Студија о ефектима калцитриола против старења на људске природне ћелије убице ин витро Ⅱ

3. Резултати

Ова студија се фокусирала на ефекте калцитриола против старења на НК ћелије. Резултати су показали да калцитриолсмањила експресију биомаркера повезаних са старењем укључујући ЦД16, ТИМ3, ПД-1, КИР иповећала експресију НКГ2А НК ћелија. такођеинхибирао пролиферацију НК ћелијаиухапсите их у Г1 фази. Цалцитриолсмањено ослобађање инфламаторних факторакао што су ИЛ-5, ИЛ-13, ИФН- и ТНФ- и имали су одређенеантиоксидациони ефекти, што би могло допринети његовомефекти против старења.

Кликните овде да бисте сазнали ефекте антиоксидације Цистанцхе и добили узорак

3.1 Калцитриол је преокренуо експресију маркера површинског старења, успорио амплификацију НК ћелија и одржао НК ћелије у Г1 фази.

Стареће НК ћелије су показале високу експресију биомаркера повезаних са старењем, као што су ЦД16, ПД-1, ТИМ3 и КИР, и ниску експресију НКГ2А. Открили смо да се нивои експресије биомаркера повезаних са старењем НКГ2А (слика 1а) (*П < 0.05) повећавају, док се експресија ЦД16 (слика 1б), ТИМ3 (слика 1ц) повећава. ), ПД-1 (Слика 1д) и КИР (Слика 1е) (*П <0,05) су смањени након третмана калцитриолом током 72 х. Реверзни ефекти су били у позитивној корелацији са концентрацијом калцитриола (додатна слика 1).

Проширили смо ћелије из узорака људске периферне крви ин витро. Затим смо изоловали НК ћелије (ЦД{{0}}ЦД56 плус) сортирањем магнетних куглица (слика 1ф). Сортиране НК ћелије су затим култивисане са различитим концентрацијама калцитриола или рапамицина током 72 х. Резултати бојења ЦЦК8 показали су да је стопа раста НК ћелија високе концентрације (10− [7] М) третираних калцитриолом била спорија од оне у негативној контролној групи (НЦ) (*П < {{17 }}.05) (Слика 1г). Поред тога, калцитриол је регулисао циклус НК ћелија. Након третмана са калцитриолом током 48 х, НК ћелије су показале висок помак зависан од концентрације калцитриола ка Г1 фази (*П <0,05), док се удео ћелија у Г2 фази (#П <0,05) смањио. Удео НК ћелија третираних калцитриолом у С фази није показао никакву промену, без обзира на концентрацију калцитриола (слика 1х, додатна слика 2). Затим смо тестирали да ли ово заустављање Г1 фазе добијено од калцитриола изазива апоптозу НК ћелија и открили смо да апоптотички биомаркер НК ћелија, имуноглобулин Т ћелија и домен инхибиторног мотива заснованог на тирозину (ИТИМ) на имунорецептору (ТИГИТ), нису показали значајну промену (П > 0,05 , НС) (слика 1и). Ови резултати су имплицирали да додавање калцитриола смањује брзину раста НК ћелија, смањује њихову пролиферацију и изазива заустављање Г1 фазе НК ћелија уместо да изазове апоптозу.

3.2 Калцитриол је смањио ослобађање инфламаторних цитокина у НК ћелијама и инхибирао цитотоксичност НК ћелија

Запаљење је хронична упала ниског степена. Убрзава старење НК ћелија, јер НК ћелије учествују у овој хроничној упали. Слика 2а показује да су нивои ИЛ-5, ИЛ-13, ИФН- и ТНФ- значајно смањени у свим групама него у негативној контроли (*П < 0.05). ИФН- и ТНФ- су добро познати проинфламаторни цитокини, али неке студије су такође показале проинфламаторна својства ИЛ-5. Пријављено је да ИЛ-13 доприноси различитим врстама запаљења слузокоже, као што су алергијска астма, улцерозни колитис, еозинофилни езофагитис и неколико болести повезаних са фиброзом.

Међутим, цитотоксичност НК ћелија углавном укључује ослобађање инфламаторних цитокина и дегранулацију ћелија. Означили смо К562 ћелије са ДИО и заједно култивисали ДИО-К562 ћелије са НК ћелијама третираним калцитриолом током 4 сата. Проценат ДИО плус ПИ плус ћелија био је нижи у свим групама са односом ефектор (Е)/циљ (Т) него у негативној контроли (*П < 0.05) (Слика 2б, ц). Изведена експресија кластера диференцијације 107 (ЦД107) указује на нижу дегранулацију (*П < 0,05) (Слика 2д). Ови резултати показују инхибицију функције убијања НК калцитриолом.

3.3 Калцитриол је активирао експресију СИРТ1- ∆Екон8 и СИРТ1/пЕРК пут повезан са старењем

Да бисмо истражили ефекте калцитриола против старења на НК ћелије, имуноблотирањем смо открили сигналне путеве повезане са старењем. Урађена је Вестерн блоттинг анализа да би се проценили нивои експресије ВДР, СИРТ1-∆Екон8, СИРТ1 и ПЕРК у НК ћелијама третираним калцитриолом. Статистичка анализа је показала да је калцитриол активирао ВДР/СИРТ1/пЕРК осу при високим концентрацијама. У међувремену, калцитриол је активирао експресију СИРТ1-∆Екон8 (*П < 0.05). (Слика 3а).

Слика 1. Фенотип повезан са старењем, експанзија ћелије и анализа ћелијског циклуса НК ћелија. (ае) Људске НК ћелије третиране калцитриолом или рапамицином током 72 сата показале су следеће ћелијске биомаркере: природни убица групе 2, члан А (НКГ2А), кластер диференцијације 16 (ЦД16), Т ћелијски имуноглобулин и протеин 3 који садржи домен муцина ( ТИМ3) програмирана ћелијска смрт-1 (ПД-1) и рецептор сличан имуноглобулину (КИР), који су били повезани са старењем. 50 нМ рапамицин (РАПА) је коришћен као позитивна контрола. н=3 за сваку групу. *П < 0.05 и **П < 0.01 су упоређени са групом негативне контроле (НЦ). (ф) НК ћелије (десно) изоловане из мононуклеарних ћелија људске периферне крви (ПБМЦс, лево) сортирањем магнетних куглица. (г) Анализа ћелијске пролиферације мерена комплетом за бројање ћелија 8 (ЦЦК8). (х) Ефекат калцитриола или рапамицина на ћелије у сортираним нк ћелијама након третмана од 72 х, вп 0.0, 0.05 и фп < 0.05 указују на значајно разлике у Г1, С и Г2 фазама, респективно. Све групе су упоређене са НЦ, респективно. н=3. ) Проценат Т целлиммуноа глобулина и НК ћелија позитивних на инхибиторни мотив (М) домена (ТГИ) базираног на имунорецептору тирозина након третмана калцитриолом или рапамицином током 72 х.*п < 0,05 и **п ​​< 0,01 упоређен је са НЦ. н=3.

3.4 Калцитриол је отпоран на старење НК ћелија изазвано оксидативним стресом ин витро

Широко је прихваћено да је старење узроковано акумулацијом оксидативног оштећења због великог броја доказа пронађених током година [31]. Узгајали смо НК ћелије са различитим концентрацијама Х2О2 током 24 х и открили да је 1{{1{{20}}}}0 μМ концентрација најближа средњој смртоносној дози (ЛД50) (Слика 3б) . Експресија ТИМ3 у популацији НК ћелија повећава се додавањем Х2О2, док се експресија смањује након третмана калцитриолом (*П < 0,05) (Слика 3ц). Поред тога, старе НК ћелије су обојене плавом бојом у присуству -галактозидазе. Ова плава боја ћелија је специфичан знак старења ћелија. Статистичка анализа је показала да нетретиране НК ћелије имају мању ћелијску активност галактозидазе, док су НК ћелије изложене Х2О2 показивале повишену активност галактозидазе. Калцитриол је смањио популацију позитивну на галактозидазу, што указује на присуство мање ћелија које старе (*П < 0,05) (Слика 3д). Смањен потенцијал митохондријалне мембране такође је примећен у различитим ћелијама које старе од неколико врста сисара. У овој студији смо проценили потенцијал митохондријалне мембране НК ћелија. Статистички резултати су показали да је Х2О2 значајно смањио ћелијску активност НК ћелија у поређењу са нетретираним ћелијама, док је калцитриол повећао оштећење изазвано Х2О2 (*П < 0,05) (Слика 3е).

Слика 2. Ефекти калцитриола на функције НК ћелија. (а) Анализа цитокина који ослобађају НК ћелије третиране калцитриолом за 48 х. б) Резултати сортирања ћелија активираног флуоресценцијом (ФАЦС) показали су мртве ћелије К562 обележене са 3,3 -октадецил-оксакарбоцијаниномДлО) и пропидијум јодидом (П). Ћелије К562 су култивисане са различитим односима Нк ћелија третираних калцитриолом за 4 х. (Ц) ФАЦС анализа мртвих К562 ћелија у тестовима убијања. (д) Ефекти дегранулације третираних Нк ћелија у тестовима убијања. н=3 за еациироуп. *п < 0.05 и **п ​​< 0,01 су упоређени са НЦ

3.5 Калцитриол се одупре апоптози НК ћелија изазваној оксидативним стресом ин витро

Затим смо измерили број апоптотичких ћелија. Резултати проточне цитометрије су показали да је третман са 100 μМ Х2О2 током 24 сата довео до значајне апоптозе НК ћелија. Међутим, третман калцитриолом је смањио однос апоптозе (*П < 0,05) (Слика 4а). Сви наведени резултати су показали отпорност калцитриола на оксидативни стрес изазван Х2О2. Међутим, открили смо апоптотичке протеине у НК ћелијама под оксидативним стресом. Пре третмана са Х2О2, 10− [7] М калцитриола је додато НК ћелијама током 24 х. Нивои протеина повезаних са апоптозом, каспаза-3 п17 и каспаза-3 п20, значајно су порасли након третмана са Х2О2. Калцитриол је смањио апоптозу добијену Х2О2- и смањио експресију каспазе-3, п17 и каспазе-3 п20 (*П < 0,05) (Слика 4б). Ови резултати су показали да се калцитриол одупире апоптози изазваној Х2О2.

Слика 3. Тхеефекти против старењакалцитриола на НК ћелије. (а) Експресија рецептора за витамин Д (ВДР), сиртуина 1 (СИРТ1), СИРТ1- ∆Екон8 и протеин киназе Р-лике ендоплазматске ретикулум киназе (пЕРК) у НК ћелијама откривена је Вестерн блоттинг анализом након третмана са калцитриолом од 48 х. Глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (ГАПДХ) је коришћена као контрола оптерећења. Бар дијаграм који илуструје резултате вестерн блотинга (н=3). *П < 0.{{10}}5 и **П < 0.01 су упоређени са НЦ (н=3). (б) Крива дозе морталитета НК ћелија након третмана водоник пероксидом (Х2О2) током 24 х. (ц) Проценат ТИМ3 ћелија које показују високу експресију након третмана са 100 μМ Х2О2 током 24 х. (д) Резултати бојења и анализе -галактозидазе повезаних са старењем. Стареће ћелије су обојене плавом бојом и означене црвеним стрелицама. Скала бар, 50 μм. (е) НК ћелије су обојене Хоецхстом и хлорометил-Кс-Розамином (ЦМКСРос) да би се одредила локација ћелије и потенцијал митохондријалне мембране. Старење и апоптотичке ћелије биле су Хоецхст плус ЦМКСРос- и означене белим стрелицама. Скала бар, 50 μм. Статистичка анализа је показала релативни интензитет флуоресценције. *П < 0,05 и **П < 0,01 упоређени су са Х2О2 групом на сликама Ц, Д и Е (н=3).

Слика 4. Анти-апоптотички ефекти калцитриола на НК ћелије. (а) Анти-апоптотички ефекти калцитриола у Х2О{4}}индукованим повредама. ФАЦС анализа је показала проценат апоптотичких НК ћелија након третмана са 100 μМ Х2О2 током 24 х. (б) Нивои експресије каспазе-3 п20 и каспазе-3 п17 у НК ћелијама откривени су Вестерн блоттинг анализом након третмана са 100 μМ Х2О2 током 24 сата. ГАПДХ је коришћен као контрола оптерећења. Бар дијаграм који илуструје резултате вестерн блотинга (н=3). *П <0,05 је упоређено са групом Х2О2.

4. Дискусија

Дугорочна интеракција између упале и оксидативног стреса је важан фактор у старењу. Поред тога, запаљење и оксидативни стрес су синергистички [32]. Вишак РОС генерисан оксидативним стресом напада ћелије тела. Током овог процеса, активирани имуни систем ослобађа инфламаторне факторе да убије абнормалне ћелије, што доводи до даљег стварања РОС. Недостатак калцитриола може изазвати аутоимуне болести, хроничне метаболичке болести и туморе. Међутим, мало се зна о ефектима калцитриола против старења на имуни систем, посебно на НК ћелије.

У овој студији смо истраживали ефекте калцитриола против старења на НК ћелије. Открили смо да калцитриол повећава експресију НКГ2А, док смањује експресију КИР ин витро. Субпопулација ЦД56-ЦД16 плус НК ћелија, за коју се зна да је повезана са хроничном инфламацијом, значајно је повећана код старијих особа [33]. Стога се смањење експресије ЦД16 изазвано калцитриолом може приписати његовом антиинфламаторном ефекту. Пријављено је да су ТИМ-3 и ПД-1 инхибиторни рецептори и рецептори за исцрпљивање НК ћелија. Наша студија је показала да кал цитриол смањује нивое експресије ТИМ-3 и ПД-1 и спречава апоптозу НК ћелија.

Поред тога, калцитриол инхибира експанзију НК ћелија и одржава популацију НК ћелија у Г1 фази ин витро. Међутим, ћелије у С-фази нису биле погођене. ТИГИТ, који је познат као фактор контролне тачке НК ћелија, остао је непромењен. Ови резултати су показали да Слика 4. Анти-апоптотички ефекти калцитриола на НК ћелије. (а) Анти-апоптотички ефекти калцитриола у Х2О2-индукованим повредама. ФАЦС анализа је показала проценат апоптотичких НК ћелија након третмана са 100 μМ Х2О2 током 24 х. (б) Нивои експресије каспазе-3 п20 и каспазе-3 п17 у НК ћелијама детектовани су Вестерн блоттинг анализом након третмана са 100 μМ Х2О2 током 24 сата. ГАПДХ је коришћен као контрола оптерећења. Бар дијаграм који илуструје резултате вестерн блотинга (н=3). *П <0,05 је упоређено са групом Х2О2. БИОИНЖИЊЕРСКИ 6851 калцитриол није довео до смрти НК ћелија, али је само успорио брзину експанзије НК ћелија.

Добро је познато да запаљење доводи до имуносенесценције [34,35]. Штавише, открили смо да калцитриол смањује нивое ИЛ-5, ИЛ-13, ИФН- и ТНФ- у НК ћелијама. Цитотоксичност НК ћелија је делимично посредована ослобађањем инфламаторних фактора [36]. Штавише, дошло је до смањења морталитета К562 туморских ћелија и дегранулације НК ћелија. Ови резултати су били у складу са нашим очекивањима. Рапамицин је добро познати лек који смањује брзину метаболизма да би спречио старење[37] који се користи као позитивна контрола у овој студији. То доводи до имуносупресије и повећава потенцијални ризик од тумора и туморског оптерећења. Ово оптерећење је потврђено на мишјим моделима рака дојке [38]. Остаје непознато да ли калцитриол показује сличне ефекте као рапамицин. Требало би спровести више студија на животињама и клиничких студија како би се потврдило њихово дејство на људско тело.

Коначно, проучавали смо ефекте калцитриола на антиоксидативно старење. Ресвератрол, добро познати лек против старења, може смањити НФ-κБ пут активирањем СИРТ1/ПЕРК осе. Такође се показало да је ова регулација корисна код неуродегенеративних поремећаја и кардиоваскуларних болести [39]. СИРТ1 деацетилација је повезана са метаболичком контролом и митохондријалном биогенезом. У овој врсти регулације, повишени нивои СИРТ1 могу подстаћи акумулацију гама коактиватора рецептора-1 алфа (ПГЦ-1) активираног пролифератором пероксизома у језгру, што резултира транскрипцијом гена који су неопходни за митохондријалну функцију [40]. Осим тога, СИРТ1 потискује циљ сисара сигналног пута рапамицина (мТОР), који може да заштити нерве и да се одупре старењу мозга код мишева [41]. У овој студији смо идентификовали сличан регулаторни пут за калцитриол. Калцитриол је активирао СИРТ1 преко ВДР-а и подигао осу СИРТ1/пЕРК.

Поред тога, открили смо да калцитриол повећава експресију СИРТ1-∆Екон8. Стресови су познати као фактор који повећава регулацију СИРТ1-∆Екон8. Иако сам СИРТ1-∆Екон8 показује смањену активност деацетилације п53, он испољава адитивни ефекат деацетилације на п53 када је изражен заједно са СИРТ1 пуне дужине [42]. Овај ефекат указује на анти-апоптотичку функцију калцитриола на НК ћелијама. Међутим, остаје да се боље разуме улога СИРТ1-∆Екон8 у путевима везаним за узраст. Пошто пад СИРТ1 може бити последица оксидативног оштећења [43], успоставили смо модел НК ћелија акутно старења ин витро користећи Х2О2. Оксидативно старење изазвано Х2О2 повећало је експресију ТИМ3 као и активност -галактозидазе у НК ћелијама. Открили смо да се калцитриол одупире оксидативном оштећењу и одржава митохондријалну активност и виталност ћелија НК ћелија док спречава ћелијску апоптозу. Међутим, калцитриол још увек није идентификован као лек против старења у клиничкој медицини јер је потребно више доказа о ефектима против старења овог лека ин виво. Укратко, пружили смо прелиминарне доказе који имплицирају ефекте калцитриола против старења на НК ћелије ин витро. Верујемо да ефекте овог лека треба даље истражити у будућим студијама на животињама и клиничким студијама.

5. Закључак

У овој студији смо показали даефекти против старењакалцитриола на НК ћелије. Калцитриол је преокренуо изразбиомаркери старењана НК ћелије. То је успорило НК појачање и задржало их у Г1 фази. Поред тога, калцитриол је инхибирао ослобађање инфламаторних цитокина и смањену дегранулацију НК ћелија. Активација СИРТ1-∆Екон8 и ВДР/СИРТ1/пЕРК осе помоћу калцитриола може бити главни механизам калцитриол ефекта против старења на основу свега горе наведеног. Коначно, калцитриол се одупирао оксидативном старењу НК ћелија ин витро. Даље студије треба да се фокусирају на истраживања на животињама и клиничка истраживања.

Хигхлигхтс

(1) Калцитриол је смањио експресију биомаркера повезаних са старењем укључујући ЦД16, ТИМ3, ПД-1, КИР и повећао експресију НКГ2А НК ћелија. (2) Калцитриол је био у стању да инхибира пролиферацију НК ћелија и заустави их у Г1 фази. (3) Калцитриол је смањио ослобађање главних инфламаторних фактора као што су ИЛ-5, ИЛ-13, ИФН- и ТНФ- НК ћелија.(4) Ефекат калцитриола против старења на НК ћелије може може да се постигне путем сигналног пута Сирт1- пЕРК.

Захвалнице Желели бисмо да се захвалимо свим члановима особља у нашој групи на њиховој подршци и Комитету за иновације у науци и технологији Шенжен на њиховој финансијској подршци за ову студију.

Финансирање Овај рад је финансијски подржао Шенженски комитет за науку и технологију (ЈЦИЈ20170412155231633), Схензхен Кеи Медицал Дисциплине Цонструцтион Фунд (бр. СЗКСК062), Цхенгду Вецистанцхе Биотецх и Санминг пројекат медицине у Шенжену (бр. СЗ1СМ01); Шенжен Комитет за иновације у науци и технологији [ЈЦИЈ20170412155231633]; Схензхен Кеи Медицал Дисциплине Цонструцтион Фунд [бр. СЗКСК062]; Санминг пројекат медицине у Шенжену [бр. СЗСМ202011010].

Етичко одобрење Све процедуре је одобрио Етички комитет Народне болнице Шенжен Луоху (ЗЛНК 12/2019, Шенжен, Кина). Добијен је информисани пристанак за експериментисање са људским узорцима.

Изјава о откривању података Сви аутори су одобрили подношење овог рукописа. Аутори изјављују да немају познатих супротстављених финансијских интереса или личних односа који би могли да утичу на рад приказан у овом раду.

Референце

[1] Овадиа И, Ландсбергер Т, Леинс Х, ет ал. Оштећен имунолошки надзор убрзава накупљање старе ћелије и старење. Нат Цоммун. 2018;9 (1):5435.

[2] Лопез-Отин Ц, Бласцо МА, Партридге Л, ет ал. Карактеристике старења. Ћелија. 2013;153:1194–1217.

[3] Ходгинс ЈЈ, Кхан СТ, Парк ММ, ет ал. Убице 2.0: Терапије НК ћелијама на челу контроле рака. Ј Цлин Инвест. 2019;129(9):3499–3510.

[4] Зху Х, Блум РХ, Бјордахл Р, ет ал. НК ћелије изведене из плурипотентних матичних ћелија са ЦД16а који се не цепа са високим афинитетом посредују у побољшаној антитуморској активности. Крв. 2020;135(6):399–410.

[5] Мандал А, Висванатан Ц. Природне ћелије убице: у здрављу и болести. Хематол Онцол Стем Целл Тхер. 2015;8(2):47–55.

[6] Ле Гарфф-Таверниер М, ет ал. Људске НК ћелије показују велике фенотипске и функционалне промене током животног века. Агинг Целл. 2010;9(4):527–535.

[7] Ле Гарфф-Таверниер М, Безиат В, Децоцк Ј, ет ал. Обрасци експресије НКГ2А, КИР и ЦД57 дефинишу процес диференцијације ЦД56дим НК ћелија одвојен од образовања НК ћелија. Крв. 2010;116 (19):3853–3864.

[8] Мансер АР, Ухрберг М. Промене везане за узраст у репертоарима природних ћелија убица: утицај на функцију НК ћелија и имунолошки надзор. Цанцер Иммунол Иммунотхер. 2016;65(4):417–426. [9] Би Ј, Тиан З. НК Целл Екхаустион. Фронт Иммунол. 2017;8:760.

[10] Фурман Д, Цамписи Ј, Вердин Е, ет ал. Хронична запаљења у етиологији болести током животног века. Нат Мед. 2019;25(12):1822–1832.

[11] Лиу И, ет ал. Антитело специфично за пептид цитомегаловируса мења хомеостазу природне ћелије убице и дели се код неколико аутоимуних болести. Микроб ћелије домаћина. 2016;19(3):400–408.

[12] Цампус Кс, Пера А, Солана Р, ет ал. НК ћелије у здравом старењу и болестима повезаним са узрастом. Ј Биомед Биотецхнол. 2012;2012:195956.

[13] Лиу И, Му Р, Гао ИП, ет ал. Ефекат старења на популацију нк ћелија и њихову пролиферацију у условима ек виво културе. Патхол аналних ћелија (Амст). 2018;2018:7871814.

[14] Синтов АЦ, Иармолински Л, Дахан А, ет ал. Фармаколошки ефекти витамина Д и његових аналога: недавни развој. Друг Дисцов Тодаи. 2014;19(11):1769–1774. [15] Халицка ХД, Зхао Х, Ли Ј, ет ал. Слабљење сигнализације конститутивног оштећења ДНК од

Тражи више:

Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com вхатсапп: плус 86 15292862950