Абстрацт
Позадина АКИ је уобичајена последица инфекције САРС-ЦоВ-2 и доприноси озбиљности и смртности од ЦОВИД-а-19. Овде смо тестирали хипотезу дапромене бубрегаизазван АКИ повезаним са ЦОВИД-19 може се открити у ћелијама прикупљеним из урина. Методе Извршили смо једноћелијско секвенцирање РНК (сцРНАсек) на ћелијама добијеним из урина осам хоспитализованих пацијената са ЦОВИД-19 са (н55) или без АКИ (н53), као и четири пацијента са не-ЦОВИД-19 АКИ (н54) за процену разлика у ћелијском саставу и експресији гена током АКИ. Резултати Анализа 30.076 ћелија открила је разноврстан низ типова ћелија, од којих је већина билабубрега, уротелне и имуне ћелије. Анализа путања тубуларних ћелија пацијената са АКИ показала је обогаћивање транскрипата повезаних са путевима повезаним са оштећењем у поређењу са онима без АКИ. Експресија АЦЕ2 и ТМПРСС2 била је највећа у уротелним ћелијама међу опорављеним типовима ћелија. Посебно, код једног пацијента смо открили САРС-ЦоВ-2 вирусну РНК у уротелним ћелијама. Ове исте ћелије су обогаћене за транскрипте повезане са антивирусним и антиинфламаторним путевима. Закључци Успешно смо спровели сцРНАсек на седименту мокраће од хоспитализованих пацијената са ЦОВИД-19 да бисмо неинвазивно проучавали ћелијске промене повезане са АКИ и успоставили скуп података који укључује и повређене и неповређене ћелије бубрега. Поред тога, пружамо прелиминарне доказе о директној инфекцији ћелија мокраћне бешике САРС-ЦоВ-2. Уринарни седимент садржи обиље информација и користан је извор за проучавање патофизиологије и ћелијских промена које се јављају уболести бубрега.
ОРГАНСКА ЗДРАВЉА ХРАНА ЗА ЗДРАВЉЕ БУБРЕГА
Увод
Тешки акутни респираторни синдром инфекција коронавирусом 2 (САРС-ЦоВ-2) изазива патологију у више система, укључујући бубреге, а АКИ је повезан са значајним морбидитетом и морталитетом код болести корона вируса 2019 (ЦОВИД-19) (1 –5). Више студија је показало високу стопу АКИ међу хоспитализованим пацијентима са ЦОВИД-19 (6), при чему су неке пријавиле и до 50% инфицираних особа које су развиле АКИ (7–9). Примарни САРС-ЦоВ-2 рецептор АЦЕ2 се експримује на епителним ћелијама у целом уринарном систему, укључујући ћелије проксималних тубула и уротелних ћелија (10–13), иако је нејасно да ли је АКИ код пацијената са ЦОВИД-19 је последица директне вирусне инфекције проксималних тубула или је резултат системског одговора на САРС-ЦоВ-2 (14–22). Слично томе, нејасно је да ли САРС-ЦоВ-2 може изазвати вирусни циститис путем директне инфекције уротелних ћелија, иако је ова могућност предложена (23–26). Упркос високој преваленцији АКИ-ја повезаног са ЦОВИД-19, основне ћелијске промене које се дешавају у окружењу АКИ остају слабо схваћене.
АКИ повезан са ЦОВИД-19 остао је у великој мери недовољно проучаван јер приступ ткиву бубрега захтева биопсију или постморталну анализу (27). Недавне студије су откриле разноврстан низ ћелија бубрега, бешике и имуног система у урину (28–30). Стога, урин може понудити драгоцен увид у неинвазивну студију промена бубрега током АКИ-ја повезане са ЦОВИД-19. Овде смо извршили једноћелијско секвенцирање РНК (РНА-Сек) да бисмо окарактерисали ћелијску разноликост у урину хоспитализованих пацијената са ЦОВИД-19 са и без АКИ. Тестирали смо хипотезу да се промене бубрега у АКИ повезане са ЦОВИД-19 могу открити у ћелијама прикупљеним из урина. Такође смо прикупили узорке од пацијената без ЦОВИД-19 и са АКИ (не-ЦОВИД-19 АКИ). Пронашли смо неколико популација инфламаторних имуних ћелија и различито активираних путева у АКИ повезаном са ЦОВИД-19, као и прелиминарне доказеза директну инфекцију уротелних ћелија САРС-ЦоВ-2.
Материјали и методе
Учесници и варијабле Одрасли старији од 18 година и старији су прегледани током пријема или трансфера на Универзитет Алабама у болници у Бирмингему (УАБ) између марта и маја 2021. Случајеви АКИ су идентификовани коришћењемБолести бубрегаПобољшање дефиниције глобалних исхода као пораст серумског креатинина (сЦр) .0,3 мг/дл у року од 48 сати или 0,1,53 почетне вредности креатинина. Контроле без промене у креатинину су одабране на основу подударања узраста и пола где је то могуће и обрађене са сваким одговарајућим АКИ узорком. Основни сЦр је одређен коришћењем најновије вредности сЦр 7–365 дана пре хоспитализације. Додатни клинички подаци у вези са демографијом, медицинском историјом, клиничким карактеристикама и лабораторијским вредностима извучени су из карата пацијената преко тима УАБ Центра за клиничке и транслационе науке и2б2. Укључено је осам хоспитализованих пацијената са ЦОВИД-19, пет са АКИ и три без АКИ. Ову студију и колекцију узорака одобрио је УАБ институционални одбор за преглед. Тим за консултације УАБ за акутну нефрологију је такође прикупио узорке пацијената са не-ЦОВИД-19 АКИ (н54) како би упоредио ћелијске промене са АКИ повезаним са ЦОВИД-19. Они су прикупљени према другом протоколу институционалног одбора за преглед који омогућава прикупљање узорака остатка урина и стога је анониман.
Сакупљање и обрада узорака
Сви кораци су изведени на леду. Урин је сакупљен или као испражњени узорак или из уринарног катетера. Узорци су одмах пребачени у лабораторију нивоа биолошке безбедности 21 на обраду. Узорци урина су пребачени у 50-мл конусну епрувету и центрифугирани на 10003 г током 10 минута на 4 Ц. Ћелијске пелете су испране ледено хладним ПБС, филтриране кроз филтер од 40- мм и поново центрифугиране. Живе ћелије су пречишћене коришћењем МАЦС комплета за уклањање остатака (Милтении Биотец), а затим ЕасиСеп Аннекин В комплета за уклањање мртвих ћелија (СтемЦелл). Укратко, ћелије су ресуспендоване у ледено хладном ПБС-у и помешане са раствором за уклањање остатака. Хладни ПБС је прекривен смешом и центрифугиран на 3003 г током 10 минута на 4 Ц. Горње две фазе су аспириране, а затим су преостале ћелије испране са ПБС. Ћелије су ресуспендоване и помешане са коктелом за уклањање мртвих ћелија, коктелом за селекцију биотина, а затим РапидСпхерес пре одвајања у ЕасиСеп магнету. Ћелије су испране и ресуспендоване у 52 мл ПБС (без калцијума или магнезијума) 10,04% БСА (Фисхер Сциентифиц) за обраду сцРНАсек-а
сцРНАсек
Пречишћене ћелије су пребачене у УАБ проточну цитометрију и једноћелијско језгро и одмах обрађене коришћењем комплета за секвенцирање једноћелијске РНК Цхромиум 39 (103Геномика) према произвођачу'с упутства.Суспензија ћелија је избројана, комбинована са 103 Мешавина реагенса хрома и стављена у микрофлуидицједноћелијски уређај за партиционисање у коме се лизују и реверстранскрипција се одвија у микрокапљицама. Добијена цДНКвас амплифиед ПЦР и накнадно обрађен да би се добио
библиотеке секвенцирања са бар кодом. Секвенцирање упарених крајева је спроведено на платформи за секвенцирање Иллумина НоваСек6000 или НектСек500 (Иллумина). Читања су обрађенакористећи 103 Геномицс Целл Рангер једноћелијски софтверВерзија пакета 6.0 на УАБ Цхеаха Хигх-ПерформанцеРачунарски кластер. БЦЛфидатотеке су конвертоване у ФАСТКфилес користећи брзу функцију ЦеллРангер. ЦеллРангерфаст је коришћен за поравнање ФАСТК-афилес на прилагођени геномкоји се састоји од хуманог генома хг38 (ГРЦх38.п13) са
геном САРС-ЦоВ-2 (НЦ_045512.2) уметнут као егзон (31). За анализу су креиране табела гена, табела бар кодова и матрице транскрипционе експресијеназначено у наставку.
Анализе података
Анализе су спроведене коришћењем пакета креираних за окружење Р статистичке анализе (верзија 4.06). Подаци су првенствено анализирани у верзији Сеурат 3.2.3 (32,33) и њенојповезане зависности. Подаци од сваког пацијентасу увезени помоћу Реад103 функција, а затим структурпретворен у Сеурат објекат помоћу ЦреатеСеуратОбјецт. Законтрола квалитета, ћелије са јединственим карактеристикама броје преко 2500или испод 200 и ћелије са митохондријалним пропорцијама од.15% је билофилтеред оут. Подаци су нормализовани коришћењем ЛогаНормализујте и скалирајте да бисте се припремили за линеарне димензијесмањење. Обележени су објекти појединачних пацијенатаса јединственим групним идентитетомфикатјона, а затим спојени у аједан објекат користећи Сеурат функцију спајања. Патиент Самплесови су интегрисани са функцијом РунХармони користећипакет Хармони Р (34). Анализа главних компонентиизвршено је, а затим су ћелије груписане на основудиференцијална експресија гена како је одређена СеуратомФункција ФиндАллМаркерс постављена на резолуцију од један. Дименсионална редукција је извршена коришћењем униформног колектораапроксимација и пројекција. Типови ћелија су били идентичнифиедупоређивањем различито изражених преписа засваки кластер са познатим транскриптима повезаним са специфиc типови ћелија (29,35,36). За покретање је коришћен пакет Есцапе РАнализа обогаћивања скупа гена (ГСЕА) (37). ВебГесталтРје коришћен за анализу генске онтологије да би се идентификовали путевикористећи Биолошки процес и Кјото енциклопедијуБаза података о генима и геномима (38).
