Клонирање гена, функционална идентификација, структура и анализа експресије сахарозе синтазе из Цистанцхе Тубулоса Ⅱ

Резултати и анализа

1 Ископавање гена сахарозе синтазе у Цистанцхе тубулоса и клонирање ЦтСус гена

Using the amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 as a template[16], the sequence was aligned in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data. They were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>ваздушни део.

Висококвалитетни Цистанцхе Тубулоса за здравље мушкараца

Због тога су вредности ФПКМ нивоа експресије два кандидата гена за сахарозу синтазу добијене у почетном скринингу у подацима транскриптома различитих делова Цистанцхе тубулоса нормализоване помоћу З-скора и извршена је диференцијална анализа (Слика 1А). Резултати су показали да је ЦтСус ген имао највећи ниво експресије у хаусторијуму, а ниво експресије у подземном делу био је већи од оног у надземном делу, што је било у складу са обрасцем акумулације гликозидних једињења у различитим деловима Цистанцхе тубулоса, док је ниво експресије гена ЦтСус1 у хаусторијуму био низак. Према томе, на основу горњих резултата, ген ЦтСус је одабран за накнадну амплификацију секвенце, егзогену експресију и функционалну идентификацију. Коришћењем цДНК Цистанцхе тубулоса као шаблона, производ са једном траком је добијен на ~2500 бп након ПЦР амплификације (Слика 1Б). ПЦР производ је извучен из гела и везан за вектор за клонирање, а кодирајући регион пуне дужине циљног гена је добијен секвенцирањем. Дужина ЦтСус секвенце била је 2418 бп.

Слика 1. Истраживање гена и клонирање ЦтСус из Ц. тубулоса и биоинформатичка анализа протеина кодираног у њему. О: Нивои експресије ЦтСус и ЦтСус1 гена у различитим деловима Ц. тубулоса су нормализовани као З-резултати на основу њихових ФПКМ вредности; Б: Амплификација гена ЦтСус; М: ДНК маркер; Ц: Конзервативни домен ЦтСус протеина који је предвидео СМАРТ; Д: Вишеструко поравнање секвенци синтаза ЦтСус и сахарозе идентификованих из других биљака укључујући Арабидопсис тхалиана, Соланумтуберосум и Албуца брацтеата. Домен синтезе сахарозе и домен преноса шећера су представљени црвеним и плавим кутијама, респективно; Е: Филогенетска анализа ЦтСус и сахарозесинтаза из других биљака; Ф: СДС-ПАГЕ анализа хетерологне експресије ЦтСус коришћењем пЦолд™ И вектора у Е. цоли. Трака 1: Протеински маркер; Трака 2: Супернатант фракција; Трака 3: Преципитатефрацтион. Црвена стрелица показује протеин ЦтСус. Г: ПЦР колоније једног клона који садржи оба два рекомбинантна плазмида. М: ДНК маркер; 1: пЕТ-28а-УГТ71БД1; 2: пЦолд™ И-ЦтСус

Табела 2 Сличности секвенци аминокиселина између ЦтСус и сахарозне синтазе идентификоване из друге биљке

2.3 Филогенетска анализа

Филогенетско стабло конструисано софтвером МЕГА коришћено је за анализу филогенетског односа између сахарозне синтазе ЦтСус из Цистанцхе тубулоса и других сахарозних синтаза биљног порекла. Резултати су приказани на слици 1Е. Синтазе сахарозе биљног порекла показују различите еволуционе гране код двосупница (региони И и ИИ) и монокота (регија ИИИ). ЦтСус се налази у грани двосупнице, а секвенце које су најближе ЦтСус су све из биљака Ламиацеае (Цистанцхе тубулоса је биљка Ламиацеае Оробанцхацеае), док је друга грана углавном састављена од биљака Соланалес, што даље указује на високу очуваност и хомологија гена сахарозе синтазе биљног порекла у еволуцији биљака истим редоследом. Међу њима, сахароза синтаза ПрСус (АЕН79500.1) из Пхелипанцхе рамоса биљке Оробанцхацеае најближа је ЦтСус.

3 Анализа егзогене експресије и активности ЦтСус

3.1 Егзогена експресија ЦтСус гена ПЕТ-28а-ЦтСус, пЕТ-24б-ЦтСус и пЦолд™ И-ЦтСус плазмиди верификовани секвенцирањем су пребачени у експресију компетентну Е. цоли Трансетта (ДЕ3), а позитивни клонови су прегледани помоћу ПЦР колоније ради верификације секвенцирања. Добијени рекомбинантни експресиони сојеви су индуковани ИПТГ ниском температуром за експресију протеина, бактерије су сакупљене центрифугирањем и додат је пуфер за лизу да би се бактерије разбили да би се добио супернатант и талог, а за детекцију је изведен СДС-ПАГЕ. Резултати су показали да када су пЕТ-28а и пЕТ-24б коришћени као експресиони вектори, ЦтСус није експримиран у Е. цоли, док када је пЦолд™ И коришћен као вектор експресије, јасан ЦтСус рекомбинантна протеинска трака је откривена у региону од ~100 кДа, што је било у складу са његовом теоријски предвиђеном релативном молекулском масом од 92,2 кДа (слика 1Ф).

3.2 Трансформација целе ћелије

Да би се прелиминарно проверила каталитичка функција ЦтСус, конструисан је коекспресиони сој ЦтСус и гена гликозилтрансферазе УГТ71БД1. УГТ71БД1 је клониран и идентификован из Цистанцхе тубулоса и представља УДП-глукозилтрансферазу која може нашироко да прихвати ароматична једињења као што су фенилетаноидни гликозиди, различите врсте флавоноида, стилбен и кумарин као рецепторе и катализује реакцију глукозилације супстратне групе фенолног лукозола. као донатор шећера [18]. Увођење ЦтСус може теоретски да обезбеди више УДП-глукозе донора гликозила за реакцију глукозилације коју катализује УГТ71БД1, чиме се промовише реакциона равнотежа да се креће ка формирању производа гликозилације, чиме се повећава принос производа гликозилације. ПЦолд™ И-ЦтСус плазмид и пЕТ-28а-УГТ71БД1 плазмид су истовремено трансформисани у експресију компетентну Е. цоли Трансетта (ДЕ3). Појединачни клонови који садрже оба рекомбинантна плазмида су скринирани помоћу ПЦР колоније, а позитивни рекомбинантни експресиони сојеви су добијени верификацијом секвенцирања (Слика 1Г). Двострука генска коекспресија је индукована ин витро, а пЕТ-28аУГТ71БД1 сој експресије једног гена је коришћен као контролна група. Активност ЦтСус у катализацији стварања донора УДП-глукозе је прелиминарно верификована трансформацијом целе ћелије. Резултати ХПЛЦ и масене спектрометрије високе резолуције показали су да када је реакција трансформације целе ћелије спроведена са аконитином 1 и ресвератролом 2 као супстратима, генерисање очигледних производа гликозилације је откривено након 24 сата трансформације, као што је приказано на слици 2.

Слика 2 Целоћелијска биотрансформација супстрата 1 или 2 помоћу рекомбинантног соја који садржи УГТ71БД1 или рекомбинантног соја који садржи купловање УГТ71БД1 са ЦтСус, респективно. О: ХПЛЦхроматограми биотрансформације целе ћелије супстрата 1. Таласна дужина детекције била је 360нм; Б: ХРЕСИ-МС и МС2 спектри производа 1а; Ц: ХПЛЦ хроматограми биотрансформације целе ћелије супстрата 2; Таласна дужина детекције била је 330 нм. Д: ХРЕСИ-МС спектри производа 2а и 2б

Када је 1 (м/з 179.034 4 [М+Х]+, молекулска формула Ц9Х6О4) је коришћена као супстрат, хроматографски пик производа 1а (м/з 341.087 2 [М+Х]+, предвиђена молекулска формула Ц15Х16О9) је детектован на 5,39 мин, што је било у складу са УВ упијање супстрата и контролног производа. У исто време, у МС2 спектру 1а је детектован пик фрагмента од м/з 179.033 4 [М+Х]+, који је настао губитком 1а молекула глукозе (162 Да), што указује да 1а је био производ супстрата 1 повезан са молекулом глукозе. Стопа конверзије је израчуната интеграцијом површине врха. Утврђено је да је стопа конверзије целих ћелија УГТ71БД1 које катализују супстрат 1 за стварање гликозилованог производа 1а била 71,87%, док је додавање ЦтСус повећало стопу конверзије реакције на 95,84%, 1,3 пута више од контролне групе. Када је супстрат био једињење 2 (м/з 227.072 5 [МХ]-, молекулска формула Ц14Х12О3), хроматографски пикови производа 2а (м/з 389.123 4 [МХ]-, предвиђена молекуларна формула Ц20Х22О8) и 2б (м/з 575.175 9 [М+На]+, предвиђена молекулска формула Ц26Х32О13) у складу са карактеристичном УВ апсорпцијом супстрата и контролног производа детектовани су на 10,32 и 6,52 мин, респективно. . Пик фрагмента је детектован на 3 [МХ]-, који је настао губитком једног молекула глукозе (162 Да), што указује да је 2а производ супстрата 2 повезан са једним молекулом глукозе. Поређењем са подацима у литератури [18] и информацијама о предвиђању масене спектрометрије, утврђено је да је производ 2б производ супстрата 2 који је повезан са два молекула глукозе. Стопа конверзије је израчуната коришћењем интегрисане површине пика. Утврђено је да додавање ЦтСус може повећати стопу конверзије реакције гликозилације супстрата 2 са 64,01% на 78,51%, међу којима је принос моносахаридног производа 2а повећан са 45,09% на 63,58%, а принос дисахаридног производа 2б промењен са 18,92% на 14,93%.

3.3 Пречишћавање ЦтСус рекомбинантног протеина и идентификација ин витро ензимске активности

Резултати експеримента трансформације целе ћелије сугеришу да ЦтСус има активност катализације производње УДП-глукозе активног донора глукозе. Да би се даље директно верификовала ова каталитичка активност путем ин витро ензимске каталитичке реакције, фузиони протеин ЦтСус гена у пЦолд™ експресионом систему је одвојен и пречишћен афинитетном хроматографијом. Резултати су показали да када је пЦолд™ И коришћен као вектор експресије, рекомбинантни протеин је експримиран у великим количинама, али углавном у преципитату. Када је пЦолд™ ТФ коришћен као вектор експресије, ген ЦтСус је експримиран у великим количинама у Е. цоли (Слика 3А). Фузиони протеин је пречишћен ХисТрап ФФ афинитетном хроматографијом и подвргнут ин витро ензимској каталитичкој реакцији. Резултати су приказани на слици 3Б. Када су сахароза и УДП коришћени као супстрати, у поређењу са негативном контролном групом, нови пик производа је детектован на 10,32 мин. Његово време задржавања и УВ апсорпција били су у складу са УДП-глукозом. Доказано је да је производ УДП-глукоза у поређењу са стандардом. Међутим, пошто фузиони протеин експримиран експресијским вектором пЦолд™ ТФ садржи велику растворљиву ознаку фактора окидача (величина протеина ознаке је 48 кДа), то ће имати велики утицај на каталитичку активност протеина. Због тога је ознака фузионог протеина додатно пресечена ензимом Фактор Кса, а ЦтСус протеин без егзогених ознака је пречишћен (Слика 3А). Протеин је подвргнут ин витро ензимској катализи, а резултати су показали да је принос УДП-глукозе повећан са 3,53% на 10,66%

(Слика 3Б). Горе наведени резултати потврдили су активност ЦтСус у катализацији производње УДП-глукозе путем ин витро ензимске катализе, а такође су показали да присуство велике афинитетне ознаке погодује растворљивој експресији ЦтСус, али ће такође значајно утицати на ин витро каталитичка активност ензима.

Слика 3 Хетеролошка експресија и функционална идентификација ЦтСус. О: СДС-ПАГЕ анализа ЦтСус протеина. Трака 1: Протеински маркер; Трака 2: Рекомбинантни ЦтСус са фактором окидања; Трака 3: Покрени цепање ознаке фактора коришћењем протеазе фактора Кса да би се добио ЦтСус протеин означен црвеном стрелицом. Б: Инвитро ензимски тестови који користе фузиони протеин и ЦтСус протеине без фактора који катализују синтезу УДП-глукозе у присуству сахарозе и УДП-а, респективно, са референтном стандардном УДП-глукозом. Кувани протеин је коришћен као контролна група под истим условима. Таласна дужина детекције била је 260 нм