Старење коже је сложен биолошки феномен због физиолошког смањења

Контактирајтеoscar.xiao@wecistanche.comза више информација

Апстрактан:Циљ овог истраживања био је да се испита инхибиторни ефекат воћних екстраката из Васхингтониа филифера на ензиме повезане са старењем коже. Екстракти пулпе нису испољили значајну инхибицију ензима, док екстракти семена из В.филифера показују анти-еластазно, анти-колагеназно и анти-тирозиназно деловање. Тирозиназа је била благо инхибирана, док је јачи ефекат примећен у односу на инхибицију еластазе и колагеназе. Алкохолни екстракти су дали боље резултате од водених екстраката. Међу њима, метанолни екстракти су показали истакнуту инхибицијску активност ензима јер је ИЦ5о вредност за еластазу и колагеназу упоредива и чак боља од референтног једињења. Начин инхибиције најактивнијих екстраката је испитан анализом Линевеавер-Бурк плот. Екстракти семена из В.филифера су такође испитани на њихов фото-протективни ефекат помоћу Мансурове једначине, а антиоксидативна активност екстракта В.филифера је процењена у ћелијама под оксидативним стресом. Да би се проценила безбедност екстракта, анализиран је ефекат на виталност ћелија људских кератиноцита.изгубљено царство цистанцхеЕкстракт метанола је показао најбољи фотопротективни ефекат и показао антиоксидативну активност у ћелијском систему без цитотоксичног дејства. Укупни резултати показују да су екстракти В.филифере обећавајући извори биоактивних једињења која се могу користити у козметичким и фармацеутским препаратима.

Кључне речи:инхибиција ензима; колагеназа; еластаза; тирозиназа; биљни екстракти; семена; старење коже; Васхингтониа филифера

Кликните овде да бисте сазнали више

1. Представљање

Старење коже је сложен биолошки феномен због физиолошког смањења функција коже и неколико спољашњих фактора животне средине, као што су УВ зрачење, хемикалије и реактивне врсте кисеоника (РОС). Кожа је највећи и најизложенији део тела и изложеност сунчевом УВ зрачењу представља један од најзначајнијих спољних фактора који изазивају стрес: фото-индуковано старење коже повезано са оксидативним стресом. РОС индукована УВ зрачењем може да покрене сложене молекуларне путеве, укључујући активацију ензима који разграђују протеине екстрацелуларног матрикса (ЕЦМ) у дермису, мењајући интегритет коже [1]. Једна од главних карактеристика старења коже је заиста губитак структуре ЕЦМ, који се састоји од бројних протеина, укључујући колаген и еластин, који сви играју главну улогу у одржавању еластичности коже [2]. Деградација ЕЦМ је углавном због појачане активности протеолитичких ензима, као што су колагеназа и еластаза. Инхибиција ових ензимских активности природним биљним једињењима може бити обећавајући приступ превенцији старења коже [3]. Колагеназа (ЕЦ 3.4.24.3) припада породици матриксних металопротеиназа и може да разгради троструки спирални регион колагена у физиолошким условима.микронизована пречишћена фракција флавоноида 1000 мг користиКолаген је влакнаста компонента ЕЦМ-а и главни структурни протеин у људској кожи, пружајући структурну подршку за кости, тетиве, лигаменте и крвне судове. Еластаза (ЕЦ3.4.21.36) је протеолитички ензим укључен у физиолошку деградацију еластина, ЕЦМ протеина одговорног за еластичност коже. Утврђено је повећање активности еластазе код неколико болести, на пример, псоријазе, дерматитиса, упалних процеса и превременог старења коже, који су уско повезани са стварањем бора[4].

Цистанцхе може против старења

Штавише, једна од главних промена повезаних са борама код старијих особа је појава хиперпигментираних мрља, такође познатих као сенилни лентиго или старачке пеге. Они су директно повезани са неуједначеном пигментацијом због активности другог ензима повезаног са старењем по имену тирозиназа. Тирозиназа (ЕЦ 1.14.18.1) је ензим који ограничава брзину у метаболизму меланина. Он катализује хидроксилацију Л-тирозина у 3,4-дихидроксифенилаланин (Л-ДОПА), након чега следи оксидација Л-ДОПА у допахинон. Оксидативна полимеризација деривата допахинона доводи до стварања меланина [5]. Синтеза пигмената меланина је физиолошки процес који игра кључну улогу у спречавању оштећења коже изазваног УВ зрачењем апсорбујући УВ сунчеву светлост. Упркос својим предностима, вишак производње или абнормална акумулација меланина узрокује проблеме са кожом као што су типичне старачке пеге. Пошто је кожа највидљивији орган тела, прерано појављивање бора и хиперпигментација такође може изазвати емоционални стрес код неких људи.

Дакле, инхибитори свих горе описаних ензима могу представљати све важније састојке у козметици и лековима за спречавање старења коже [6]. Природни биљни производи могу бити обећавајући извор биоактивних једињења. Од посебног интереса за примену против старења, екстракти поседују вишеструке корисне функције, као што су инхибиција ензима повезаних са старењем и способност уклањања слободних радикала.

У нашем претходном раду описали смо антиоксидативни капацитет и неколико биолошких активности екстраката семена В.филифера [7]. Васхингтон филифера (Линдл.) Х. Вендл., опште позната као калифорнијска лепезаста палма или пустињска лепезаста палма, је зимзелена палма пореклом из јужне Калифорније, Аризоне, Мексика и пустињских зона.отефлавоноидОва палма, висине 15-20 м, не даје урме, али поседује слатке и укусне јестиве плодове. Ове бобице имају веома велико, смеђе семе окружено танком пулпом (слика 1). В.филифера је проучавана у погледу, на пример, њене употребе као потенцијалног извора нових целулозних влакана [8] и нутритивне вредности њених плодова [9]; фенолни састав и антиоксидативна активност надземних делова такође су пријављени [10]. У нашој претходној студији, пријавили смо добру антиоксидативну активност В.пуритански витамин цекстракти семена филифере, за које се чинило да су извор фенолних и флавоноидних молекула[7]. Исти екстракти су деловали инхибиторно на ензиме ксантин оксидазе и холинестеразе, који представљају кључне ензиме у лечењу гихта и Алцхајмерове болести.

Циљ овог рада био је да се прошири карактеризација ове биљке и процени потенцијална употреба њених екстраката као средства против старења. Екстракти пулпе и семена су, стога, испитивани на њихову инхибиторну активност према активности еластазе, колагеназе и тирозиназе, будући да представљају кључне циљне ензиме за превенцију и лечење фотостарења коже; Штавише, екстракти В.филифера који показују најбоље обећавајуће активности анализирани су на њихову ин витро цитотоксичност, ћелијску антиоксидативну активност и фото-заштитне ефекте.

2.Резултати и дискусија

2.1. Инхибиција ензима

Екстракти пулпе и семена В. филифера су прво тестирани у концентрацији од 50 уг/мЛ.систанцхеСви екстракти пулпе нису испољили значајну инхибицију ензима (подаци нису приказани). Ензимске инхибиторне активности екстраката семена су израчунате и изражене као полумаксимална инхибиторна концентрација (такође). Табела 1 приказује вредности ИЦсо добијене из екстраката семена у поређењу са онима стандардних инхибитора, да би се проценила инхибиторна снага узорака. Као што се могло приметити, сви екстракти слабо инхибирају активност тирозиназе, при чему су вредности ИЦсо веће од вредности стандардне којичне киселине. Уочена је боља инхибиција против активности еластазе и колагеназе, а најбољи ефекти су показали етанолни (ЕЕГ и ЕЕС) и метанолни (МЕГ и МЕС) екстракти. Инхибицијска активност ових узорака против еластазе била је слична; вредности ИЦсо су се кретале од 10,75 до 19,75 уг/мЛ и биле су упоредиве са онима позитивне контроле (олеанолна киселина;ИЦсо=11.75 уг/мЛ).

Уместо тога, екстракти су снажно инхибирали активност колагеназе, који су показали већу потентност од стандардног епигалокатехин галата, при чему је ИЦсо био до три пута нижи од позитивне контроле. С обзиром да су екстракти били мешавина више једињења, концентрација појединачних активних молекула била је чак нижа од вредности ИЦ50, што је чинило екстракте још перспективнијим изворима инхибиторних једињења.

2.2. Кинетичка анализа помоћу Линевеавер-Бурк дијаграма

Пажњу смо усмерили на етанол и метанолне екстракте како бисмо истражили начин инхибиције ових ензима јер су имали бољи ефекат на активности еластазе и колагеназе. Кинетика инхибиције одређена је двоструким реципрочним дијаграмом Линевеавер-Бурк. Тестови су изведени повећањем концентрације одговарајућег супстрата у одсуству и присуству екстраката у различитим концентрацијама.

Табела 2 показује да су ЕЕГ и ЕЕС деловали као неконкурентни инхибитори против еластазе. У ствари, кинетичка анализа ових екстраката произвела је фамилију паралелних линија за повећање концентрације екстракта (Слика 2А,Б). Ова киретичка анализа показује да се ови екстракти могу везати за комплекс ензим-супстрат. Константа равнотеже (Крс) је израчуната из поновног приказивања пресека (1/Вмак) у односу на концентрацију инхибитора, што је резултирало вредношћу од 3,91 и 8,89 уг/мЛ за ЕЕГ и ЕЕС, респективно. Начин инхибиције метанолних екстраката је заиста открио да ови екстракти делују као некомпетитивни инхибитор. У ствари, повећањем концентрације екстраката, пронађена је породица правих линија са различитим нагибима, које се секу на апсциси (слика 2Ц,Д). Ова анализа указује да се екстракти могу везати не само за комплекс ензим-супстрат већ и за слободни ензим. Константе равнотеже за везивање са слободним ензимом (Кј) и са комплексом ензим-супстрат (Кис) су добијене или из нагиба (Км/Вмак) или вредности 1/Вмак (и-пресецања) у зависности од концентрације инхибитора, редом.Коначно, кинетичко понашање колагеназе при различитим концентрацијама екстраката приказано је на слици 3А-Д. Сви екстракти су деловали као неконкурентни инхибитори са вредностима Крс у опсегу од 7.58-13.04 уг/мЛ (табела 2).

У нашем претходном раду анализирали смо алкохолне екстракте семена В. филифера, користећи ХПЛЦ-ДАД-ЕСИ/МС. Истакли смо да се главна фенолна једињења ових екстраката састоје од флаван-3-ола [7]. Међу њима, процијанидини Б типа били су главна једињења у екстрактима семена В.филифера. Позитивна веза између степена полимеризације процијанидина и капацитета процијанидина да инхибирају еластазу уочена је у претходном раду [11,12]. Штавише, пријављена је инхибиторна активност неких једињења процијанидина против еластазе и колагеназе [13,14]. Синергијско дејство ових једињења могло би да допринесе објашњавању значајне инхибиције метанолног екстракта В.филифера против оба ензима.

2.3. Фактор заштите од сунца

Фотопротектантна активност је веома важна за једињења са могућом применом на кожу, па смо одредили фактор заштите од сунца (СП) наших екстраката. СПФ указује на способност супстанце да апсорбује УВ зраке, штитећи кожу од токсичних ефеката изазваних таквим зрачењем. Козметика на биљној бази има велики потенцијал у апсорбовању УВ зрачења јер биљни екстракти садрже полифеноле, као што су флавоноиди или каротеноиди. Ова једињења, која имају ароматичне прстенове, могу да апсорбују УВ зраке и стога могу деловати као филтер за сунце. С обзиром да алкохолни екстракти семена В.филифера садрже фенолна и флавоноидна једињења [7], процењени су фотопротективни ефекти ових екстраката. Као што је приказано у табели 3, сви анализирани екстракти, у концентрацији од 100 уг/мЛ, показали су СПФ вредности у распону од 1,52 до 3,35. Откривено је да метанолни екстракти имају најбоље фото-заштитне ефекте. УВ зраци су одговорни за кожне болести и покрећу процесе који резултирају старењем коже, оксидативним стресом и стварањем бора. Дакле, смањење апсорпције овог зрачења појачава, на индиректан начин, антиоксидативне активности и инхибицију ензима повезаних са старењем.

2.4. Виабилност ћелије и ниво интрацелуларног РОС-а

Пошто је оксидативни стрес кључни фактор у изазивању старења и оштећења везаних за старење, такође смо испитали да ли екстракти В. филифера инхибирају ХО2-индуковано стварање РОС у ћелијском систему. У претходном раду смо описали антиоксидативну активност екстраката семена помоћу спектрофотометријске методе (АБТС тест)[7]. Откривено је да су узорци добар извор фенолних једињења са антиоксидативним својствима, при чему је МЕГ показао најбољу активност. Пошто је овај екстракт имао најбољу антиоксидативну активност, а такође и велики потенцијал, с обзиром на инхибиторне активности против тестираног ензима (холинестераза, ксантин оксидаза и ензими старења који су овде представљени), одлучили смо да потврдимо антиоксидативни капацитет МЕГ-а у ћелијском моделу.

Прво, у ХаЦаТ ћелијама су испитани ефекти екстракта В.филифера на виталност ћелија. Бесмртна ћелијска линија ХаЦаТ хуманих кератиноцита је у великој мери коришћена као модел за проучавање епидермалне хомеостазе [15]. Да би се утврдила безбедност овог екстракта, ћелије су третиране различитим концентрацијама узорка током 24 х и испитане МТТ тестом. Резултати показују да екстракт није био цитотоксичан у ХаЦаТ ћелијама и да је примећено само мало смањење (вијабилност од 80 процената) при 100 уг/мЛ (Слика 4). Пошто на одрживост није утицала до 50 уг/мЛ (виабилност од 96 процената), одлучили смо да извршимо даље ћелијске експерименте користећи до ове концентрације екстракта. Процењивали смо нивое РОС у ћелијама пре и после оксидативног стреса и после третмана са МЕГ. Студија је спроведена коришћењем 21,7'-дихлорофлуоресцеин диацетата (ДЦФХ-ДА), који лако дифундује кроз ћелијску мембрану и хидролизује се ендогеним естеразама до ДЦФХ. Брзо повећање ДЦФ указује на оксидацију ДЦФХ интрацелуларним РОС, као нпр. Х2О2. Као што је приказано на слици 5, инкубација Х2О2 значајно је повећала формирање РОС у ХаЦаТ ћелијама, али третман са екстрактом је био у стању да инхибира Х2О2-индуковану производњу РОС на начин доза-одговор. Дакле, ови резултати потврђују антиоксидативне тестове и сугеришу да МЕГ такође може да смањи формирање РОС у ћелијама.

Метанолни екстракт анализиран у овом раду показао је висока антиоксидативна својства. Фенолни састав овог екстракта се састојао од флаван-3-ола, а процијанидини Б типа били су главна фенолна једињења [7]. Пријављено је да процијанидини, група полифенолних биофлавоноида, показују широк спектар биолошких, фармаколошких и хемопротективних својстава против слободних радикала кисеоника[16,17]. Претходна студија је показала да је анти-радикална активност процијанидина јака при високим концентрацијама[18]. Штавише, екстракти проантоцијанидина су ефикаснији хватачи супероксидних радикала од антиоксидантног витамина Ц и тролокса [19].

3. Материјали и методе

3.1.Хемикалије

Сви хемијски реагенси су добијени као чисти комерцијални производи од Сигма Цхемицал Цо. (Ст. Лоуис, МО, САД), осим ако није другачије назначено, и коришћени су без даљег пречишћавања.

3.2. Припрема узорака биљака

Плодови В.филифере су сакупљени у Тунису у областима Габес (Г) и Соуссе (С), а биљни материјал је припремљен према претходно описаном поступку [7]. Пулпа и семенке су одвојено лиофилизовани, а затим су биљни материјали (25 г) екстраховани у 100 мЛ воде (АЕ, водени екстракт), етанола (Е, етанолни екстракт) или метанола (МЕ, метанолни екстракт) током 72 х, на собној температури. температуре, уз непрекидно мешање. Након филтрације и центрифугирања на 10,000 о/мин, водени екстракти су затим лиофилизовани, док су добијени етанол и метанолни екстракти концентровани под вакуумом, користећи ротациони испаривач за даљу анализу. Осушене снаге (1 мг/мЛ) су растворене у ДМСО пре употребе.

3.3. Ензимска инхибиција

Резултати свих доле описаних тестова изражени су као проценат слепе контроле. Концентрације екстраката које резултирају 50-постотном инхибицијом ензимске активности (ИЦсо) одређене су интерполацијом криве доза-одговор. Модел инхибиције је одређен извођењем тестова на различитим концентрацијама супстрата и одсуству и присуству екстраката у различитим концентрацијама. Кинетички подаци су анализирани коришћењем Линевеавер-Бурк дијаграма. Подаци из тестова активности су забележени спектрофотометром Ултроспец 2100 (Биоцхром Лтд., Цамбридге, УК).

3.3.1. Тест инхибиције тирозиназе

Инхибиција активности тирозиназе екстрактима В.филифера одређена је коришћењем 3,4-дихидроксифенилаланина (Л-ДОПА) као супстрата [20]. Реакциона смеша је садржала 25 мМ фосфатног пуфера (пХ 6,8), тирозиназу печурака (100 У/мЛ, коначна концентрација), са или без раствора биљног екстракта. Затим је у смешу додат Л-ДОПА (0,5 мМ) и активност је одређена праћењем повећања апсорбанције на 492 нм, што је резултат формирања допахром производа. Опсег концентрација екстракта коришћеног за тест инхибиције тирозиназе печурака био је 0-0.3 мг/мЛ. У тестовима који су изведени без биљних екстраката, ДМСО је додат у реакциону смешу као слепа контрола. Којић киселина је коришћена као позитивна контрола.

3.3.2. Тест инхибиције еластазе

Инхибиција еластазе је испитивана праћењем ослобађања п-нитроанилина током цепања супстрата Н-суцц-(Ала)3-нитроанилида (САНА) деловањем ензима описаном методом [21], са мале модификације. Тест је изведен у 0.1 М Трис-ХЦл пуферу (пХ8.0). Свињска панкреасна еластаза (3,3 уг/мЛ) је инкубирана са или без екстракта 20 минута и, након инкулације, додат је супстрат (1,6 мМ), а активност ензима је праћена на 410 нм. Контрола је изведена са ДМСО, док је као позитивна контрола коришћена олеанолна киселина.

3.3.3. Тест инхибиције колагеназе

Колагеназа из Цлостридиум хистолитицум је припремљена у Трицине пуферу {{0}}.05 М, пХ 7,5, који садржи 0,4 М НаЦл и 0,01 М ЦаЦлз, и инкубирана (1 У /мЛ) са испитиваним узорцима у различитим концентрацијама током 15 мин. Затим је додат синтетички супстрат Н-(3-[2-Фури]]-акрилоил)-Леу-Гли-Про-Ала (ФАЛГПА), припремљен у истом пуферском раствору, да би се започела реакција ( са коначном концентрацијом од 0.8 мМ).Апсорбанца је праћена на 340 нм [21]. Контрола је изведена са ДМСО, док је као позитивна контрола коришћен епигалокатехин галат.

3.4. Одређивање ин витро фактора заштите од сунца

Фактор заштите од сунца екстраката В. филифера одређен је методом УВ апсорпције, према методологији коју су описали Мансур и сар. (1986) [22]. Апсорбанције екстраката (0.1 мг/мЛ) мерене су у опсегу од 290-320 нм, са корацима од 5 нм, и извршена су три одређивања у свакој тачки. СПФ је израчунат применом Мансурове једначине: где је ЦФ=корекциони фактор (10); ЕЕ(А)= еритемогени ефекат зрачења са таласном дужином λ;И（）= спектром сунчевог интензитета; Абс（λ= вредности спектрофотометријске апсорпције на таласној дужини λ. Вредности ЕЕ（А） × И（А） су константне. Одредили су их Саире ет ал. (1979)[23] и приказани су у табели 4.

3.5. Ћелијска култура и интрацелуларни нивои РОС

Ћелијска линија кератиноцита људске коже ХаЦаТ узгајана је у Дулбеццо-овом модификованом орловом медијуму (ДМЕМ) који садржи 10 процената феталног говеђег серума (ФБС, Гибцо, НИ, САД) и 1 проценат пени-цилина/стрептомицина на 37 степени, у влажној атмосфери, са 5 проценат ЦО2. Вијабилност ћелија је откривена колориметријским 3-(4)5-диметилтиазол-2-ил)-2.5-дифенилтетразолијум бромидом (МТТ) тестом, као претходно описано, уз мање модификације [24]. После 24-часовне инкубације са МЕГ у различитим концентрацијама (0-100 уг/мЛ), ћелије су обележене МТТ раствором 3 х на 37 степени. Добијени преципитати љубичастог формазана су растворени у ДМСО и апсорбанција сваког бунарчића је одређена на 560 нм коришћењем читача микроплоче са референтном дужином од 630 нм.

Нивои ћелијских РОС су одређивани методом ДЦФХ-ДА [25]. ХаЦаТ ћелије су третиране различитим концентрацијама МЕГ (0-50 уг/мЛ) током 24 сата. Затим су ћелије инкубиране са ДЦФХ-ДА (10 уМ) на 37 степени током 30 минута. Након инкубације, 1 мМ ХзО2 је додат у бунарчиће, а интензитет флуоресценције ДЦФ-а је одмах мерен коришћењем читача флуоресцентних плоча на таласној дужини ексцитације од 485 нм и таласној дужини емисије од 530 нм, узимајући очитавања у интервалима од 5 мин током 50 мин.

3.6. Анализа података

Сви експерименти су изведени у три примерка и подаци су изражени као средња 士 стандардна девијација (СД). Статистичке разлике су процењене коришћењем софтвера ГрапхПад Присм верзије 8 (Сан Дијего, Калифорнија, САД). Поређење између група је спроведено једносмерном анализом варијансе (АНОВА) праћено Тукеијевим тестом вишеструких поређења. Ап-вредност мања од 0.05 сматрана је статистички значајном.

4. Закључци

У закључку, по први пут извештавамо да су екстракти семена из В.филифере ефикасни у инхибицији кључних ензима који су укључени у старење коже. Природно или „интринзично“ старење је физиолошки феномен који се јавља у свим људским ткивима као последица протока времена. Међутим, кожа је такође изложена спољним факторима који изазивају стрес који представљају главни узрок превременог старења коже. „Спољно” старење се углавном односи на оштећење везивног ткива коже изазвано УВ зрачењем. УВ зраци изазивају оксидативни стрес, који је одговоран за активацију ензима који разграђују ЕЦМ и појаву бора и старачких пега. Овај рукопис извештава о значају који би семе В.филифере могло да има у овом контексту. Као што је приказано на слици 6, екстракти могу деловати у превенцији прераног старења, делујући истовремено на неколико фронтова.

Прво, екстракти могу деловати на почетку процеса својим фотопротективним ефектима и самим тим смањити апсорпцију УВ зрака. Затим су показали добар антиоксидативни ефекат са метанолним екстрактом, спречавајући формирање РОС у ћелијском систему, без ћелијске токсичности. Коначно, сви екстракти, посебно метанолни узорци, могу инхибирати колагеназу, еластазу и тирозиназу (последњу у мањој мери). Све у свему, добијени резултати показују да В.филифера може бити извор биоактивних молекула и подстаћи даље експерименте у циљу изоловања појединачних активних компоненти одговорних за посматране активности.

Овај чланак је преузет из Плантс 2021, 10, 151. хттпс://дои.орг/10.3390/плантс10010151 хттпс://ввв.мдпи.цом/јоурнал/плантс