Структурна карактеризација Цистанце Десертицола полисахарида и његов заштитни ефекат на високим ХК-ом изазваним глукозом -2 ћелијом

1.2.5.8 Откривање митохондријске мембране

ХК -2 Ћелије су инокулиране у таблице 6- и узгајају. Након одговарајуће стимулације, медијум за културу у тањири 6- је био аспириран и групу под "1.2.5.6" је додата снажна позитивна контролна група (ПОС). Испирите се једном са ПБС-ом, додајте 1 мл медијума ћелијске културе и 1 мл ЈЦ {{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{. Ћелије су два пута испрана са ЈЦ -1 тампон за бојења (1 ×) и слике су сакупљене помоћу флуоресцентне микроскоп.

 

 

 

 

ЦИСТАНЦХЕ ПРЕДНОСТИ

 

1.2.5.9 Метода хоецхст33258 за откривање ћелије апоптозе

Целијски клизачи су смештени у тањире 6- и ХК -2 ћелије у фази раста логаритамика су сејали у таблици 6- у густини ћелије од 1 × 105 ћелија / бунар. Након одговарајуће интервенције на лековима, за бојење је коришћен хранитељ ХОЕЦХСТ33258. Откривена је ћелијска апоптоза и слике су сакупљене помоћу флуоресцентне микроскоп.

 

1.2.5.10 Западни блоттинг за откривање

Изузетак протеина који се односе на сигналну стазу ТЛР4 / НФ-κБ анализиран је групирањем и третирањем ћелија у складу са методом под "1.2.5.6". Након тога, укупни протеин у ћелијама је екстрахован у складу са упутствима комплета за вађење протеина. Квантификација протеина изведена је коришћењем методе протеине протеине бицинхонинске киселине (БЦА), а протеин је деманиран и чуван у фрижидеру -20.
10% натријум додецил сулфата полиакриламидни гел електрофореза (СДС-ПАГЕ), поливинилиденски флуорид (ПВДФ) Мембрански пренос мембране, ставите мембрану у Трис-који садржи Твеен -20 међуспремник
Ћелије су се инкубирале у расили са Трис пуферираном са Твеен -20 (ТБСТ) комором и блокиране на собној температури. Примарна антитела на ТЛР4, НФ-ΚБ П65, П-НФ-ΚБ П65 и -актин су навиклиОткријте бубрежно ткиво(Антитела је разблажена у ТБСТ раствор у односу на количину од 1: 2000) на 4 степени преко ноћи. Тбст
Мембрана је разблажена средњим антителом (антитело и ТБСТ раствор разблажени су на омјеру запремине од 1: 2000) и инкубирати на собној температури током 1 х. Након прања мембране 3 пута са ТБСТ-ом, ЕЦЛ луминесцентни реагенс је додат за откривање и експресија протеина откривена је гелским сликањем. Имаге Ј Софтвер је коришћен за анализу вредности протеинских сива, са -актин као интерна референца.

1.3 Обрада података

СПСС 23. 0 и ГрапхПад Прим 6.01 софтвер је коришћен за анализу података. Схапиро-Вилк тест коришћен је за тестирање нормалности података о узорку и Бровн-Форситхе или Бартлеттов тест коришћен је за тестирање хомогености варијансе података о узорку података. Подаци мерења са нормалном дистрибуцијом и хомогеношћу варијанције изражени су као средња вредност стандардне одступања. (Кс ± с) Означава опис, једносмјерни АНОВА је коришћен за тестирање, а Дуннеттов метод је коришћен за парнерино поређење ако је статистички значајно.
За пост хоц уговорене поређења неједнаких варијација, коришћена је Дуннеттов Т3 метода, са П <0. 0 5 који указује на статистички значајну разлику и п <0,01 указује на значајну разлику између две групе.

2 резултата и анализе

2.1 Одређивање укупног шећера, уроничне киселине и протеина садржаја ЦДПС-а

Линеарна регресијска једначина садржаја полисахарида била је: и=5. 7628к - 0. 0004, р=0. 999. Експеримент је показао да је између 7 и 70 μг / мл, дошло је до доброг линеарног односа између стандардне концентрације глукозе (Кс) и вредности апсорбанције (И). Прорачунат проценат садржаја полисахарида у узорку је: 81,02%.
Линеарна регресија једначина стандардне уронске киселине је: и=1. 1571к + 0. 0015, р {4}}. 9968. Експеримент је показао да је између 20 и 100 μг / мл било добре линеарне односе између стандардне концентрације уроничне киселине (Кс) и вредности апсорбанције (И). Садржај уроничне киселине у узорку је: 4,43%.
Стандардна протеинска линеарна регресија је: и=1. 2671к + 0. 2145, р {4}}. 9969. Експеримент је показао да је између 20 и 1 00 μг / мл, дошло је до доброг линеарног односа између стандардне концентрације протеина (Кс) и вредности апсорбанције (И). Садржај протеина у узорку је: 4,00%.

 

2.2 Молекуларна дистрибуција масе ЦДПС

Молекуларна тежина ЦДП-а одређена је хроматографијом гел хроматографије гела за гел Тандем Детекција колона. С РТ-ом као (Кс) и ЛГМП-ом као (И), једначина ЛГМП-РТ калибрационе кривуље израчуната је као: и=-0. 1951к + 11. 661, р²=0. 9956; РТ је (к), ЛГМВ је (и), колута за калибрацију ЛГМВ-РТ је: и=-0. 1973к + 11. 738, р² ​​= 0. 9956; РТ је (к), ЛГМН је (и), кривуље калибрације ЛГМН-РТ је једначина: и=-0. 1964к + 11. 7, р²=0. 9955; На основу стандардне кривуље, формула израчунавања се добија да израчуна молекуларну тежину сваког узорка. Молекулски спектар узорака је следеће, а резултати израчуна су приказани у Табели 2. Резултати су показали да су ЦДПС имали више врхова за извлачење, а молекулска тежина полисахарида је углавном дистрибуирана између 3 и 8 кДа, која је била хетерополисахарида хетеропорида. Као што је приказано на слици 1.

 

 

2.3 ЦДПС Моносахаридни састав

ЦДПС је анализиран јонском хроматографијом, а хроматограм је приказан на слици 2. Резултати су показали да је у ЦДПС-у је откривено да се резултирају временским временским стандардима од 16 моносахарида. Поређујући спектри са онима од моносахаридних стандарда, ЦДПС је углавном био састављен од глукозе, галактозе, рхамнозе, манозе и сахарозе. , Арабинозе. Моларни омјер је 0. 734 0 5: 0. 0 5381: 0. 0502: 0.0255: 0.0178. Из моларног односа може се видети да се ЦДПС углавном састоји од глукозе, галактозе и рамнозе. Међу њима, глукоз чини 73.405%, Галактосе чини 5,381%, а Рхамносе чини 5,02%.

 

Напомена: ман.манносе, глц н.глуцосамин хидрохлорид, рха.рхамносе, глц-уа.глуцуронична киселина, гал-уа.галацтуронска киселина, гал н.галацтозамин хидрохлорид, глц.глуцосе, гал.галацтосе, кил.килоза, ара. Арабиносе, Фуц.Фуцосе.

2.4 ЦДПС Фоуриер инфрацрвена анализа

Врхунац близу 3246 цм -1 је узрокован вибрацијом ХДоксилне групе, апсорпциони врх у близини 2900 цм -1, и апсорпциони врхунац у 1594 цм {{974 цм {13}}: ово је Врхунац апсорпције може се повезати са вибрацијом деформације ЦХ обвезница, посебно у метил (-ЦХ3) или метилен (-Х {{18}) група полисахарида. Врх у апсорпцији на 1018,38 цм -1 може бити повезан са вибрацијом истезања ЦО веза, која се обично налази у етром обвезницама или естри обвезницама полисахарида. Три слаба апсорпциона врхова у распону 1200-1000 цм {24}} указују на присуство пиранозе у ЦДП-у. У апсорпционим врховима у 870 и 930 цм -1 означавају да у ЦДП-овима могу постојати и-тип гликозидних обвезница. Погледајте слику 3.

 

2.5 Токсични ефекти ЦДП-а на нормалном ХК -2 ћелијама

У поређењу са ЦО, у 24 х након примене, одрживост ћелије почела се значајно смањити након концентрације ЦДП-а достигла 1000 уг / мл (стр<0.05); at 48 h after administration, the cell viability decreased when the CDPs concentration reached 800 μg/mL and did not exceed 80 %; after 1000 µg/mL, the cell viability began to decline significantly (P<0.05); this may be related to the imbalance of cell osmotic pressure and cell membrane damage caused by the high concentration of polysaccharides. There was no significant difference in cell viability when compared with the concentrations of 25, 50, 100, 200, and 400 µg/mL, so the concentrations of CDPs of 100, 200, and 400 µg/mL when cell viability did not decrease significantly were selected as the drug intervention concentrations. See Table 3.

 

3 Дискусија и закључак

Полисахаридису високе молекулске тежине тежине са чиме се састају од више од 10 моносахарида. Пријављено је да полисахариди имајуИмуномодулациони, антиоксиданси, противупални и хипогликемијски ефекти[15]. Као једна од главних фармаколошки активних супстанци на ЦИСТАНЦХЕ ДЕСТЕРИЦООЛА, ЦДПС има значајну лековиту вредност. Ова студија је прелиминарно окарактерисала структуру ЦДП-а и открила да могу побољшати штету ХК -2 ћелија индукованим високом шећерном окружењем.

 

Сложена структура полисахарида уско је повезана са њиховом биолошком активношћу, међу којима је врста и удео моносахарида, релативна молосахарида, релативна молекуларна маса полисахарида и врсте гликозидских обвезница су кључни фактори који утичу [16]. Умерена релативна молекуларна маса даје полисахариди активнијим локацијама и може показати снажну биолошку активност.
Међутим, велика молекуларна тежина повећаће преносне отпорност на пренос, омета апсорпцију полисахарида и утиче на активност. Супротно томе, мали полисахариди мале молекуларне тежине можда неће моћи да формирају ефикасне активне структуре, што резултира смањеном активношћу [17]. Када истражујете биолошку активност полисахарида, потребно је свеобухватно размотрити састав моносахарида, релативну молекуларну масу и гликозидно тип везе [18]. У овој студији, јонска хроматографија утврдила је да су ЦДПС углавном састојали од глукозе, галактозе и рамнозе, што је у складу са извештајем КСУ ет ал. [19]. Просечне молекуларне тежине тежине на ЦДП-у мерене хроматографије високих перформанси течности су хроматографија 3444, 4198 и 8031 ​​кДа, респективно. Молекуларне тежине три полисахарида цистанце са четири лековита материјала типа цистанце мерено Ианг ет ал. [20] биле су сличне. ЦДПС може садржавати и-тип гликозидне везе и може да садржи -глукозу или -манозу. Полисахариди састављени од -глуцосе или -Маноне је лакше препознато по наплатним рецепторима 4 (ТЛР4) или ТЛР2 [21].
ДН је једна од најозбиљнијих микроваскуларних компликација дијабетеса, а његова патогенеза је уско повезана са оксидативним стресом, митохондријске дисфункције и ћелијске апоптозе [22]. Ова студија је истраживала заштитни ефекат ЦДП-а на високим ћелијама изазваним ГЛУЦОСЕ-ом -2 регулисањем сигналног пута ТЛР4 / НФ-κБ и њен молекуларни механизам.

Под високим условима глукозе, ХК -2 ћелије показују значајан оксидативни стрес [23]. Студије су откриле да високи ниво шећера значајно повећају производњу интрацелуларног РОС-а. Ова превелика количина РОС-а може директно оштетити липиде ћелијске мембране, што доводи до повећања садржаја липидног пероксидационог производа МДА [24]. Истовремено, активности СОД-а и ГСХ-ПКС-а, важних антиоксидативних одбрамбених система, значајно су смањене, што указује да је антиоксидантни капацитет ћелија тешко оштећен [25]. Ова неравнотежа у оксидационо-антиоксидационом систему даље промовише експресију и активирање ТЛР4 [26]. Претходне студије су показале да ТЛР4 може препознати прекомерна РОС као молекуларна узорка у опасности (влаге), формирајући позитивну повратну петљу [27]. У овој студији, обрада ЦДПС-а значајно је смањила ниво руске, повећане СОД и ГСХ-ПКС активности и смањени садржај МДА. Овај свеобухватни антиоксиданс ефекат сугерише да ЦДП може регулисати одговоре оксидативног стреса кроз више циљева.
У сигналном путу ТЛР4 / НФ-κБ активирани ТЛР4 промовише активирање ИКК комплекса регрутовањем адаптера за адаптеру, што заузврат доводи до фосфорилације и разградње ИЦБ-а [28]. Садашња студија је приметила да је висока глукоза значајно повећала ниво фосфорилације ИЦБ-а, што је довело до пријевозе НФ-ΚБ П65 из цитоплазме до језгра. Студије су показале да нуклеарна транслокација П65 не само да погоршава оксидативни стрес, већ утиче и на митохондријалну функцију [29].
Посматрао је ЈЦ -1 бојење да је високи третман глукозе проузроковало значајно смањење митохондријског мембранског потенцијала, показујући прелазак са црвене флуоресценције на зелену флуоресценцију, што указује да је протони градијент између унутрашњих и спољних мембрана митохондрије поремећен. Митохондријска дисфункција даље погоршава производњу РОС-а, формирајући злобни циклус [30]. Претпостављање ЦДПС-а може да одржи стабилност митохондријалног мембранског потенцијала, а овај заштитни ефекат се може постићи инхибицијом експресије ТЛР4 и активирање НФ-κБ.
Митохондријска дисфункција и упорни оксидативни стрес на крају доводе до ћелијске апоптозе [31]. Бојење Хоецхст открило је да је ћелијске језгре у високој групи за лечење глукозе показало очигледне типичне апоптотске морфолошке промене као што су кондензација, кондензација и фрагментација [32]. Ове промене су уско повезане са унутрашњим апоптозом посредованим митохондријом: Губитак митохондријалног мембранског потенцијала доводи до пуштања цитохроме Ц, активирање каскаде цаспасе и на крају ћелије апоптозе [33]. Нуклеарна морфологија ћелија у групи за претходну обраду ЦДПС-а била је у основи нормално, а обојење је било униформне, сугерише да ЦДПС спречава ћелијску апоптозу одржавањем митохондријске функције и инхибирајући оксидативни стрес.
Укратко, ова студија је систематски открила индикаторе оксидативног стреса (РОС, МДА, СОД, ГСХ-ПКС), митохондријалну функцију (ЈЦ {{{{{1}) и ћелијску апоптозу (Хоецхст), у комбинацији са ТЛР4 / НФ-κБ сигнализационим клипним молекулама који објашњавају механизам акције ЦДП-а: ЦДПС
Прво, побољшањем антиоксиданса капацитета ћелија, смањујући ниво РС и смањење активације ТЛР4; Друго, инхибирањем израза ТЛР4 и фосфорилације ИЦБ-а, блокирајући нуклеарно транслокацију НФ-ΚБ; Коначно, побољшањем митохондријске функције, инхибирање ћелијске апоптозе. Смрт, чиме се играју заштитна улога против ДН-а. Овај вишеструки синергистички ефекат омогућава ЦДП-овима да показују добре перспективе примене у лечењу ДН-а. У наредним студијама, полисахаридна структура ће се даље одредити рендгенском дифракцијом, нуклеарном магнетном резонантном спектроскопијом и спектрометријом гасних хроматографије. Поред тога, просечни резултати молекулске тежине показују да су ЦДПС хетерогени полисахариди. Затим ћемо одвојити и прочистити хомогене полисахариде, открити полисахаридну структуру и биолошку активност и разјаснити однос структуре-активности.