Стк2 индукује диференцијалну експресију гена и ремети гене циркадијалног ритма у проксималном тубулу

Апстрактан: Есцхерицхиа цоли која производи шига токсин(СТЕЦ) узрокује проксималне тубуларне дефекте у бубрегу. Међутим, фактори измењени Схига токсином (Стк) у проксималним тубулима тек треба да буду приказани. Одредили смо Стк рецептор Гб3 у мишјим и људским бубрезима и потврдили експресију рецептора у проксималним тубулима. Стк2-убризгао је ткиво бубрега миша иСтк2-третиране људске примарне бубрежне проксималне тубуларне епителне ћелије(РПТЕЦ) су прикупљени и извршена је анализа микромрежа. Упоредили смо мишје бубреге и РПТЕЦ низове и одабрали уобичајених 58 гена који су различито експримирани у односу на контролу (0 х, није третиран токсином). Открили смо да је ген са највећом експресијом ГДФ15, који може бити укључен у губитак тежине изазван Стк{4}}. Гени повезани са претходно пријављеним Стк2 активностима као што је срц киназа Да, активација пута фосфорилације, активација несавијеног протеинског одговора (УПР) и одговор на риботоксични стрес (РСР) показали су диференцијалне експресије. Штавише, гени циркадијалног сата су различито експримирани, што указује на Стк2-индуковане поремећаје бубрежног циркадијалног ритма. Проксимални тубуларни транспортер На+ -глукозе СГЛТ1 (СЛЦ5А1) регулисан циркадијанским ритмом је био смањен, што указује на пропадање проксималне тубуларне функције, а мишеви су развили глукозурију која потврђује дисфункцију проксималне тубуле. Стк2 мења експресију гена у мишјим и људским проксималним тубулима кроз познате активности и новоистражене поремећаје циркадијалног ритма, што може довести до проксималних тубуларних дисфункција.

Кључне речи:Схига токсин типа 2 (Стк2);проксимални тубул бубрега; миш; хумана бубрежна проксимална тубуларна епителна ћелија (РПТЕЦ); мицроарраи; Циркадијални ритам

Кључни допринос:Анализирани су различито експримирани гени из мишјих бубрега третираних Стк2- и људских примарних проксималних тубуларних ћелија. Поред раније познатих гена захваћених Стк2-ом, показало се да гени повезани са циркадијалним ритмом мењају своју експресију и утичу на функцију проксималне тубуле.

1. Представљање

Есцхерицхиа цоли која производи шига токсин(СТЕЦ) инфекција изазива тешке симптоме хемолитичко-уремичког синдрома (ХУС), који је дефинисан тријадом акутне бубрежне инсуфицијенције, тромбоцитопеније и хемолитичке анемије [1]. Сматра се да шига токсини (Сткс) играју главну улогу у оштећивању ћелија у овој заразној болести. Карактеристична бубрежна хистопатологија ХУС-а укључује гломеруларна и тубуларна оштећења као што су таложење капиларног фибрина унутар гломерула и тубуларна некроза, респективно [1,2]. Ранија појава дисфункције у проксималним тубулима пацијената инфицираних СТЕЦ је пријављена анализом урина. Проксимални тубуларни функционални уринарни маркериН-ацетил глукозаминидаза(НАГ) и 2 микроглобулина (2МГ) из урина акутног стадијума урина пацијената са СТЕЦ О157- или О111- ХУС-ом су измерени као високо повећани, што указује на рану проксималну тубулну дисфункцију [3].

Сткс, укључујући Стк2, се састоје од једне А подјединице и пет Б подјединица (А1Б5 токсин), у којима А подјединица има ензимску активност депуринирајући аденин 4324 из 28С рРНА подјединице 60С рибозома, док су Б подјединице потребне за везивање ћелија домаћина преко глоботриа. (Гб3). Постоји неколико познатих утицаја које Сткс врше на ћелије. (И) Везивањем за свој рецептор Гб3, токсин изазива трансдукцију сигнала преко киназе Срц породице Да [4,5]. Након везивања за рецептор, Сткс се интернализују у ћелију ендоцитозом и ретроградно се транспортују у ЕР. Сткс пролазе кроз ендосом и Голгијев апарат где се А подјединица цепа између каталитичких А1 и Ц-терминалних А2 фрагмената помоћу фурина [6], иако су А1 и А2 фрагменти и даље повезани дисулфидном везом. Токсин стиже до ЕР и дисулфидна веза се може смањити; затим се ослобађа А1 фрагмент из холотоксин [7,8]. Ово је када се утицај (ИИ) ЕР-стреса дешава са несавијеним фрагментима токсина који опонашају протеин, који индукују несавијени протеински одговор (УПР). И А и Б подјединице су способне да вежу Бип, што указује на изазивање ЕР стреса [9,10]. Исцепљени А1 фрагмент се транслоцира у цитоплазму и депурира аденин из 28С рРНА у (ИИИ) инхибира синтезу протеина. Модификација Сткс коју изазива 28С рРНА индукује (ИВ) риботоксични одговор на стрес (РСР), који активира низводну сигналну каскаду [11]. Познато је да утицаји (ИИ) и/или (ИВ) индукују (В) одређену транскрипцију гена која доводи до секреције цитокина [12]. Такође, (ИИ) и (ИВ) су укључени у (ВИ) Сткс-индуковану апоптозу [13–15].

Ин витро експерименти који користе људске проксималне тубуле и ин виво моделе миша снажно повезују оштећења проксималних тубула са Сткс. И примарне културе и ћелијске линије људских проксималних тубула су веома осетљиве на Сткс и показују ослобађање цитокина и ћелијску смрт, укључујући апоптозу [16–20]. Људске примарне бубрежне проксималне тубуларне епителне ћелије (РПТЕЦ) експримирају рецептор Гб3, веома су подложне Схига токсинима и коришћене су у многим чланцима за анализу биолошких реакција као што су инхибиција синтезе протеина, производња цитокина и индукција апоптозе [17,20] . Мишеви којима је убризган Схига токсин типа 1 (Стк1) показали су глукозурију, што указује на смањену реапсорпцију глукозе у проксималним тубулима [21]. Ово указује на токсичност Сткс за проксималне тубуле и ин витро и ин виво. У СТЕЦ-инфицираним моделима мишева, чести налази у хистопатологији су некроза тубуларних епителних ћелија и излупљених ћелија унутар лумена проксималних тубула [22–24]. Мишеви којима је убризган пречишћен Стк (било Стк1 или Стк2) такође показују љуштење проксималних тубула са релативно нетакнутим језгрима [25–27].

Иако су оштећења проксималних тубула повезана са Стк ињекцијом или СТЕЦ инфекцијом описана функционално и хистолошки, циљеви гена укључени у лезију проксималних тубула тек треба да буду приказани.

Овде смо анализирали експресију гена у Стк2-ињектираним мишјим бубрезима и Стк2-третираној култури хуманих примарних бубрежних проксималних тубуларних епителних ћелија (РПТЕЦ) да бисмо показали промене гена повезане са проксималним тубулима изазване Стк2.

2. Резултати

2.1. Стк2-Патологија бубрега убризганог миша

Да би се идентификовала Стк{0}}повезана мишја бубрежна патологија, делови бубрежног ткива код мишева којима је убризган Стк2- обојени су периодичном киселином-Сцхифф (ПАС). Јасна јака ружичаста мрља на луминалној страни тубуларних епителних ћелија указује на гликокаликс руба четкице, који је карактеристичан за проксималне тубуларне ћелије. Одредили смо ћелије/језгра изван гликокаликса (унутар луминалног простора) као одвојене од суседних ћелија и базалних мембрана (тј. избачене ћелије). На слици 1Б (8 х након Стк2), Ц и Д (48 х након Стк2), ољуштене ћелије са релативно нетакнутим језгрима приказане су стрелицама. Такође смо приметили остатке ћелија унутар проксималног тубуларног лумена (Слика 1). Након примене Стк2, ове лезије су се појавиле прилично јасно, док су у 0 х (слика 1А, без Стк2) биле занемарљиве.

Слика 1. Стк2 индукује љуштење проксималних тубуларних ћелија у бубрегу миша. Приказане су Шифове мрље периодичном киселином (ПАС) на резовима мишјих бубрега убризганих Стк2-. (А) 0 х (наивно), (Б) 8 х и (Ц) 48 х након Стк2 ињекције. Стрелице означавају опадање проксималних тубуларних ћелија. Стрелице означавају остатке ћелија. Увећано поље унутар (Ц) је приказано на (Д) са ћелијама које се избацују означеним стрелицама. Цртице у (А–Ц) означавају 50 µм. Линија скале у (Д) означава 10 µ

2.2. Експресија Гб3 у бубрезима миша и човека

2.2.1. Миш Ренал Цортек Гб3 Екпрессион

Пошто су проксималне тубуларне ћелије показале хистолошка оштећења од Стк2 инзулта, тестирали смо експресију глоботриаозилцерамида (Гб3) рецептора Стк2 у кортексу мишјег бубрега заједно са проксималним тубуларним маркером аквапорином-1 (АКП1). Као што је приказано на слици 2, АКП1-позитивне ћелије су показале Гб3 позитивност углавном на луминалној страни ћелија (ћелије су означене затвореним врховима стрелица, док су лумини означени звездицама). Такође смо приметили да АКП1 негативне тубуларне Гб3 мрље вероватно сакупљају ћелије канала (слика 2 отворена стрелица) као што је објављено [28]. Интензитет бојења Гб3 био је јачи у АКП1 (−) ћелијама, међутим, број ове врсте тубула је био мањи у поређењу са Гб3/АКП1 двоструко позитивним проксималним тубулима у кортексу. ЦД31-позитивне ендотелне ћелије су Гб3 негативне у бубрегу миша. Контрола антитела за Гб3 (пацовски ИгМ) коришћена је као негативна контрола. ИгМ пацова није реаговао са ткивом бубрега миша (слика С1)

2.2.2. Експресија хуманог бубрежног кортекса Гб3

У људском бубрежном ткиву, Гб3 је такође био позитиван у АКП1-позитивним проксималним тубулима (Слика 3, затворени врхови стрелица). Локализација Гб3 унутар проксималних тубуларних ћелија била је јача на луминалној страни. Такође смо приметили ћелије АКП1 (-) Гб3 (+) (слика 3, отворене врхове стрелица) као што смо то урадили у мишјем ткиву. Људске ендотелне ћелије експримирају Гб3 (ЦД31/Гб3 двоструко позитиван, слика 3, звездица). Контролни пресеци изотипа са ИгМ пацова нису показали позитивну реакцију у људском бубрежном ткиву (Слика С2).

2.3. Мицроарраи Аналисис

Пошто су и мишје и људске проксималне тубуларне епителне ћелије позитивне на Гб3, то сугерише да је на овај тип ћелије директно погођен Стк2. Да бисмо одредили гене захваћене Стк2-у мишјим и људским проксималним тубуларним ћелијама, екстраховали смо укупну РНК из бубрега мишева убризганих Стк2- и Стк2-третираних људских примарних РПТЕЦ и анализирали експресија гена микромрежом

2.3.1. Диференцијално изражени гени у мишјем бубрегу и РПТЕЦ-у

Одабрани су диференцијално експримирани гени (ДЕГ), који су заједнички и за бубреге миша и за РПТЕЦ. Основа одабира уобичајених ДЕГ-ова је да (1) гени са лог2-променом пута (у односу на 0 х) више од 1 или мање од −1 у бубрезима миша и РПТЕЦ микронису најмање у једном временска тачка и (2) дистрибуција лог2- пута промене гена се уклапају у кубичне криве пре него на квадратне криве да би се боље прилагодили врхунци експресије гена у средини временског тока у микромрежу бубрега. Уз претходна два критеријума, одабрали смо 58 заједничких гена између бубрега миша третираног Стк2- и хуманог РПТЕЦ (слика 4А). Обрасци експресије ових 58 гена у бубрезима миша приказани су у топлотној мапи (Слика 4Б). Већина гена је повећана у каснијим сатима након ињекције Стк2; међутим, неки гени су имали раније обрасце експресије. За сваку временску тачку наведени су гени који су имали више од 1 лог{15}}промена (табела 1).

Слика 4. Анализа микромрежа. (А) Међу генима анализираним микромрежом, 147 гена (зелено заокружено) и 4013 гена (црвено заокружено) из мишјег бубрега третираног Стк2-ом, односно РПТЕЦ, откривено је да имају лог{ {4}}промена пута мања од -1 или више од 1. Гени који су измењени третманом Стк2 у односу на 0 х у оба микрониза (уобичајени различито експримирани гени/ДЕГ) износили су 58 (црвена и зелена преклапана област). (Б) Топлотна мапа уобичајених 58 гена приказана је у временској линији узорковања бубрега миша. З једнако 0 означава просек вредности лог2- пута промене гена и одражава тренд експресије гена. Дакле, зеленкаста боја представља нижу вредност од просека одређеног гена у низу, док црвенкаста боја представља промену изнад просека. Лог{15}}подаци за 58 гена из скупа података од 72 сата убризганог ПБС-ом у поређењу са 0 х представљени су као табела С3 за референцу. (Ц) Приказан је графикон обогаћивања Метасцапе ГО. Кс-оса показује −лог10 п вредности обогаћених ГО термина у 58 заједничких ДЕГ да је већи број обогаћеног ГО термина вероватније релевантан за систем. Приказани су 20 најбољих обогаћених ГО термина. (Д) СТРИНГ анализа 58 заједничких ДЕГ-ова приказана је у шест најповезанијих/сродних кластера. Сферичне боје означавају гене који припадају истом кластеру. Односи акција између гена приказани су на начин кодиран бојама и крајњим обликом. ЕНСГ00000279576 је сада кодиран као ЕНСП00000485396, што означава људски ИД гена МАЛАТ1.

Да бисмо анализирали функционалност уобичајених ДЕГ-ова, користили смо платформу Метасцапе. Он додељује термине генске онтологије (ГО), који се састоје од молекуларне функције, ћелијске компоненте и биолошког процеса, одабраним генима. Депоновали смо уобичајених 58 ДЕГ у Метасцапе и добили 20 најбољих ГО термина којима припадају ови ДЕГ (Слика 4Ц). ГО термини су наведени са одговарајућим генима у табели С1. Да бисте видели листу гена у оквиру сваког ГО термина приказаног на слици 4Ц, погледајте табелу С2 Метасцапе обогаћивање. ГО термини повезани са ћелијском смрћу, упалом и сигналним каскадама су рангирани у првих 20 као што се и очекивало; међутим, циркадијални ритам је привукао пажњу као нови термин ГО. Познате везе заједничких гена приказане су СТРИНГ анализом (слика 4Д). У овој анализи, гени су груписани у шест различитих група које су узете у обзир уз јаку повезаност везивања, утицаја (катализа, активација или инхибиција), као и коекспресија гена.

2.3.2. Тренд експресије гена

Трагови неколико експресија гена су приказани на графиконима са к-осом за време (х) након ињекције Стк2 и и-осом за лог2-промену пута у односу на 0 х (Слика 5). Дакле, вредност и-осе једнака 1 значи 2-промену пута у односу на 0 х израз.

Слика 5. Диференцијално изражени гени са временском линијом узорковања мишева. (А) Приказани су обрасци експресије ПДК4 и ЦЕБПБ мРНА. (Б) непосредно-рани гени. (Ц) Експресије матрицелуларних протеина ЦИР61 (ЦЦН1) и ЦТГФ (ЦЦН2). (Д) Приказани су гени који се односе на УПР ДДИТ3 (ЦХОП, ГАДД153), ДДИТ3 везујући партнер ЦЕБПБ и фактор негативне повратне спреге ППП1Р15А (ГАДД34). (Е) Приказани су фактори транскрипције ДДИТ3 (ЦХОП, ГАДД153) и АТФ3 и ГДФ15, који је транскрипцијски регулисан овим факторима. (Ф) Приказани су гени повезани са УПР и РСР. (Г) ЕДН1 у односу на УПР гене су уцртани. (Х) Рани пикови ЕДН1 и ЕГР1 и следећи пик ПЕР1 приказани су са каснијим постепеним повећањем сва три гена. (И) Гени са слике 4Д љубичасте групе су гени везани за циркадијални ритам. (Ј) Приказани су циркадијални гени језгра ПЕР1, Арнтл (БМАЛ1), Цри1 и Цлоцк. (К) Приказани су ПЕР1 и бубрежни гени регулисани циркадијанским часовником. (Л) Приказани су инфламаторни гени са генима везаним за НФ-кБ пут. Да бисте видели појединачне тачке података лог2, погледајте Додатну слику С4. Слика С5, која приказује просечни лог2 са тракама стандардне девијације, представљена је као референца.

Услуга подршке Вецистанцхе-а - највећи извозник цистанцхеа у Кини:

Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com

Вхатсапп/тел:+86 15292862950

Купите за више детаља о спецификацијама:

хттпс://ввв.кјцистанцхе.цом/цистанцхе-схоп

НАБАВИТЕ ПРИРОДНИ ОРГАНСКИ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНЦХЕ СА 25% ЕХИНАКОЗИДА И 9% АКТЕОЗИДА ЗА ИНФЕКЦИЈУ БУБРЕГА