проксималних тубула или висини проксималних тубула (20), нема ефекта недостатка тестостерона изазваног орхиектомијом на ове параметре (22) и нема ефекта бубрежне функције. АР делеција (садашња студија). Овај недостатак ефекта секса, тестостерона и експресије АР није последица одсуства експресије АР, јер смо показали експресију АР кроз цео проксимални тубул, укључујући и спољашњу медулу (22). Разумевање механизама који леже у основи ове аксијалне разлике у одговору проксималних тубула на пол, тестостерон и АР биће важан пут за будућа истраживања.

Коначно запажање је да брисање АР није имало уочљиве ефекте на женски бубрег. АР је присутан у целом проксималном тубулу код оба пола, и иако је изражен на нижим нивоима код жена, апсолутна разлика у експресији је била само - 50 процената (22). Делимично, недостатак ефекта брисања АР може указивати на смањену активацију АР циркулишућим тестостероном, који је, као што је приказано у овој студији, знатно мањи код жена него код мушкараца. Међутим, имунохистохемија указује на значајну нуклеарну локализацију АР у женском бубрегу (Реф. 22 и ова студија), што типично указује на активацију сигналних процеса зависних од АР. Ова запажања сугеришу могућност да друге разлике зависне од пола нарушавају АР зависне сигналне механизме у женским проксималним тубулима.

Перспективе и значај

Боље разумевање механизма и биолошких импликација утицаја пола на структуру бубрега и метаболизам амонијака је кључно за оптимизацију наше способности да бринемо и о мушкарцима и женама са ацидобазним поремећајима. Упркос недавном напретку у нашем разумевању утицаја секса на метаболизам амонијака и улогу бубрежне АР, потребне су додатне студије. Засигурно постоје ефекти секса независни од тестостерона, чији механизам је тренутно несхваћен. Било да ово укључује директне ефекте других полних стероидних хормона, као што су естрогени или прогестерон, индиректни ефекти активације АР проксималних тубула или ефекти полних хромозома који су независни од хормона гонаде биће важна питања за будуће студије.

цистанцхе ублажава проблеме са бубрезима и појачава кфункција бубрега

ЗАХВАЛНИЦЕ

Захваљујемо др. Схарон В. Маттхевс и Цхао Цхен (Универзитет Флорида, Медицински факултет, језгра лабораторије за електронску микроскопију) на одличној обради ткива за наше имунохистохемијске експерименте. Захваљујемо се Центру Медицинског факултета Универзитета Вирџиније за истраживање репродукцијског лиганда и језгру за анализу за мерење нивоа тестостерона у серуму. Захваљујемо др Гејл Принс на снабдевању антитела против АР и на њиховој стручности у АР.

ОТКРИВАЊА

Аутори не изјављују никакав сукоб интереса, финансијски или било који други.

ПРИЛОЗИ АУТОРА

АНХ и ИДВ су осмислили и осмислили истраживање; АНХ, РАЦ, Х.-ВЛ и ЈВВ су извели експерименте; АНХ, РАЦ, Х.-ВЛ, ЈВВ и ИДВ анализирани подаци; АНХ, РАЦ, ЈВВ и ИДВ интерпретирали су резултате експеримената; АНХ је припремио бројке; АНХ је израдио рукопис; АНХ, РАЦ, Х.-ВЛ, ЈВВ и ИДВ су уредили и ревидирали рукопис; АНХ, РАЦ, Х.-ВЛ, ЈВВ и ИДВ одобрили су коначну верзију рукописа.

РЕФЕРЕНЦЕ

1. Комитет Института за медицину за разумевање биологије пола и рода Д; Виземанн ТМ, Пардуе МЛ (Уредници). Истраживање биолошких доприноса људском здрављу: да ли је секс битан? Васхингтон, ДЦ: Натионал Ацадемиес Пресс, 2001. дои: 10.17226/10028.

2. Карп НА, Масон Ј, Беаудет АЛ, Бењамини И, Бовер Л, Браун РЕ, ет ал. Преваленција полног диморфизма у фенотипским особинама сисара. Нат Цоммун 8: 15475, 2017. дои: 10.1038/нцоммс15475.

3. Саболић И, Асиф АР, Будацх ВЕ, Ванке Ц, Бахн А, Бурцкхардт Г. Родне разлике у функцији бубрега. Пфлугерс Арцх 455: 397–429, б2007. дои:10.1007/с00424-007-0308-1.

4. Рамирез ЛА, Сулливан ЈЦ. Полне разлике код хипертензије: где смо били и куда идемо. Ам Ј Хипертенс 31: 1247–1254, 2018. дои:10.1093/ајх/хпи148.

5. Лаитон АТ, Сулливан ЈЦ. Недавни напредак у полним разликама у функцији бубрега. Ам Ј Пхисиол Ренал Пхисиол 316: Ф328–Ф331, 2019. дои:10.1152/ајпренал.00584.2018.

6. Веритас ЛЦ, Гирарди АЦЦ, Цурри Ј, Пеи Л, Ралпх ДЛ, Тран А, Цастело-Бранцо РЦ, Пастор-Солер Н, Арранз ЦТ, Иу АСЛ, МцДоноугх АА. Сексуални диморфни образац бубрежних транспортера и хомеостазе електролита. Ј Ам Соц Непхрол 28: 3504–3517, 2017. дои: 10.1681/АСН.

7. Ли К, МцДоноугх АА, Лаитон ХЕ, Лаитон АТ. Функционалне импликације полног диморфизма образаца транспортера заједно са проксималним тубулом пацова: моделирање и анализа. Ам Ј Пхисиол Ренал Пхисиол 315: Ф692–Ф700, 2018. дои:10.1152/ајпренал.00171.2018.

8. Митцх ВЕ. Метаболичке и клиничке последице метаболичке ацидозе. Ј Непхрол 19 Суппл 9: С70–С75, 2006.

9. Хамм ЛЛ, Накхоул Н, Херинг-Смитх КС. Ацид-базна хомеостаза. Цлин Ј Ам Соц Непхрол 10: 2232–2242, 2015. дои: 10.2215/ ЦЈН.07400715.

10. Веинер ИД, Митцх ВЕ, Сандс ЈМ. Метаболизам уреје и амонијака и контрола излучивања азота путем бубрега. Цлин Ј Ам Соц Непхрол 10: 1444–1458, 2015. дои: 10.2215/ЦЈН.10311013.

11. Погрешно О, Давиес ХЕ. Излучивање киселине код болести бубрега. КЈ Мед 28: 259–313, 1959.

12. Баертл ЈМ, Санцетта СМ, ​​Габузда ГЈ. Повезаност акутног недостатка калијума са метаболизмом амонијума у ​​бубрезима код пацијената са цирозом. Ј Цлин Инвест 42: 696–706, 1963. дои: 10.1172/ЈЦИ104761.

13. Махер Т, Сцхамбелан М, Куртз И, Хунтер ХН, Јонес ЈВ, Себастиан А. Побољшање метаболичке ацидозе ограничењем калијума у ​​исхрани код пацијената са хиперкалемијом са хроничном бубрежном инсуфицијенцијом. Ј Лаб Цлин Мед 103: 432–445, 1984.

14. Схеар Л, Габузда ГЈ. Недостатак калијума и ендогено преоптерећење амонијумом из бубрега. Ам Ј Цлин Нутр 23: 614–618, 1970. дои: 10.1093/ацне/23.5.614. Ф642 АЈП-Ренал Пхисиол дои:10.1152/ајпренал.00260.2021 ввв.ајпренал.орг

15. Таннен РЛ, МцГилл Ј. Утицај калијума на производњу амонијака у бубрезима. Ам Ј Пхисиол 231: 1178–1184, 1976. дои: 10.1152/ајплегаци. 1976.231.4.1178.

16. Веинер ИД, Верландер ЈВ. Транспортери амонијака и њихова улога у ацидо-базној равнотежи. Пхисиол Рев 97: 465–494, 2017. дои:10.1152/ пхисрев.00011.2016.

17. Ковесди ЦП, Андерсон ЈЕ, Калантар-Задех К. Повезаност нивоа бикарбоната у серуму са морталитетом код пацијената са ЦКД не-зависним од дијализе. Непхрол Диал Трансплант 24: 1232–1237, 2009. дои: 10.1093/ндт/гфн633.

18. Наванеетхан СД, Сцхолд ЈД, Арригаин С, Јолли СЕ, Вехбе Е, Раина Р, Симон ЈФ, Сринивас ТР, Јаин А, Сцхреибер МЈ Јр, Налли ЈВ Јр. Серум бикарбонат и морталитет у стадијуму 3 и стадијуму 4 хроничне болести бубрега . Цлин Ј Ам Соц Непхрол 6: 2395–2402, 2011.

19. Рапхаел КЛ, Мурпхи РА, Схлипак МГ, Саттерфиелд С, Хустон ХК, Себастиан А, Селлмеиер ДЕ, Пател КВ, Невман АБ, Сарнак МЈ, Ик ЈХ, Фриед ЛФ; Здравствена АБЦ студија. Концентрација бикарбоната, ацидобазни статус и морталитет у студији здравља, старења и састава тела. Цлин Ј Ам Соц Непхрол 11: 308–316, 2016.

20. Харрис АН, Лее ХВ, Осис Г, Фанг Л, Вебстер КЛ, Верландер ЈВ, Веинер ИД. Разлике у бубрежном метаболизму амонијака у мушким и женским бубрезима. Ам Ј Пхисиол Ренал Пхисиол 315: Ф211–Ф222, 2018. дои:10.1152/ајпренал.00084.2018.