Сажетак
Да истражују синергистичке инхибиторе ефекатаЦистанцхе Десертицолафенилетаноидни гликозиди (ПХГС) и Глабридин (ГЛА) на пигментацији коже, оптималан масовни однос ПХГС-а у ГЛА прелиминарно је прегледанин витроТест инхибиције активности тирозиназе, 1, 1- дифенил -2- радикално чишћење (ДПХ) и 2,2'-Азино-бис (-6- етилбензотиазолине -6- сулфонска киселина) (АБТС⁺) радикални експерименти за чишћење. Даљње процене су спроведене помоћу три ћелијске моделе:

Модел Б16Ф10 изазване у УВБ-у меланогенези за процену инхибиције синтезе меланина путем активности тирозиназе и садржаја меланина;

Липополисахарид (ЛПС) -Индуирао је упални модел хачера за процјену противупалних ефеката мерењем интерлеукина -6 (ИЛ {{3}) и фактором некрозе тумора- (тнф-).

АФФ (2,2'-Азобис (2- амидинопропани) дихидроклорид-индуковани модел осидатира на стрес за одређивање антиоксиданса преко супероксида омаловажавања (СОД) и каталазе (мачка).

Оптимални однос масених претака / ГЛА идентификован је кроз ове моделе. Резултати су показали да ПХГС / ГЛА решења (припремљена у физиолошком отости са фосфатом, ПХ 6,8) на масовним омјерима од 1: 1, 5: 1 и 10: 1 изложена је значајна инхибиција тиросиназе и синергистичке антиоксидативне ефекте. Стопе инхибиције тирозиназе износиле су 94,37%, 92,93%, односно 88,06%, респективно; Радикалне стопе ДППХ-а достигле су 89,44%, 88,72% и 88,10%; Стопе окидања су била 100,13%, 100,01% и 99,87%. На 25 уг / мл у ДМЕМ-у, ПХГС / ГЛА (1: 1, 5: 1, 10: 1) није показало цитотоксичност према ћелијама Б16Ф10 или Хацат. ПХГС / ГЛА (1: 1) ДМЕМ решење приказаноСупериорна инхибиција тирозиназе(23,80% преостале активности), значајноСмањени садржај меланина(30,90%) и надмашили остале омјере и монотерапија у сузбијању ИЛ -6 / ТНФ-опуштања и побољшања активности СОД / ЦАТ. Синергистичка комбинација ПХГС-а и ГЛА ефективно је ублажена сКИН хиперпигментација инхибирајући меланогенезу, смањујући упалу иПовећајући капацитет антиоксиданса.

Кључне речи
Цистанцедесертицола фенилетаноидни гликозиди; Глабридин; синергистички ефекат; анти-меланогенеза; антиоксидант; противупално; Фармацеутски сировине

 

 

 

Цистанцедесертицола екстрактНа високом нивоуфенилетаноидни гликозиди за избјељивање коже

ВхатсАпп нас за више детаља

 

Експериментални одељак

1.1 Материјали, реагенси и инструменти

Меланома мишаБ16Ф10 (Каталог бр.: СТЦЦ20013Г -1), Вухан СервицеБио Тецхнологи Цо., Лтд.

Људски бесмртни кератиноцитиХацат (каталог бр.: Ицелл-Х066), Ицелл Биосциенце Инц., Шангај, Кина.

Цистанцхе фенилетаноидни гликозиди (ПХГС)иГлабридин (ГЛА), Схаанки Тианкингинг биолошка хемијска технологија Цо, Лтд.

Тирозиназа, Хефеи БАСФ Биотецхнологи Цо, Лтд.

АРБУТИН (АРБ)иЛ-тирозин, Аладдин Биохемијска технологија Цо, Лтд., Шангај, Кина.

1, 1- дифенил -2- пицрилхидразил (ДППХ), Токио хемијска индустрија Цо, Јапан.

2,2'-Азино-бис (3- етилбензотиазолине -6- сулфонска киселина) диаммонијум со (АБТС), Шангај Иуание Био-Тецхнологи Цо, Лтд.

Аскорбинска киселина (ВЦ), Тиањин Дамао Фабрика хемијске реагенције.

Калијум за перфелфатибезводни етанол, Тиањин Зхииуан Цхемицал Реагент Цо, Лтд.

Натријум хидроксид, ЦХЕНГДУ ХУАИИ ФАРМАЦЕУТБАЛСКА МАИЛЦХАНТУРАТИОН ЦО., Лтд.

Дипотасијум фосфат, Шангај Санпу Цхемицал Цо, Лтд.

Л-Допа, Шангај Иуание Био-Тецхнологи Цо, Лтд.

Комплет за бројање ћелија -8 (ЦЦК8), Пекинг Синоинвитроген Биотецхнологи Цо, Лтд.

Тритон Кс -100, Диметил сулфоксид (ДМСО), 2,2'-Азобис (2- метилпропионамидин) дихидроклорид (Аф)иЛипополисахарид (ЛПС), Пекинг Соларбио Сциенце & Тецхнологи Цо, Лтд.

ДМЕМ Средње средње глукозе, Термо Фисхер Сциентифиц (Кина).

Фетал говеђи серум (ФБС), Сигма-Алдрицх (Шангај) Традинг Цо, Лтд.

Решење за пеницилин-стрептомицин, Шангај Дашиер Био-Тецхнологи Цо, Лтд.

Људски ИЛ -6 Елиса Кит, Хуман Тнф-Елиса КитиХуман Цат Елиса Кит, Вухан Фине Биотецх Цо, Лтд.

Комплет тестара у потпуности супероксида (СОД), Нањинг Јианцхенг институт за Биоинсеринг. Сви реагенси су били аналитички разред.

Инструменти који се користе:

Мултискан ФЦ Реадер пуне таласне дужинеиИнкубатор Херацелл 371 ЦО2, Тхермо Фисхер Сциентифиц, УСА.

КК -200 ВДБ ултразвучни чистач, Кунсхан Ултрасониц Инструментс Цо, Лтд.

ДВКВ-Д -2 Дигитална термостатска вода за воду, Пекињска фабрика медицинског инструмента у Пекингу ионггуангминг.

ДХГ -9246 електрична термостатска пећница за сушење, Схангхаи Јингхонг Експериментална опрема Цо, Лтд.

КН4006Б УВБ ултраљубичасти инструмент зрачења(Интензитет зрачења: 8 МВ / цм²), Ксузхоу Кенуо Медицал Инструмент опрема Цо, Лтд.

1.2 Методе

Прво, ПХГС и ГЛА су растворени у било фосфатним пуферираним физиолошком отопином (ПБС, пХ =6. 8) или 50% етанол решења за припрему решења са масовним концентрацијама{0}}}. 0 0 1, 0. 0. {{1 {17}}}} 05, 0.025, 0.1, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6 и 2.0 г / л. Затим су ПХГС и ГЛА помешани у односуМ (ПХГС): М (ГЛА)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20 и 1:40, да припреми ПХГС / ГЛА решења са укупном масовном концентрацијом0.4 g/L, означен каоПХГС / ГЛА (40: 1) ~ ПХГС / ГЛА (1:40), респективно.

 

1.3 Биохемијски експерименти

1.3.1 Тест инхибиције активности тирозиназе

У тањиру 96-,50 ул раствора испитивања, 50 ул ПБС (пХ =6. 8)и50 ул л-тирозин раствора (1 г / л)били су секвенцијално додани. Плоча је инкубирана у воденој купељи од 37 степени 10 минута. Онда,5 0 μЛ раствора тирозиназе (0,4 г / л, еквивалентно 200 у / мЛ)је додат, а плоча је поново инкубирана у воденој купељи од 37 степени још 10 минута.

АРБУТИН (АРБ)коришћен је као позитивна контрола иПБС (пХ =6. 8)коришћен је као празна контрола.

Апсорбанција решења на490 нмје мерено коришћењем микроплата читача, а стопа инхибиције ин витро тиросиназе (%) израчуната је једнаџбе (1).

 

 

У формули:

А _ реакцијаДа ли је апсорбанција раствора узорака која садржи Л-тирозин раствор, ПБС и раствор тирозиназе.

А _ Реакциона контролаје апсорбанција раствора узорка која садржи л-тирозин раствор и ПБС без раствора тирозиназе.

_ празноје апсорбанција раствора која садржи Л-тирозин раствор, ПБС и раствор тирозиназе без узорка.

_ празна контролаје апсорбанција раствора који садржи Л-тирозин раствор и ПБС без узорак и раствора тирозиназе.

1.3.2 Одређивање ДППХ-а на слободној радикалној активности за чишћење

Прво, {0}}. 0197 г (0,05 ммол) ДППХ је тачно тежио и растворен у 250 мл безводног етанола да би се припремило радно решење ДППХ-а са концентрацијом0. 2 ммол / л.

Затим су ПХГС и ГЛА растворени у 50% етанолу да припреме етанолска решења ПХГС-а и ГЛА са масовним концентрацијама{0}}}. 0 0 1, 0. 0 1, 0,1, 0,4, 0,8, 1.2, 1.6 и 2,0 г / л. Етанолска решења ВЦ-а припремљена су на исти начин.

Након тога, етанолска решења ПХГС и ГЛА мешана су у односуМ (ПХГС решење): М (ГЛА раствор)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40да бисте добили 9 етанол решења ПХГС / ГЛА са различитим омјерима масе, означене каоПХГС / ГЛА (40: 1) ~ ПХГС / ГЛА (1:40).

Коначно,100 ул сваког решења узоркаи100 ул радног решења ДППХ-аДодани су у тањир 96-, помешани и укинути и инкубирају на собној температури у мраку 30 минута. Апсорбанција на517 нммерено је коришћењем микроплатног читача. ВЦ је коришћен као позитивна контрола и сваки експеримент је поновљен три пута.

Брзина крњења без икаквих дппх-а (%) израчуната је коришћењем једначине (2).

 

У формули:

A1је апсорбанција раствора узорка + радно решење ДППХ-а.

A2је апсорбанција од 50% радног радног решења етанола + ДППХ.

A3је апсорбанција узореног раствора + 50% етанола.

 

1.3.3 Одређивање АбТСС-а без радикалне активности

Прво,1 г (1,82 ммол) АБТС-аје растворен у деионизираној води да би се припремило АБТС радно решење са коначном концентрацијом7.4 ммол / л. 0. 5 г калијум уговораје растворен у деионизованој води да би се припремило радно раствор калијум перспенфат са коначном концентрацијом2.6 ммол / л. Једнаким количинама радног радног радног радног радног радног радног радног радног решења и малена су мешана и остављена да реагују у мраку током 12 сати да припреме радно решење АбТС⁺.

Затим, етанолска решења ПХГС, ГЛА и ВЦ, као и прсама / ГЛА етанол решења са омјеримаПХГС / ГЛА (40: 1) ~ ПХГС / ГЛА (1:40), припремљени су према поступку описаном у одељку 1.3.2.

Коначно,40 ул сваког решења узоркаи160 ул радног решења за АБТС⁺Додани су у тањир 96-, помешани и реаговали у мраку на собној температури током 6 минута. Апсорбанција решења на734 нммерено је коришћењем микроплатног читача.

АбТСГ-ова брзина прочишћења (%) је израчуната једнаџба (3).

 

 

У формули:

A1је апсорбанција решења узорка + абс⁺ радно решење.

A2је апсорбанција деионизованог радног раствора од воде + абсове.

A3је апсорбанција раствора узорка + деионизирана вода.

1.4 ћелијске експерименте

1.4.1 ћелијска култура

Након оживљавања ћелија Б16Ф10 и Хацат-а, били су сејали у ДМЕМ медијум високог глукозе (који садржи 10% феталног говеда и 1% пеницилин-стрептомицин раствора) и култивисано на37 степени, 5% ЦО2и70% влажносту инкубатору током 24 сата. Статус раста ћелија примећен је под микроскопом, а средње измене или пасусе изведене су по потреби на основу стања раста ћелија.

1.4.2 Експериментална групација

Логаритамска фаза Б16Ф10 и Хацат ћелије су сејале у таблице 96- у одговарајућу густину ћелије и култивирају се 24 сата како би се омогућило придржавање ћелија. Узорак решења са различитим концентрацијама припремљени су помоћу ДМЕМ медијума.

Експерименталне групе су биле следеће:

Нормална група

Група модела

ПХГС ниска доза група(125 уг / мЛ)

ПХГС Средња доза група(250 уг / мл)

ПХГС Хигх-Доза Гроуп(500 уг / мл)

ГЛА ЛОВ-ДОСЕ ГРОУП(6.25 уг / мЛ)

ГЛА Средња доза група(12,5 уг / мЛ)

ГЛА ХИГХ-ДОСЕ ГРОУП(25 уг / мЛ)

ПХГС / ГЛА (1: 1) Група(25 уг / мЛ)

ПХГС / ГЛА (5: 1) Група

ПХГС / ГЛА (10: 1) Група

За тоМодел пигментације изазваног УВБ у Б16Ф10 ћелијама, ћелије модела групне ћелије су третиране30 ул ПБС (пХ =7. 4)и озрачен под УВБ инструментом ултраљубичастих зрачења на3 цм испод уређајаза110 секунди. Експерименталне групе су биле претрешене100 ул различитог решења за узорку1 сат пре додавања30 ул од ПБС-аи зрачење испод УВБ уређаја 110 секунди. Нормална група је континуирано третирана средњом средњем делу глукозе ДМЕМ, а празна група није садржавала ћелије, већ је замењена једнаком количином медијума.

За тоМодел упаљених усана у ЛПС-у у ћелијама Хацат, групу модела је третирана20 уг / мл ЛПС решење за ПБС24 сата. Експерименталне групе су биле претрешене100 ул различитог решења за узорку24 сата пре додавања20 уг / мл ЛПС решењеЈош 24 сата. Нормална група је континуирано третирана средњом средњем делу глукозе ДМЕМ, а празна група није садржавала ћелије, већ је замењена једнаком количином медијума.

За тоАф-индуцирани оксидативни модел стреса у ћелијама Хацат, групу модела је третирана25 ммол / л Афф решење24 сата. Експерименталне групе су биле претрешене100 ул различитог решења за узорку24 сата пре додавања25 ммол / л Афф решењеЈош 24 сата. Нормална група је континуирано третирана средњом средњем делу глукозе ДМЕМ, а празна група није садржавала ћелије, већ је замењена једнаком количином медијума.

Свака група је постављена3 репликација бунараи култури на37 степени, 5% ЦО2и70% влажносту инкубатору.

1.4.3 Тест цитотоксичности

Цитотоксичност је мерена коришћењемЦЦК8 метода. Логаритамиц-фаза Б16Ф10 и ћелије Хацат биле су биле дигестиране са0. 25% трипсин3 минута. Након заустављања варења, ћелије су се више пута пипете, да припреме ћелијску суспензију густином1 × 10⁴ ћелије / мл. Ћелије су биле равномерно семене у тањире у 96-100 ул по добро, а ПБС је додат у периферне бунаре. Након придржавања ћелија, додате су различите концентрације решења за узорке, са3 репликација бунара по групи, а ћелије су култивисане у37 степени, 5% ЦО2и70% влажностза24, 48 и 72 сатапре него што одбаците медијум.

За све групе,100 ул ЦЦК8 ДМЕМ средњег глукозе (који садржи 10% ЦЦК8)је додат и инкубиран за60 минута. Апсорбанција решења на450 нммерено је коришћењем микроплатног читача.

Висажност ћелије (%) је израчуната коришћењем једначине (4).

 

У формули:

_ третираноје апсорбанција ћелија садрже бушотине, раствор ЦЦК8 и решење узорка.

_ празноје апсорбанција доброг и ЦЦК8 решења садрже и без ћелија.

A0је апсорбанција бунарних ћелија и ЦЦК8 раствора, али без решења узорка.

1.4.4 Тест активности тирозиназе

Метода Л-ДоПА коришћена је за мерење активности тирозиназе. Након третирања ћелија за48 сатиКао што је описано у одељку 1.4.2, супернатант је одбачен, а бунари су испрани два пута са ПБС-ом (пХ =7. 4). Онда,50 ул од 1% Тритон Кс -100 решењеје додат у сваку добро и одмах постављен у -80 степени замрзивача за30 минута. Ћелије су одмрзане на собној температури да изазове лизу.

После прегревања на37 степениза5 минута, 10 ул 10 ммол / Л решење за Л-ДоПАје додат у сваку бунар и инкубиран на37 степени, 5% ЦО2 и 70% влажностиза1 сат. Апсорбанција на475 нммерено је коришћењем микроплатног читача. Сваки експеримент је поновљентри путаА активност тирозиназе (%) је израчуната једнаџбе (5).

У формули:

_ експериментје апсорбанција бунарних ћелија и раствора узорка под зрачење УВБ-а.

_ нормалноје апсорбанција бунарних ћелија и раствора узорака без озрачења УВБ-а.

_ празноје апсорбанција доброг садржег медија, али без ћелија.

 

1.4.5 Меланин мерење садржаја

НаОХ метода лизе коришћена је за мерење садржаја меланина. Након третирања ћелија за72 сатаКао што је описано у одељку 1.4.2, супернатант је одбачен, а бунари су испрани два пута са ПБС-ом.100 уЛ воденог раствора НаОХ који садржи 10% ДМСО (1 мол / Л)је додат у сваку бунар, а плоча је постављена уПећница од 90 степениза1 сат. Апсорбанција на490 нммерено је коришћењем микроплатног читача. Сваки експеримент је поновљентри пута, а садржај меланина (%) је израчунато коришћењем једначине (5).

 

1.5 Мерење упалних фактора и оксидативних показатеља стреса

Након третирања ћелија за48 сатиКао што је описано у одељку 1.4.2,Хацат ћелијеИз сваке групе су сакупљене помоћу стругача ћелије, центрифугиране, а на супернатант је сакупљен. Концентрације ИЛ -6 и ТНФ-а су мерене у складу са упутствима ЕЛИСА комплета.

Након третирања ћелија за48 сати, Ћелије хацата сакупљане су ћелијски стругач, подвргнути поновљеним циклусима замрзавања за индустрирање ћелијске лизе и центрифугирано на12, 000 окрилци 10 минута на 4 степени. Супернатант је прикупљен и активностимаСолаи концентрацијеМачкамерени су помоћу ЕЛИСА комплета.

 

1.6 Мерење комбинације индекса

ТхеМетода комбинације индекса (ЦИ)[20] Коришћен је за процену да ли је комбинација ПХГС-а и ГЛА на различитим масовним омјерима излагала синергистичке ефекте у инхибицији активности тирозиназе и антиоксидације. Комбиновани индекс је израчунат коришћењем једначине (6).

 

У формули:

D1иD2представљају одговарајуће концентрације (Г / Л) два лека у комбинованом третману потребном за постизањек% активност.

Дкпредставља концентрацију (Г / Л) сваке појединачне супстанце када се користи само да би се постиглок% активност.

ТхеЦомпусин Софтварекоришћен је за прорачуне:

ЦИ> 1означава антагонистички ефекат.

ЦИ=1означава адитивни ефекат.

ЦИ <1означава синергистички ефекат.

 

1.7 Анализа података

Сви подаци су изражени као"Средња ± стандардна девијација (к ± с)"и расправе су биле засноване на средњим вредностима.

Статистичка анализа је извршена употребомГрапхпад призми 9.5. 0. Једносмерни АНОВА (анализа варијанције) коришћена је за поређење између више група. АП-вредност <0. 05сматрано је статистички значајним.