Синергистички антиинфламаторни ефекти Ламинариа Јапоница Фуцоидан и екстракта Цистанцхе Тубулоса

Као имуни одговор против страних антигена, макрофаги ослобађају проинфламаторне цитокине као што су фактор некрозе тумора- (ТНФ-), интерлеукин-1 (ИЛ- 1), ИЛ-6 и други. Такви цитокини индукују хемотактички прилив гранулоцита, моноцита, лимфоцита и мастоцита у оштећено ткиво што промовише уклањање антигена и опоравак ткива. Међутим, прекомерна инфилтрација и активација ћелија погоршава повреде ткива, што доводи до едема (васкуларне ексудације) и болова који су добро познати феномени упале.

ТНФ- је важан фактор за индукцију експресије гена синтазе азот оксида (иНОС) у неколико ћелијских линија. Активација иНОС-а доводи до производње азотног оксида (НО) који не само да модулира неколико физиолошких функција као што су бактерицидна и вазодилатација, већ и изазива упалу. Након повреде ткива, деградацијом фосфолипаза фосфолипида ћелијске мембране настаје арахидонска киселина. Арахидонска киселина се даље разлаже циклооксигеназом (ЦОКС) до простагландина (ПГ). Прекомерна количина ПГЕ2 коју формира ЦОКС-ИИ индукује неколико цитокина за упалу. Пошто и НО и ПГЕ2 делују као главни фактори за инфламацију и индукцију бола, ТНФ--НО и ЦОКС-ИИ-ПГЕ2 путеви су главни токови запаљеног процеса, који су инхибирани кортикостероидима и нестероиднимантиинфламаторни лекови(НСАИД), респективно.

Иако постоји неколико стероида и НСАИЛ затерапија инфламаторних болести, ови лекови могу изазвати нежељене ефекте на имуни систем, гастроинтестинални тракт, бубреге, јетру, централни нервни систем, крвни притисак и кардиоваскуларни систем. Због тога је неопходно минимизирати штетне ефекте хемијских терапеутика заменом или употребом у комбинацији са природним производима.

Фукоидан, комплекс сулфатних полисахарида из морских алги као што су Ламинариа јапоница и Цладосипхон окамуранус широко распрострањен у многим земљама, дуго се користио као терапеутика у оријенталној медицини. У претходним студијама је показано да фукоидан има антиоксидативно, антикоагулативно, антиканцерогено иантиинфламаторне активности. Сходно томе, благотворно дејство фукоидана на инфламаторне болести, исхемију, имунолошку дисфункцију и туморе привлаче пажњу истраживача. са друге стране,Цистанцхе тубулоса(ЦТ) се такође широко користи као традиционални лек у Кини. Пријављено је да ЦТ екстракти смањују производњу ТНФ-а и ИЛ- 4 који су главни фактори за производњу НО у инфламаторним путевима [19].

Такви претходни налази су нас навели да истражимо комбиновану ефикасност фукоидана и ЦТ екстракта на 2 главна пута упале. Да бисмо разјаснили механизам деловања, анализирали смо НО и ПГЕ2 у ексудатима услед упале ваздушних кеса изазваних карагенаном.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПРЕВЕНЦИЈУЗАПАЉНЕ АКТИВНОСТИПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Материјали и методе

Материјали

Полупречишћени фукоидан и водени екстракт ЦТ добијени су од Мисуба РТецх Цо., Лтд. (Асан, Кореја). Фукоидан и ЦТ екстракт су држани на 4 степена, помешани (1:3) растворени у пречишћеној води пре употребе и орално давани у запремини од 5 мЛ/кг.

Ћелијска култура и квантификација НО

Ћелијска линија мишјих макрофага РАВ 264.7 је купљена од Америчке колекције типских култура (Манассас, САД) и култивисана у Дулбеццо-овом модификованом орловом медијуму (Сигма, Ст. Лоуис, САД) који садржи 10% феталног говеђег серума и антибиотика [100 У/мЛ пеницилин (Сигма) и 100 µг/мЛ стрептомицина (Сигма)]. Ћелије су инкубиране у влажној атмосфери са 5% ЦО2 на 37 степени.

Да би се проценили ефекти фукоидана и ЦТ екстракта на секрецију НО, РАВ 264,7 ћелије (1×106 ћелија/мЛ) су инкубиране са фукоиданом или ЦТ екстрактом (1–320 µг/мЛ) током 5 минута. , а затим интерферон- (ИФН-, 10 У/мЛ) и липополисахарид (ЛПС, 10 µг/мЛ) током 24 сата. У нашим прелиминарним студијама, потврђено је да третман са ИФН- плус ЛПС за активацију ћелија РАВ 264,7 није утицао на виталност ћелија до 24 сата и да фукоидан и ЦТ екстракт нису били цитотоксични до 1 мг/мЛ. Као индикатор НО мерена је концентрација нитрита (НО2 – ), оксидованог производа НО. Подлога за културу је помешана са једнаком запремином Грисовог реагенса (1% сулфаниламид, 0,1% нафтил етилендиамин у 2,5% фосфорној киселини) [21] и инкубирана на собној температури 10 минута. Концентрација нитрита је анализирана на 540 нм, где је НаНО2 коришћен за генерисање стандардне криве.

Животиње и лечење

Мушки ИЦР мишеви (стари 7 недеља) су купљени од Даехан Биолинк (Еумсеонг, Кореја) и смештени у просторији са константним условима животне средине (22±2ºЦ; 40-70% релативне влажности; 12-часовно светло -тамни циклус; 150-300 лук осветљеност). Храна за пелете и пречишћена вода били су доступни ад либитум. Све експерименте на животињама одобрио је Институционални комитет за негу и употребу животиња (ИАЦУЦ) Националног универзитета Цхунгбук (ЦБНУ), Кореја, и спроведени у складу са Стандардним оперативним процедурама (СОП) Центра за лабораторијска истраживања на животињама, ЦБНУ.

Мишеви (н=8/група) су орално третирани фукоиданом (18 или 54 мг/кг), ЦТ екстрактом (54 или 162 мг/кг) или њиховом мешавином (18+54, {{6 }} или 90+270 мг/кг) једном дневно током 7 дана. Ниске дозе фукоидана (18 мг/кг) и ЦТ екстракта (54 мг/кг) су добијене од процењених доза за људе од 100 мг/телу (70 кг) и 300 мг/телу након транслације телесне тежине површине (Км{{14) }} за човека/Км=3 за миша), респективно. Високе дозе фукоидана и ЦТ екстракта су постављене на 3 пута, саме или у мешавини, а мешавина са највишим дозама је фиксирана на 5 пута да би се проценили максимални синергистички ефекти.

Првог дана третмана фукоиданом и ЦТ екстрактом, мишевима је субкутано убризгано 10 мЛ стерилног ваздуха у задњу страну да би се формирала кесица [22,23]. После 2 и 5 дана, у кесицу је поново убризгано 5 мЛ ваздуха. Један сат након завршног третмана, 1 мЛ карагенана (1% у физиолошком раствору; Сигма) или његов носач (физиолошки раствор) је убризган у врећицу.

Анализе ексудата

Ваздушна врећица је испрана са 1 мЛ хладног физиолошког раствора 6 сати након ињекције карагенана и забележена је нето запремина течности за испирање. Укупан број инфламаторних ћелија, неутрофила, моноцита и лимфоцита је одређен помоћу бројача. Концентрације НО и ПГЕ2 су одређене Грисовим реагенсом (Сигма) и ензимским имунотестом (ЕИА) коришћењем Цоррелате-ЕИА комплета (Ассаи Десигнс, Анн Арбор, Анн АрбоУСА), респективно.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА БЛОКИРАЊЕ ДЕЈСТВА НА ХЕМОТАКСИСУ ЗАПАЉЕНИХ ЋЕЛИЈА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Хистопатолошки преглед

Ткиво које облаже врећицу је уклоњено и фиксирано у неутралном раствору формалина. Ставке ткива уграђене у парафин су обојене хематоксилин-еозином и прегледане под светлосним микроскопом на инфламаторне лезије.

Статистичка анализа

Резултати су представљени као средња вредност±СЕ. Поређења експерименталних група су направљена једносмерном анализом варијансе праћеном корекцијом Тукеи-овог теста. АП вредност<0.05 was considered statistically significant.

Резултати

Ин витро, третман ћелијске културе РАВ 264.7, ИФН- и ЛПС у великој мери је повећао производњу НО (Слика 1). Предтретман фукоиданом (1–320 µг/мЛ) није утицао на ослобађање НО из ћелијске линије макрофага (Слика 1А). За поређење, ЦТ екстракт (32–320 µг/мЛ) значајно је потиснуо производњу НО, што указује на антиинфламаторну активност (Слика 1Б).

Ињекција карагенана у ваздушну врећицу миша значајно је повећала запремину ексудата унутар врећице (Слика 2). Таква повећана ексудација је ослабљена третманом са фукоиданом (18 мг/кг) и ЦТ екстрактом (54 и 162 мг/кг). Приметно је да је комбиновани третман фукоидана и ЦТ екстракта додатно смањио запремину ексудата, у поређењу са појединачним ефектима, иако веће комбинације доза (54+162 мг/кг и 90+270 мг/кг) нису показале додатну ефикасност на комбинацију најниже дозе (18+54 мг/кг) (Слика 2А). Садржај Н степена у врећици се такође драстично повећао након ињекције карагенана (Слика 2Б). У поређењу са благим дејством фукоидана, ЦТ екстракт је значајно снизио концентрацију Н степена. Комбиновани третман фукоидана и ЦТ екстракта додатно је смањио ниво НО на начин који зависи од дозе. Слично, повећани садржај ПГЕ2 је синергистички потиснут комбинованом терапијом фукоидана и ЦТ екстракта (слика 2Ц).

Паралелно са инфламаторним медијаторима у врећици, број инфламаторних ћелија се драстично повећао ињекцијом карагенана: 37,8, 4,8 и 24,1 пута контролних нивоа за неутрофиле, моноците и лимфоците, респективно (Табела 1). Међутим, фукоидан и ЦТ екстракт значајно су смањили инфилтрацију инфламаторних ћелија, у којој је фукоидан био нешто бољи од ЦТ екстракта. Неочекивано, истовременом применом фукоидана и ЦТ екстракта није постигнут синергистички ефекат у инфилтрацији инфламаторних ћелија.

Као што се закључује из инфилтрације инфилтрације ћелија у ексудату, поткожно ткиво које окружује ваздушне кесе показивало је тешке инфламаторне лезије (Слика 3). Примећено је огромно много ћелија у задебљаном поткожном ткиву изложеном карагенану (слика 3Б), у поређењу са скоро нормалним карактеристикама код контролних животиња (слика 3А). Такве инфламаторне лезије су значајно ублажене третманом фукоиданом (Слике 3Ц и 3Д) или ЦТ екстрактом (Слике 3Е и 3Ф).

Приметно је да су већи антиинфламаторни ефекти постигнути комбинованом терапијом са фукоиданом и ЦТ екстрактом (Слике 3Г-3И).

Дискусија

Користећи модел упале ваздушних кеса изазваних ин вив степеном арагенаном, убризгавање ваздуха у леђа глодара изазива пролиферацију ћелија које се раслојавају на површини шупљине да би формирале структуру сличну синовијуму. У овом моделу, ињекција инфилтрације инфламаторних ћелија изазвана карагенаном повећала је ексудат, што указује на васкуларно цурење. Ваздушна кеса служи као резервоар инфламаторних ћелија и медијатора који се лако могу мерити у течности која се акумулира локално.

Међу различитим инфламаторним медијаторима који могу индуковати васкуларну пермеабилност, добро је познато да су НО и ПГЕ2 главни фактори укључени у патогенезу многих инфламаторних болести. Они су такође познати као посредници индукције и перцепције бола. иНОС, који се експримира и активира у различитим типовима ћелија стимулацијом са ТНФ- и/или ЛПС током упале, производи високе, упорне концентрације НО. НО је важан регулаторни молекул у различитим физиолошким функцијама, као што је вазодилатација која доводи до васкуларног цурења. ПГЕ2, који се генерише из арахидонске киселине преко ЦОКСс, доприноси развоју многих инфламаторних болести, а прекомерна производња ПГЕ2 као одговор на различите инфламаторне стимулације је повезана са повећањем нивоа ЦОКС-ИИ и напредовањем упале. Стога се путеви ТНФ- - НО и ЦОКС-ИИ-ПГЕ2 сматрају два главна тока инфламаторних процеса, који су блокирани инхибиторима иНОС (кортикостероиди) и ЦОКС (НСАИД), респективно.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ЗАБРАНУ ЗАПАЉЕНИХ БОЛЕСТИ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

У овој студији, истовремена примена фукоидана и ЦТ екстракта смањила је запремину ексудата у кесици, што сугерише да они поседују супресивну активност против васкуларног цурења (Слика 2А). У поређењу са појединачним ефектима сваког фукоидана и ЦТ екстракта, комбиновани третман се додатно повећао, што имплицира да 2 степен синергистички појачава деловање. Такви синергистички ефекти између фукоидана и ЦТ екстракта су подржани њиховим активностима на нивоима НО и ПГЕ2 у ексудату (Слике 3Б и 2Ц).

Занимљиво је, међутим, да је потврђено да фукоидан не инхибира директно активацију макрофага ин витро тестом (Слика 1А). Слично томе, инхибиторни потенцијал фукоидана на тесту акумулације НО и ПГЕ2 ин виво био је релативно нижи него код ЦТ екстракта (Слике 2Б и 2Ц). Такав механизам деловања фукоидана разликује се од директне инактивације ћелија ЦТ екстрактом (Слика 1Б). Поређења ради, фукоидан је показао високу ефикасност у инхибицији инфилтрације инфламаторних ћелија у кесицама (Табела 1). Фукоидан је био бољи од ЦТ екстракта у блокирању миграције неутрофила, моноцита и лимфоцита на места оштећења ткива изазвана карагенаном. Занимљиво је да није било синергистичког антимиграционог ефекта, што указује на различите механизме деловања између фукоидана и ЦТ екстракта: тј. фукоидан блокира инфилтрацију инфламаторних ћелија, док ЦТ екстракт инхибира активацију ћелија.

Полиморфонуклеарне ћелије, посебно неутрофили, су главне ћелијске компоненте регрутоване на акутна инфламаторна места изазвана карагенаном. Поред тога, инфламаторне ћелије као што су макрофаги и лимфоцити такође играју централну улогу у инфламаторном процесу тако што луче цитокине. Када су претходно третирани фукоиданом или ЦТ екстрактом, број белих крвних зрнаца који су мигрирали у ваздушне кесе убризгане карагенаном био је значајно потиснут. Овај резултат је био у складу са ефектом који би постигли кортикостероиди као што је дексаметазон, али не и НСАИЛ укључујући индометацин. Стога се претпоставља да фукоидан и ЦТ екстракт имају делимично својство стероида.

Поред блокирајућег дејства на хемотаксу инфламаторних ћелија, чинило се да ЦТ екстракт потискује активацију макрофага. Ово је потврђено његовим инхибиторним деловањем на НО ин витро и ин виво, који је главни инфламаторни медијатор који производе макрофаги. Дакле, ефекат ЦТ екстракта на макрофаге може бити последица супресије експресије мРНК и/или директне инхибиције иНОС активности у овим ћелијама.

ПГЕ2 је такође један од главних инфламаторних медијатора. Повећава се паралелно са едемом ткива, који сузбијају НСАИЛ, инхибитори ЦОКС. Карагенан може повећати производњу ПГЕ2 индукцијом ЦОКС-ИИ мРНА и ЦОКС-ИИ протеина у ексудату кесице. У овом моделу, карагенан је значајно повећао количину ПГЕ2 и био је значајно потиснут ЦТ екстрактом. Занимљиво је напоменути да је овај резултат био у складу са ефектом који би се постигао од стране НСАИД индометацина. Стога се из резултата закључује да ЦТ екстракт има додатна својства НСАИЛ. Узето заједно, верује се да је ЦТ екстракт испољио и кортикостероидне и НСАИЛ ефекте у моделу упале изазване карагенаном и да је фукоидан побољшаоантиинфламаторни ефекти ЦТ екстрактаблокирањем инфилтрације инфламаторних ћелија.

Иако дефинисање тачног механизма деловања захтева даље проучавање, мешавина фукоидана и ЦТ екстракта је значајно ублажила инфламаторне знаке блокирањем путева ТНФ--НО и ЦОКС-ИИ-ПГЕ2 у запаљењу ваздушних кеса изазваних карагенаном. Ови налази пружају доказ да комбиновани третман фукоидана и ЦТ екстракта може бити обећавајући кандидат за ублажавање различитих врста запаљења које реагују на кортикостероиде или НСАИЛ.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ЗАБРАНУ ЗАПАЉЕНИХ БОЛЕСТИ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%