Циљање напредног рака простате са СТЕАП1 химерним антигенским рецептором Т ћелија и тумор-локализованом ИЛ-12 имунотерапијом
Sep 18, 2023
Шест трансмембранских епителних антигена простате 1 (СТЕАП1) је антиген ћелијске површине за терапијско циљање рака простате. Овде извештавамо о широкој експресији СТЕАП1 у односу на простата-специфични мембрански антиген (ПСМА) код смртоносних метастатских карцинома простате и развој СТЕАП1-усмерене терапије Т-ћелија химерног рецептора антигена (ЦАР). СТЕАП1 ЦАР Т ћелије показују реактивност у ниској густини антигена, антитуморској активности на моделима метастатског карцинома простате и безбедности у људском СТЕАП1 моделу миша. Излазак антигена СТЕАП1 је рекурентни механизам резистенције на третман и повезан је са смањеном обрадом и презентацијом туморског антигена. Примена тумор-локализоване интерлеукине-12 (ИЛ-12) терапије у облику фузионог протеина домена који везује колаген (ЦБД)-ИЛ-12 у комбинацији са СТЕАП1 ЦАР Т ћелијском терапијом побољшава антитуморска ефикасност ремоделирањем имунолошки хладног туморског микроокружења рака простате и борбом против бекства СТЕАП1 антигена кроз ангажовање имунитета домаћина и ширења епитопа.
Кинеска биљка цистанче-антитумор
Metastatic prostate cancer represents an incurable disease responsible for over 33,000 deaths per year in the United States1. Prostate cancer is critically reliant on androgen receptor (AR) signaling and thus the suppression of gonadal androgen production through surgical or chemical castration (androgen deprivation therapy) has been a mainstay of treatment for advanced disease. However, metastatic prostate cancer inevitably develops resistance to androgen deprivation therapy and enters a stage called metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). mCRPC is currently incurable and is considered the end stage of the disease and is associated with a median overall survival of three years2. In the past decade, multiple therapies including an inhibitor of extragonadal androgen synthesis (abiraterone acetate)3, second-generation AR antagonists (enzalutamide)4, radioactive isotope (radium-223)5, and a prostate-specific membrane antigen (PSMA)-specific radioligand therapy (lutetium Lu 177 via votide tetraxetan)6 have been approved for mCRPC. Each of these agents extends survival on average by several months but long-term remissions are rare. Strategies to reprogram the immune system to combat prostate cancer first gained traction with the clinical approval of the dendritic cell vaccine sipuleucel-T for asymptomatic mCRPC7. More recently, several types of immunotherapies including immune checkpoint inhibitors, a DNA cancer vaccine, antibody-drug conjugates (ADC), T cell engaging bispecific antibodies (T-BsAb), and chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies have been under active clinical investigation8,9. CARs are synthetic receptors that leverage the potency, expansion, and memory of T cells and can be engineered against virtually any tumor-associated cell surface antigen. The adoptive transfer of CAR T cells has rapidly become an established treatment for hematologic malignancies with exceptional response rates leading to six clinical approvals in the last five years10. In contrast, CAR T cell therapies targeting solid tumors have lagged due to additional challenges related to the lack of bona fide tumor-specific antigens, inhospitable tumor microenvironments, and poor trafficking, persistence, and expansion of CAR T cells11. Despite the challenges observed in driving effective immune responses toward solid tumors, recent early-phase clinical trials investigating CAR T cell therapies targeting PSMA in mCRPC have reported safety and evidence of significant biochemical and radiographic responses12,13. These preliminary results serve to embolden efforts to develop and optimize new CAR T cell therapies for prostate cancer. While PSMA is the preeminent target for therapeutic and diagnostic development in prostate cancer, recent work indicates that PSMA expression may be quite heterogeneous in mCRPC14. Tumor antigen heterogeneity, especially in the context of single antigen-targeted CAR T cell therapies for solid tumors like prostate cancer, is an important barrier to therapeutic efficacy15. Thus, identifying cell surface antigens with broad and relatively homogeneous expression in prostate cancer is imperative. In addition, very few if any tumor-associated antigens demonstrate tumor-restricted expression—most also exhibit low-level expression in normal tissues that could represent liabilities for CAR T cell therapies due to on-target off-tumor toxicities which can lead to devastating consequences including death16. We previously performed integrated transcriptomic and cell surface proteomic profiling of human prostate adenocarcinoma cell lines and identified six transmembrane epithelial antigens of the prostate 1 (STEAP1) as one of the most highly enriched cell surface antigens17. STEAP1 was first described over two decades ago18 and was recognized as being highly expressed in prostate cancer. STEAP1 is strongly expressed in >80% мЦРПЦ-а са захваћеношћу костију или лимфних чворова19, 62% Евинг саркома20 и више других типова рака21. СТЕАП1 припада СТЕАП породици Металло редуктаза које могу да формирају хомотримере или хетеротримере са другим СТЕАП протеинима22. СТЕАП1 има успостављену функционалну улогу у промовисању пролиферације ћелија рака, инвазије и транзиције епитела у мезенхим–26.
Предности цистанцхе тубулоса-Антитумор
Штавише, СТЕАП1 показује ограничену експресију у нормалном ткиву27 што га чини веома убедљивом метом за терапију рака. Више имунотерапеутских агенаса је развијено да циљају СТЕАП1, али ниједан није клинички одобрен. Утврђено је да АДЦ вандор тузумаб вед отин (ДСТП3086С) који се састоји од хуманизованог анти-СТЕАП1 ИгГ1 антитела повезаног са монометил ауристатином Е има прихватљив безбедносни профил у клиничком испитивању фазе И у мЦРПЦ, али је примећено неколико објективних одговора тумора28. Тренутно се процењује Т-БсАб који укључује два домена за везивање анти-СТЕАП1 фрагмент-антиген (Фаб), анти-ЦД3 једноланчани варијабилни фрагмент (сцФв) и домен који се може кристализовати (Фц) који је пројектован тако да нема ефекторске функције под називом АМГ 509. у клиничком испитивању фазе И (НЦТ04221542) у мЦРПЦ29. Недавно је такође објављено да асиметрични двоструки бивалентни Т-БсАб назван БЦ261 показује моћну антитуморску активност на више претклиничких модела рака простате и Јуинговог саркома30. Поред тога, показало се да хумани леукоцитни антиген (ХЛА) класе И-рестриктирани Т ћелијски рецептор (ТЦР) специфичан за СТЕАП1 пептид инхибира локални и метастатски раст Јуинговог саркома у претклиничком моделу ксенотрансплантата након адаптивног трансфера трансгених Т ћелија31. У овој студији вршимо компаративну анализу релативне експресије СТЕАП1 и ПСМА у смртоносном мЦРПЦ-у да бисмо истражили корисност циљања СТЕАП1 у тренутној ери ПСМА тераностике. Ми конструишемо и прегледамо другу генерацију СТЕАП1 ЦАР-а за антиген-специфичну активацију Т-ћелија и цитолизу циљне ћелије да бисмо добили водећи кандидат за даљу карактеризацију. Одређујемо функционалну епитопску специфичност СТЕАП1 ЦАР Т ћелија и профилишемо експанзију и имунофенотип СТЕАП1 ЦАР Т ћелијских производа од више донатора. Затим утврђујемо снагу и прелиминарну безбедност терапије СТЕАП1 ЦАР Т ћелијама у релевантним претклиничким моделима рака простате, али посматрамо понављајући губитак експресије СТЕАП1 антигена као механизам резистенције на лечење. Да бисмо превазишли овај проблем, процењујемо истовремену примену ЦБД-ИЛ-12 који ремоделира имуносупресивно туморско микроокружење рака простате и ангажује ендогени имунитет да прошири антитуморске одговоре. Заједно, ове студије пружају снажно образложење за клиничко превођење СТЕАП1 ЦАР Т ћелијске терапије код мушкараца са мЦРПЦ и воде стратегије за превазилажење потенцијалних механизама терапијске резистенције.
Предности цистанцхе тубулоса-Антитумор
Резултати
СТЕАП1 је широко изражен у мЦРПЦ ткивима отпорним на третман
We first set out to determine the pattern and extent of STEAP1 expression relative to PSMA in advanced metastatic prostate cancer. We performed immunohistochemical (IHC) staining on a duplicate set of tissue microarrays consisting of 121 metastatic tumors (each with up to three cores represented) collected from 44 men with lethal mCRPC patients collected by rapid autopsy between the years 2010 and 2017 through the University of Washington Tumor Acquisition Necropsy Program32 (Fig. 1a). Plasma membrane staining for STEAP1 and PSMA in each tissue was scored by a research pathologist and semiquantitative H-scores were determined based on the staining intensity (Supple mentary Fig. 1a) multiplied by the percentage of cancer cells staining at each intensity (Supplementary Fig. 1b). By implementing a minimal staining threshold with an H-score cut-off of 30, we found that 87.7% of evaluable matched mCRPC tissues (100 of 114) demonstrated staining for STEAP1 compared to only 60.5% (69 of 114) for PSMA (Fig. 1b). In addition, 28.1% of mCRPC tissues (32 of 114) showed STEAP1 but not PSMA staining (Fig. 1b, c) whereas only 0.9% (one of 114) exhibited PSMA but not STEAP1 staining. Based on these results, we used a linear mixed statistical model to determine that the odds of non-zero (H-score >{{0}}) бојење је било 22-пут (95% ЦИ 6-173) веће за СТЕАП1 него за ПСМА и шансе за Х-скор већи од или једнак 3{{ 27}} су 84- пута (95% ЦИ 30-317) веће за СТЕАП1 него за ПСМА. Просечан СТЕАП1 Х-скор у кости (193; 95% ЦИ 171 до 215) био је значајно већи него код метастаза у лимфним чворовима (разлика -48; 95% ЦИ -21 до -76; п < 0.001) и значајно већи него код висцералних метастаза (разлика -59; 95% ЦИ -42 до -77; п < 0,001). Није било значајне разлике између средњег СТЕАП1 Х-скора у метастазама у лимфним чворовима у поређењу са висцералним метастазама (разлика 11; 95% ЦИ -16 до 39; п=0.4) (додатна слика 1ц). Такође смо приметили неколико случајева са хетерогеном експресијом ПСМА унутар језгара (слика 1д) што је у складу са недавним извештајем о интратуморалној хетерогености ПСМА у биопсијама мЦРПЦ14. Анализа на нивоу пацијента коришћењем средње вредности Х-скора од 30 или једнака и МекНемаров тест је открио да 95% пацијената (42 од 44) има туморе са СТЕАП1 експресијом, док је 68% (30 од 44) било позитивно на ПСМА (Допунска слика 1д). Да бисмо проучили обрасце хетерогености међу пацијентима и унутар пацијената који су повезани са експресијом СТЕАП1 и ПСМА, користили смо СТЕАП1 и ПСМА Х-резове да проценимо хипергеометријске, Симпсонове и Шенонове оцене разноликости. Приметили смо два обрасца експресије СТЕАП1 (слика 1е) са 68% (30/44) пацијената који показују експресију СТЕАП1 на свим метастатским местима (висок СТЕАП1) и 32% (14/44) пацијената који показују метастатска места са и без експресије СТЕАП1 (хетерогени СТЕАП1). Нису идентификовани пацијенти код којих свим метастатским ткивима недостаје експресија СТЕАП1. Слична анализа експресије ПСМА у истој кохорти открила је 45% (20/44) пацијената са високом експресијом ПСМА, 32% (14/44) са хетерогеном експресијом ПСМА и 23% (10/44) без експресије ПСМА. На основу молекуларне субкласификације мЦРПЦ ткива коришћењем АР и експресије неуроендокриног маркера синаптофизина (СИП) коју је проценио ИХЦ, већина пацијената са високом или хетерогеном експресијом СТЕАП1 и ПСМА имала је АР-позитиван рак простате (АР+/СИП- или АР+/СИП+), док су они без експресије ПСМА имали су АР-нулл рак простате (АР-/СИП+ или АР-/СИП-). Идентификовали смо позитивну корелацију између експресије СТЕАП1 и АР (п < 0,001) помоћу уграђеног линеарног мешовитог модела са случајним ефектом у случајевима представљеним на микромрежу ткива (додатна слика 2а, б) што се очекивало с обзиром да је СТЕАП1 андроген -регулисани ген33,34. Насупрот томе, негативан тренд је цењен између експресије СТЕАП1 и СИП (додатна слика 2ц). Ови налази сугеришу да, попут ПСМА35, експресија СТЕАП1 може бити изгубљена неуроендокрином трансдиференцијацијом рака простате.
Fig. 1 | Comparative analysis of STEAP1 and PSMA in lethal, metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). a Characteristics of the mCRPC tissues represented on University of Washington Tissue Acquisition Necropsy Tissue Microarray 92 (UW TAN TMA92). b Contingency table showing the frequency of mCRPC tissues with STEAP1 or PSMA IHC staining above or below an H-score threshold of 30. Micrographs of select mCRPC tissues after STEAP1 and PSMA IHC staining to highlight the (c) absence of PSMA but the presence of STEAP1 expression and (d) intratumoral heterogeneity of PSMA expression but not STEAP1. Scale bars = 50 µm. For panels (c, d) n = 332 mCRPC cores were immunostained for STEAP1 and PSMA. e Dot and box plot showing the distribution of STEAP1 (top) and PSMA (bottom) H-scores in 44 patients from the UW TAN TMA92 cohort. Each dot represents a tumor specimen/core (n = 319 cores for PSMA and 333 cores for STEAP1) and the color indicates the molecular subtype: AR+/SYP+ (red), AR+/SYP− (green), AR−/SYP+ (yellow) and AR−/SYP− (purple). Gray rectangles show interquartile ranges spanning the 25th to the 75th percentiles of PSMA H-scores from each patient. Bar plots (on the right) summarize the frequencies of patients classified based on STEAP1 and PSMA expression as no expression (all cores with H-score ≤30, light grey), heterogeneous expression (at least one core with H-score ≤30 and H-score >30, mid grey) and high expression (all cores with H-scores >30, тамно сива). Изворни подаци се налазе у датотеци изворних података.
Девелизбор моћног, антиген специфичног СТЕАП1 ЦАР
С обзиром на широко распрострањену експресију СТЕАП1 у мЦРПЦ у касној фази и његову пријављену функционалну улогу у прогресији рака27,36,37, затим смо почели да конструишемо лентивирусни СТЕАП1-специфичан ЦАР друге генерације. Користили смо пЦЦЛ-ц-МНДУ3-Кс лентивирусну кичму38 која се широко користила за генску терапију хематопоетских матичних ћелија39 и показало се да је експресија ЦАР у Т ћелијама коју покреће унутрашњи МНДУ3 промотор већа од оне која се постиже са ЕФС промотер40. Костимулаторни домен 4-1ББ је фаворизован због његове повезаности са формирањем меморије Т ћелија и продуженом перзистенцијом41 и уведен је ЦД28 трансмембрански домен јер се показало да смањује праг антигена за другу генерацију 4-1ББ Активација ЦАР Т ћелија42. Укључили смо потпуно хуманизовани сцФв изведен из вандор тузумаб ведотина, АДЦ који циља на СТЕАП1 чији је развој прекинут након клиничког испитивања фазе И28. Овај сцФв је хуманизована варијанта мишјег моноклонског антитела (мАб 120.545) које је првобитно развила компанија Агенсис, Инц. која показује афинитет од 1 нМ у тестовима везивања заснованим на ћелијама43. Да бисмо потенцијално подесили ЦАР активност, применили смо три различите дужине шарке/одстојника укључујући кратку (ИгГ4 шарка), средњу (ИгГ4 шарка-ЦХ3) и дугачку (ИгГ4 шарка-ЦХ2- ЦХ3). Дуги размакник је конструисан са претходно описаним 4/2- НК мутацијама44 у ЦХ2 домену да би се спречило везивање Фц-гама рецептора и ћелијска смрт изазвана активацијом која се јавља са адаптивним трансфером ЦАР Т ћелија дугог размака у имунодефицијентне мишеве. Три кандидата ЦАР су клонирана у лентивирусни вектор (слика 2а) који такође ко-експресује скраћени рецептор епидермалног фактора раста (ЕГФРт) као трансдукциони маркер. Лентивируси су генерисани и коришћени за трансдукцију хуманих ЦД4 и ЦД8 Т ћелија обогаћених из мононуклеарних ћелија периферне крви хуманих донора (ПБМЦ) сакупљених из ферезе. Проширене ЦД4 и ЦД8 ЦАР Т ћелије су имунофенотипизоване (допунска слика 3а) и реконституисане у ћелијске производе дефинисаног састава са нормалним ЦД4/ЦД8 односом да би се процениле њихове функционалне активности. Да бисмо контролисали експресију СТЕАП1 на изогени начин, фокусирали смо се на ћелијску линију хуманог рака простате 22Рв1 која показује нативну експресију СТЕАП1 и извели СТЕАП1 нокаут (ко) помоћу ЦРИСПР/Цас9 уређивања генома. Затим смо генерисали СТЕАП1 линију за спасавање од 22Рв1 СТЕАП1 ко трансдукцијом са СТЕАП1 експримирајућим лентивирусом (слика 2б). Ове линије су затим коришћене за скрининг три кратке, средње и дугачке размакнице СТЕАП1 ЦАР Т ћелије у тестовима ко-културе са очитавањем ослобађања интерферона-гама (ИФН-) као индикатора активације Т ћелија. Само дугачке СТЕАП1 ЦАР Т ћелије (у даљем тексту СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелије) показале су очекивани антиген-специфичан образац ослобађања ИФН-а, док кратке и средње СТЕАП1 ЦАР Т ћелије нису (Слика 2ц , Додатна слика 3б, ц). Даље, СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелије показале су значајну цитолизу 22Рв1 ћелија зависну од дозе у поређењу са нетрансдукованим Т ћелијама (слика 2д) и показале су релативно поштеду 22Рв1 СТЕАП1 ко ћелија (слика 2е). Сличне студије су затим спроведене у ћелијској линији хуманог рака простате ДУ145 којој недостаје нативна експресија СТЕАП1, али је конструисана да експресује СТЕАП1 (ДУ145 СТЕАП1) лентивирусном трансдукцијом (додатна слика 4а). У овом окружењу, активација СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија примећена је само у кокултурама са ДУ145 СТЕАП1 ћелијама, а не и родитељским ћелијама ДУ145 (додатна слика 4б). Цитолитичка активност је цењена само са СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијама, а не са нетрансдукованим Т ћелијама у ко-културама са ДУ145 СТЕАП1 ћелијама (додатна слика 4ц). Након тога смо анализирали већи панел хуманих ћелијских линија рака простате да бисмо окарактерисали њихову нативну експресију СТЕАП1 имуноблот анализом. Ћелијске линије са познатом АР експресијом/активношћу (ЛНЦаП, 22Рв1, ВЦаП и ЛНЦаП95) показале су различите нивое експресије СТЕАП1, док се чинило да АР-нулл ћелијске линије (ПЦ3, ДУ145, МСКЦЦ ЕФ1 и НЦИ-Х660) нису експримирали детективни нивои СТЕАП1 (слика 2ф). Наставили смо да изводимо ко-културе СТЕАП1-ББζ ЦАР Т са овим линијама да бисмо даље потврдили њихову антиген-специфичну активацију на основу ослобађања ИФН-а (слика 2г). Међутим, приметили смо нескладан налаз да је линија ПЦ3, која није показала очигледну експресију протеина СТЕАП1 (слика 2ф), изазвала значајну активацију СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија. Претходна литература је сугерисала да је СТЕАП1 експримиран у ћелијској линији ПЦ3 на ниским нивоима45. Заиста, продужено излагање имуноблоту открило је траку која указује на присуство веома ниске експресије СТЕАП1 (слика 2х). Да бисмо потврдили да ли је активација СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија последица ове мање експресије СТЕАП1 у ПЦ3 ћелијама, генерисали смо три ПЦ3 СТЕАП1 ко подлиније (слика 2х) и поново извршили ко-културе са СТЕАП{{133} }ББζ ЦАР Т ћелије. СТЕАП1 ко у линији ПЦ3 довео је до укидања СТЕАП1-ББζ активације ЦАР Т ћелија (слика 2и), додатно потврђујући специфичност и пружајући доказе о осетљивости СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија на ниске услови густине антигена.
Недостатак унакрсне реактивности СТЕАП1-ББζ ЦАР са мишем Стеап1 и људским СТЕАП1Б
бенефиције додатка цистанцхе-повећавају имунитет
У складу са анти-хуманом специфичношћу вандор тузумаб ведотина, СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелије нису показале унакрсну реактивност са мишјим Стеап1 (додатна слика 4а, д, е). Међутим, искористили смо ово као прилику да индивидуално реконституишемо три хумана СТЕАП1 ванћелијска домена (ЕЦД) на Стеап1 миша (додатна слика 4ф) да бисмо утврдили који су ЕЦД-ови критични за препознавање епитопа од стране СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија. Експерименти ко-културе су изведени са СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијама и ДУ145 ћелијама које су конструисане да експримирају мишји Стеап1 са индивидуалном заменом мишјих ЕЦД са људским ЕЦД. Открили смо да је људски СТЕАП1 ЕЦД2, али не и ЕЦД1 или ЕЦД3, повезан са активацијом СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија (додатна слика 4г). Занимљиво је да су људски СТЕАП1 и миш Стеап1 ЕЦД2 показали хомологију од 93,9% (31/33 аминокиселине) (додатна слика 4х), што указује да су К198 и/или И209 људског СТЕАП1 кључни за продуктивно препознавање од стране СТЕАП1-} ЦАР Т ћелије. Показало се да К198 ступа у интеракцију са Фаб од 120.545 као део жаришта интеракције засноване на недавној структури решеној криогеном електронском микроскропијом22. Од људске СТЕАП породице протеина, СТЕАП1Б има највећу хомологију са СТЕАП145. Идентификована су три СТЕАП1Б транскрипта, од којих сви показују потпуну конзервацију аминокиселинске секвенце хуманог СТЕАП1 ЕЦД2 (додатна слика 5а). Алгоритам за предвиђање топологије мембране консензуса ТОПЦОНС46 је предвидео да су секвенце ЕЦД2 домена ванћелијске у три изоформе протеина СТЕАП1Б (допунска слика 5б), иако са резултатима ниске поузданости за СТЕАП1Б у поређењу са хСТЕАП1 због недостатка консензуса између пет врхунских модела предвиђања (ХОБОТНИЦА, Пхилиус, ПолиФобиус, СЦАМПИ и СПОЦТОПУС) које користи ТОПЦОНС (додатна слика 5ц). Претходна анализа коришћењем другог алата за предвиђање топологије заснованог на Марковљевом моделу, ТМХММ47, такође је сугерисала да би ова секвенца могла бити интрацелуларна, а не екстрацелуларна у изоформама 1 и 245 протеина СТЕАП1Б. Међутим, кристална структура СТЕАП1Б још увек није утврђена да директно поткрепи ова предвиђања. Да бисмо функционално проценили да ли СТЕАП1- ББζ ЦАР Т ћелије такође могу бити реактивне против СТЕАП1Б, извели смо ко-културе користећи ДУ145 линије пројектоване да експримирају сваку од три изоформе СТЕАП1Б. Нисмо идентификовали доказе о СТЕАП1-ББζ активацији ЦАР Т ћелија (додатна слика 5д), што сугерише да епитоп СТЕАП1 који препознаје СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелије можда неће бити представљен као део ектодомена од СТЕАП1Б упркос очигледној хомологији секвенце.
Слика 2|Скрининг друге генерације 4-1ББ химерних антигенских рецептора (ЦАР) да би се идентификовао водећи за СТЕАП1 ЦАР Т ћелијску терапију. а Шема лентивирусне СТЕАП1 ЦАР конструкције и варијације засноване на кратким, средњим и дугим одстојницима. ЛТР дуго терминално понављање, МНДУ3 Молонеи У3 регион вируса мишје леукемије, сцФв једноланчани варијабилни фрагмент, ВЛ варијабилни лаки ланац, ВХ варијабилни тешки ланац, тм трансмембрана, ЕГФРт скраћени рецептор епидермалног фактора раста, 4/2 НК {{1{{28 }}}} Мутације ЦХ2 домена за спречавање везивања за Фц-гама рецепторе. б Имуноблотови СТЕАП1 у родитељским ћелијама 22Рв1, СТЕАП1 кноцкоут (ко) ћелијама и СТЕАП1 ко ћелијама са спасавањем СТЕАП1. ц ИФН-ензимски имуносорбентни тест (ЕЛИСА) резултат је ко-култура или нетрансдукованих Т ћелија или СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија са сваком од 22Рв1 подлинија у односу 1:1 на 24 х (п < 0.001). Релативна виталност ћелија (д) 22Рв1 и (е) 22Рв1 СТЕАП1 ко циљних ћелија током времена мерена флуоресценцијом живих ћелија након ко-културе са (лево) СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијама (п < 0,001) или ( десно) нетрансдуковане Т ћелије са променљивим односом ефектор-циља (Е:Т) ћелија. ф Имуноблотови који показују експресију СТЕАП1 у људским ћелијским линијама рака простате позитивних на андрогени рецептор (АР), али не и у АР-негативним ћелијским линијама рака простате. г ИФН- квантификација помоћу ЕЛИСА из ко-култура било нетрансдукованих Т ћелија или СТЕАП1- ББζ ЦАР Т ћелија са сваком од ћелијских линија хуманог рака простате у (ф) у односу 1:1 у 24 х. х Имуноблотови за СТЕАП1 у подлинијама 22Рв1, ПЦ3 и ПЦ3 СТЕАП1 ко. И ИФН- квантификација помоћу ЕЛИСА из ко-култура било нетрансдукованих Т ћелија или СТЕАП1- ББζ ЦАР Т ћелија са сваком ћелијском линијом у (х) у односу 1:1 на 24 х (п < 0,001). За панеле (ц–е, г и и) коришћено је н=4 биолошких реплика по стању, а траке грешака представљају средњу вредност са СЕМ. Панел (б, ф, х) приказује резултате репрезентативне за н=3 биолошких реплика. ГАПДХ је коришћен као контрола пуњења протеина. За панеле (ц) и (и), коришћена је двосмерна АНОВА са Сидаковим тестовима вишеструког поређења. За панеле (д) и (е), коришћена је двосмерна АНОВА са Тукеијевим тестом вишеструких поређења. Изворни подаци се налазе у датотеци изворних података.
Карактеризација производа СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија код низа донатора
Затим смо профилисали експанзију, ефикасност трансдукције и имунофенотип производа СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија користећи три независна сета мононуклеарних ћелија периферне крви (ПБМЦ) прикупљених од здравих донатора. Генерално смо приметили 20- до 40-путу експанзију СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија у року од 11 дана културе (допунска слика 6а). Проценат ЕГФРт+ ЦД8 Т ћелија кретао се од 24,3 до 54,2% док је проценат ЕГФРт+ ЦД4 Т ћелија био већи и кретао се од 60,1 до 74,9% у нашим СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијским производима (додатна слика 6б). Испитивали смо експресију маркера исцрпљености Т ћелија ПД-1 и ЛАГ-3 у подскуповима нетрансдукованих и СТЕАП1- ББζ ЦАР Т ћелија и нисмо приметили значајно повећање експресије (додатна слика 6ц ). Овај налаз сугерише ниску или одсутан тоничну сигнализацију од стране СТЕАП1-ББζ ЦАР, што је било охрабрујуће јер конститутивна ЦАР сигнализација може негативно утицати на функцију ефектора ЦАР Т ћелија48. Фенотипови Т ћелија меморије матичних ћелија (Тсцм) и Т ћелија централне меморије (ТЦМ) су повезани са терапијском ефикасношћу терапије ЦАР Т ћелијама јер промовишу трајну пролиферацију и перзистентност ин виво49–51. Имунофенотипизација нетрансдукованих и СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија показала је веће фреквенције Тсцм ћелија у поређењу са подскуповима Т ћелија у донорским ПБМЦ из којих су добијени ћелијски производи (додатна слика 6д). Овај ефекат је вероватно последица додавања ИЛ-7 и/или ИЛ-15 медијуму за експанзију Т ћелија пошто се показало да ови цитокини чувају и побољшавају диференцијацију Тсцм51,52. Наша анализа је такође открила обогаћивање Тцм популација, посебно у ЦД8 СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијама (додатна слика 6е).
СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелије показују значајне антитуморске ефекте у моделима дисеминованог рака простате са нативном експресијом СТЕАП1 установљеном код имунодефицијентних мишева
цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем
Као почетни екран за ин виво антитуморску активност, установили смо 22Рв1 субкутане туморе ксенографта код мужјака НОД сцид гама (НСГ) мишева. Када су тумори нарасли на приближно 100 мм3, мишеви су третирани једном интратуморалном ињекцијом било 5 × 106 нетрансдукованих Т ћелија или СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија. Интратуморски третман са СТЕАП1- ББζ ЦАР Т ћелијама био је повезан са значајном инхибицијом раста тумора која је била статистички значајна до 18. дана лечења (слика 3а). Мишеви су жртвовани 25. дана, а резидуални тумори код мишева третираних СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијама показали су велике површине некротичних остатака и региони одрживог тумора су инфилтрирани ЦД3+ СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелије (додатна слика 7а). Експресија СТЕАП1 је очувана у туморима у групама третмана (додатна слика 7б). Трансдуцирали смо 22Рв1 ћелије са лентивирусом да бисмо појачали експресију луциферазе кријеснице (Луц), а 106 22Рв1-фЛуц ћелије су убризгане у репне вене мужјака НСГ мишева. Метастатска колонизација је визуелизована живом биолуминисцентном сликом (БЛИ) након две недеље, када су мишеви третирани једном интравенском ињекцијом или 5 × 106 нетрансдукованих Т ћелија или СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија (слика 3б) . Серијски БЛИ је открио брзу прогресију болести код мишева лечених нетрансдукованим Т ћелијама, док су они који су примали СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелије показали значајно кашњење у прогресији тумора (слика 3ц, д) и продужење преживљавања (97 дана у односу на 31 дан , п=0.0018 тестом лог ранга, слика 3е). Није било значајне разлике у тежини миша између руку третмана (додатна слика 7ц). ИХЦ бојење тумора на крају студије показало је значајно смањење експресије СТЕАП1 (допунска слика 7д), што указује да је бекство антигена механизам резистенције. Међутим, мало је вероватно да је ово резултат трансдиференцијације у варијантно стање рака простате, јер нисмо ценили морфолошке промене, губитак експресије АР и ПСМА53 или повећање експресије СИП (додатна слика 7д). Да бисмо истражили глобални утицај губитка СТЕАП1 код рака простате, извршили смо профилисање транскриптома изогених 22Рв1 дивљег типа (вт), 22Рв1 СТЕАП1 ко и 22Рв1 СТЕАП1 ко + ћелијских линија за спасавање које смо претходно припремили (слика 2б). Диференцијална анализа експресије гена упоређујући 22Рв1 СТЕАП1 ко ћелије са 22Рв1 вт ћелијама идентификовала је ~1700 гена који су значајно смањени (ФДР мањи или једнак 0,05, вишеструка промена<2) with STEAP1 knockout. Rescue of STEAP1 expression in the 22Rv1 STEAP1 ko cells revealed that ~600 genes were significantly upregulated (FDR ≤ 0.05, fold-change>2) помоћу СТЕАП1 додатка (додатна слика 8а). Анализа обогаћивања скупа гена (ГСЕА) је номиновала неколико биолошких путева који могу бити дисрегулисани модулацијом експресије СТЕАП1. Истакнути међу њима били су прогресија ћелијског циклуса и вишеструки метаболички процеси, укључујући Кребов циклус и гликолизу, који су негативно обогаћени СТЕАП1 нокаутом и спасени након додавања СТЕАП1 (додатна слика 8б). Применили смо потврђени 31-потпис прогресије генског ћелијског циклуса (ЦЦП)54 на наше податке који су показали значајно смањење ЦЦП потписа повезаног са СТЕАП1 нокаутом са резултатом од −0.8 који се значајно повећао на {{ 14}}.5 са спасавањем СТЕАП1 експресије (додатна слика 8ц). Ови подаци су у складу са претходном публикацијом која указује да рушење СТЕАП1 у ћелијској линији ЛНЦаП рака простате нарушава виталност и пролиферацију ћелија док изазива апоптозу37. Такође смо приметили да је обрада и презентација антигена један од најзначајнијих де-обогаћених КЕГГ путева са СТЕАП1 нокаутом (додатна слика 8б). Приметили смо значајно смањење регулације гена укључујући ПСМЕ1 (подјединица активатора протеазома 1) која је члан имунопротеазомског комплекса, ТАП1 (транспортер 1, члан подфамилије касете за везивање АТП) који је критичан за главни комплекс хистокомпатибилности (МХЦ) класе И пептида- комплекс за пуњење и неколико гена МХЦ класе И и ИИ као што су МР1 (главни комплекс хистокомпатибилности, повезан са класом И), ХЛА-ДК-Б1 и ХЛА-ДКБ2 (додатна слика 8д). Даље смо истражили туморе прикупљене из 22Рв1 дисеминираних модела третираних СТЕАП1- ББζ ЦАР Т ћелијском терапијом која је показала губитак антигена (слика 3ц, додатна слика 7д) анализом транскриптома. Диференцијална анализа експресије гена и накнадни ГСЕА упоређујући 22Рв1 метастатске туморе код мишева лечених СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијском терапијом са онима који су лечени нетрансдукованим Т ћелијама показали су негативно обогаћивање путева укључених у МХЦ, цитотоксичне лимфоците и активацију Т ћелија ( Додатна слика 9а, б). Такође смо посебно проценили експресију гена МХЦ класе И и ИИ и приметили њихову изражену смањење регулације код 22Рв1 тумора лечених СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијском терапијом (додатна слика 9ц). Овај резултат је додатно поткријепљен значајним смањењем ХЛА-А, Б, Ц бојења ИХЦ-ом у овим туморима (додатна слика 9д). Потенцијална импликација ових података је да третман са СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијском терапијом и резултирајући губитак експресије СТЕАП1 туморског антигена код рака простате може довести до даље имунотерапијске резистенције кроз оштећену обраду и презентацију антигена. Такође смо инокулирали мужјаке НСГ мишева са Ц4-2Б-фЛуц ћелијама ињекцијом у репну вену. Ц4-2Б је подлинија ЛНЦаП55 отпорна на кастрацију са кинетиком раста која је више у складу са типичним раком простате. Четири недеље након ињекције, метастатска колонизација је потврђена БЛИ, а мишеви су лечени једном интравенском ињекцијом било 5 × 106 нетрансдукованих Т ћелија или СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија (слика 3б). Серијски БЛИ је показао потпун одговор код свих мишева који су примили СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелије у року од пет недеља од третмана (Слика 3ф, г). Идентификовали смо тренд повећаног губитка тежине у групи која је третирала нетрансдуковане Т-ћелије (допунска слика 10а), али то није било статистички значајно. Некропсија мишева третираних СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијама није показала никакву макроскопску болест и ек виво БЛИ органа није открио никакав сигнал (додатна слика 10б), што сугерише да су ови мишеви вероватно излечени. Идентификовали смо периферну постојаност СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија на крају експеримента на основу присуства ЦД3+ ЕГФРт+ спленоцита који се могу детектовати (слика 3х).
Слика 3|Ин виво антитуморска активност СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијске терапије у моделима рака простате са нативном експресијом СТЕАП1. а Обим 22Рв1 поткожних тумора код НСГ мишева (н=4 за нетрансдуковану групу Т ћелија и н=5 за групу СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија) током времена након једне интратуморалне ињекције од 5 × 106 нетрансдукованих Т ћелија или СТЕАП{{10}}ББζ ЦАР Т ћелија при нормалним ЦД4/ЦД8 односима. п < 0.0001 20. и 25. дана. Траке представљају средњу вредност са СЕМ. б Шема експеримената изазивања тумора за дисеминоване моделе 22Рв1 (горе) и Ц4-2Б (доле). Лук луцифераза свијећњака, БЛИ биолуминисценција. ц Серијски живи биолуминисцентни имиџ (БЛИ) НСГ мишева који су усађени са 22Рв1-фЛуц метастазама и третирани једном интравенском ињекцијом 5 × 106 нетрансдукованих Т ћелија или СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија на нормалном ЦД4/ Односи ЦД8 на дан 0. Црвени Кс означава угинуле мишеве. Приказана је скала сјаја. д Графикон који приказује квантификацију укупног флукса током времена из живог БЛИ сваког миша у (ц). е Каплан-Меиер криве преживљавања мишева у (ц) са статистичком значајношћу утврђеном лог-ранк (Мантел-Цок) тестом. За панеле (ц–е) коришћено је н=5 мишева по стању. ф Серијски живи БЛИ НСГ мишева усађених са Ц4-2Б метастазама и третираних једном интравенском ињекцијом 5 × 106 нетрансдукованих Т ћелија или СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија при нормалним ЦД4/ЦД8 односима на дан 0. Црвени Кс означава угинуле мишеве. Приказана је скала сјаја. г Графикон који приказује квантификацију укупног флукса током времена из живог БЛИ сваког миша у (ф). За панеле (ф, г) н=4 мишева је коришћено у групи нетрансдукованих Т ћелија и н=5 мишева у групи СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија. х Квантификација ЦД3+ ЕГФРт+ СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија проточном цитометријом из спленоцита мишева третираних са СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијама (н=4) на крају експеримента 49. дана. Цртице представљају средњу вредност. За панел (а), коришћена је двосмерна АНОВА са Сидаковим тестом вишеструког поређења. Изворни подаци се налазе у датотеци изворних података.
Студије СТЕАП1 ЦАР Т ћелија миша у мишу показују антитуморску терапијску ефикасност
Активација и цитолитичка активност СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија примећена у контексту веома ниске густине антигена СТЕАП1 (~1500 молекула/ћелији) ПЦ3 ћелијске линије (Слика 2г–и, Додатна слика 11а, б ) и докази ин виво антитуморске активности у дисеминованом ПЦ3-фЛуц моделу тумора (додатна слика 11ц–е) представили су забринутост у вези са потенцијалом токсичности ван тумора на мети. Да бисмо проценили потенцијалну токсичност у покретљивом моделном организму, генерисали смо хуманог СТЕАП1 кноцк-ин (хСТЕАП1-}КИ) миша у коме је људски СТЕАП1 ген убачен у локус мишјег Стеап1 гена на позадини Ц57Бл/6 ( Слика 4а). Колонија миша је успостављена генотипизацијом изведеном полимеразном ланчаном реакцијом (ПЦР) репне ДНК (слика 4б). И хомозиготни и хетерозиготни хСТЕАП1-КИ мишеви нису показали очигледне фенотипске или репродуктивне абнормалности у поређењу са дивљим типом легла. Истраживање ткива за експресију СТЕАП1 код људи засновано на ПЦР квантитативној реверзној транскрипцији (кРТ-ПЦР) обављено је на мушким и женским хетерозиготним хСТЕАП1-КИ (хСТЕАП1-КИ/ +) мишевима и открило највећу релативну експресију у простати, затим материца и надбубрежна жлезда (слика 4ц). Даља ин ситу анализа помоћу СТЕАП1 ИХЦ мушког хСТЕАП1-КИ/ + простате и надбубрежне жлезде открила је експресију хуманог СТЕАП1 ограничену на луминалне епителне ћелије простате (слика 4д) и експресију у кортексу надбубрежне жлезде (слика 4е) . Муринизована верзија СТЕАП1 ЦАР, названа СТЕАП1-мББζ ЦАР, у којој су сцФв и ИгГ4 шарка-ЦХ2-ЦХ3 одстојник задржани, али ЦД28 трансмембрански домен, 4-1ББ костимулаторни домен , а домен активације ЦД3ζ замењен је њиховим мишјим ортолозима је клониран у гамаретровирусни конструкт (слика 4ф). Поред тога, хумани ЕГФРт трансдукциони маркер је замењен скраћеним мишјим ЦД19 (мЦД19т) да би се потенцијална имуногеност свела на минимум. Потврдили смо ефикасну ретровирусну трансдукцију Т ћелија обогаћених из спленоцита миша (Слика 4г) и показали капацитет мишјих СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелија да индукују цитолизу РМ9 ћелијске линије рака простате56 дизајниране да експримирају хумани СТЕАП1 (РМ9- хСТЕАП1) лентивирусном трансдукцијом (слика 4х). Ефикасност мишјих СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелија ин виво потврђена је у дисеминованом РМ9-СТЕАП1-фЛуц моделу тумора код НСГ мишева (додатна слика 12а). Недељу дана након ињекције РМ9-СТЕАП1-фЛуц ћелија у репну вену, мишеви су третирани или са 5 × 106 нетрансдукованих Т ћелија миша или мишјим СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама ињекцијом у репну вену . Мишеви који су примили нетрансдуковане мишје Т ћелије показали су неконтролисану прогресију болести, док су они третирани СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама уједначено показивали брзу регресију болести коју је пратио каснији рецидив десет дана касније (додатна слика 12б, ц). СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијска терапија била је повезана са статистички значајном користи од преживљавања (22 дана наспрам 12 дана, п=0.0039 према лог-ранк тесту, додатна слика 12д). Губитак тежине је био очигледан у обе групе третмана како се оптерећење тумором повећало пре смрти (додатна слика 12е, ф). Анализа мишјих спленоцита прикупљених на некропсији показала је периферну перзистенцију СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелија са детекцијом мЦД3+ мЦД19т+ ћелија до 24 дана након адаптивног трансфера (додатна слика 12г). Плућа су сакупљена од мишева у обе групе третмана и СТЕАП1 ИХЦ је показао губитак експресије СТЕАП1 у плућним метастазама код мишева лечених СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама (додатна слика 12х). Касније смо проширили клонске РМ9-СТЕАП1-фЛуц линије да бисмо утврдили да ли уочени излазак туморског антигена може бити резултат већ постојеће хетерогености у експресији СТЕАП1. Експеримент је поновљен са клоналним, дисеминованим РМ9-СТЕАП1- фЛуц моделом тумора код НСГ мишева (додатна слика 13а). У овом контексту, мишеви третирани СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама показали су брз и трајан потпун одговор (додатна слика 13б-д). Ови налази наглашавају моћ СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелија у искорењивању СТЕАП1+ карцинома простате и даље сугеришу да могу бити потребне додатне терапијске стратегије за превазилажење резистенције у подгрупама пацијената са узнапредовалим раком простате где је хетерогеност СТЕАП1 експресија је присутна (сл. 1е).
цистанцхе користи за мушкарце - јача имунолошки систем
Кликните овде да видите производе Цистанцхе Енханце Иммунити
【Затражите више】 Е-пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Вхатс Апп: 0086 18599088692 / Вецхат: 18599088692
СТЕАП1 ЦАР Т ћелијска терапија је безбедна у хуманизованом моделу СТЕАП1 миша
Да бисмо истражили претклиничку безбедност и ефикасност терапије СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама, инокулисали смо мушке хетерозиготне хСТЕАП1-КИ мишеве са сингеним, неклонским РМ9-СТЕАП{{4} }фЛуц ћелије ињекцијом у репну вену (слика 5а). Након потврде метастатске колонизације од стране БЛИ око недељу дана касније, мишеви су примили циклофосфамид 100 мг/кг интраперитонеалном ињекцијом претходног кондиционирања57. Дан касније, мишеви су рандомизирани на третман или са 5 × 106 нетрансдукованих Т ћелија миша или мишјим СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама ињекцијом у репну вену. Сви мишеви који су примили мишје СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелије су показали смањење туморског оптерећења у току прве недеље од почетка лечења на основу БЛИ (Слика 5б, ц). Уочени одговор је био краткотрајан, али је довео до скромног продужења преживљавања (21 дан у односу на 12 дана, п=0.0138 према лог-ранк тесту, слика 5д) – слично налазима из неклонског РМ 9-СТЕАП1-фЛуц експерименти на НСГ мишевима (додатна слика 12д). Није било великих токсичности или превремених смрти посебно повезаних са мишјим СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијском терапијом на овом нивоу дозе где су уочени јасни докази антитуморске ефикасности. Губитак тежине је био повезан са повећаним оптерећењем тумора, али је био заједнички за обе групе лечења (Слика 5е, ф). Да би се даље проценила потенцијална токсичност терапије СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама, сличан експеримент је изведен паралелно код хетерозиготних хСТЕАП1-КИ мишева који носе РМ9-хСТЕАП1 туморе и без тумора. Мишеви који не носе тумор третирани нетрансдукованим Т ћелијама или СТЕАП1- мББζ ЦАР Т ћелијама нису показали никакве разлике у преживљавању (допунска слика 14а) или велику токсичност укључујући губитак телесне тежине (додатна слика 14б). Пошто се СТЕАП1-ББζ ЦАР састоји од модификованог ИгГ4 размакнице који би потенцијално могао бити имуноген, проценили смо одговор мишјих анти-хуманих антитела (МАХА) прикупљањем ретроорбиталних крварења од мишева у овом експерименту. У серуму мишева 8. дана након третмана са СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијама нису откривена анти-хумана ИгГ и ИгМ антитела (додатна слика 14ц).
Важно је да хетерозиготни хСТЕАП1-КИ мишеви третирани СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама нису показали очигледан поремећај ткива или повећану инфилтрацију ЦД3+ Т ћелија у простати (додатна слика 15а, б ) или надбубрежне жлезде (додатна слика 15ц, д) у односу на њихове колеге третиране нетрансдукованим Т ћелијама, што указује на одсуство токсичности ван тумора на мети. Плућа прикупљена на крају експеримента показала су хуману СТЕАП1 експресију у РМ9-хСТЕАП1 плућним метастазама са регионалном хетерогеношћу код мишева лечених нетрансдукованим Т ћелијама миша (Слика 5г). С друге стране, тумори мишева третираних мишјим СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама поново су показали одсуство људске експресије СТЕАП1 (слика 5х). Да бисмо проценили да ли терапија СТЕАП1- мББζ ЦАР Т ћелија код миша и губитак хуманог СТЕАП1 антигена такође могу утицати на презентацију антигена у РМ9-хСТЕАП1 туморима, извршили смо ИХЦ за мишји бета-2-микроглобулин (Б2м ) који је кључна компонента молекула МХЦ класе И. Приметили смо значајно смањење експресије Б2м у прогресивним туморима након третмана мишјим СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама у поређењу са нетрансдукованим Т ћелијама (допунска слика 15е, ф), у складу са нашим налазима у моделу 22Рв1.
Слика 4|Успостављање система миш у мишу са људским моделом миша за СТЕАП1 (хСТЕАП1-КИ) и муринизованим СТЕАП1 ЦАР. Шема која приказује стратегију хомологне рекомбинације користећи вектор циљања за убацивање људских СТЕАП1 ексона 2–5 у мишји Стеап1 локус на позадини Ц57Бл/6. ФРТ Флиппасе циљ препознавања. б Визуелизација ПЦР производа из генотипизације врха репа дивљег типа (+/+), хетерозиготних (КИ/+) или хомозиготних (КИ/КИ) мишева користећи парове прајмера намењених за амплификацију делова дивљег типа или хСТЕАП1-КИ алела . НТЦ нулта контрола шаблона. Репрезентативна слика гела из н=3 биолошки независних експеримената. ц кПЦР за хуману СТЕАП1 експресију нормализовану на експресију 18 С у прегледу ткива хСТЕАП1-КИ/+ мишева. н=3 за органе специфичне за пол и н=6 за заједничке органе. Траке представљају средњу вредност са СЕМ. Микрофотографије СТЕАП1 ИХЦ бојења (д) ткива простате од (лево) +/+ и (десно) КИ/+ мишева и (е) надбубрежне жлезде КИ/+ миша. Скала траке=50 µм. За панел (д, е) СТЕАП1 имунобојење је изведено на н=3 биолошки независних узорака. ф Шема ретровирусне муринизоване СТЕАП1 ЦАР конструкције. МуЛВ вирус леукемије миша, мЦД19т мишји скраћени ЦД19. г Квантификација ефикасности ретровирусне трансдукције активираних Т ћелија миша из три независна експеримента заснована на учесталости ЦД3+ ЦД19т+ ћелија миша помоћу проточне цитометрије (п {{40}}.0003). х Релативна ћелијска одрживост циљних ћелија РМ9 или РМ9-хСТЕАП1 током времена мерена флуоресцентним снимањем живих ћелија након ко-културе у односу 1:1 са мишјим СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама или нетрансдукованим Т ћелијама (п < 0,0001). н=4 биолошких реплика по стању. Траке грешака представљају средњу вредност са СЕМ. За панел (г), коришћен је неупарени двострани Студентов т-тест са Велчовом корекцијом. На панелу (х), коришћена је двосмерна АНОВА са Сидаковим тестом вишеструког поређења. Изворни подаци се налазе у датотеци изворних података.
5|Одређивање ефикасности и безбедности мишјих СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелија код хСТЕАП1-КИ мишева који носе сингени, дисеминовани рак простате.
Домен који се везује за колаген-ИЛ-12 фузиони цитокин изазива антитуморске одговоре кроз појачану сигнализацију рецептора Т ћелија и презентацију антигена
ИЛ{{0}} је хетеродимерни цитокин који се састоји од п40 и п35 подјединица који регулише одговоре Т ћелија и доводи до производње ИФН-. Упечатљиви антитуморски одговори повезани са системском администрацијом ИЛ-12 демонстрирани су у неколико претклиничких модела58,59, али је превођење овог терапијског приступа у клинику застало због токсичности и неефикасности која ограничава дозу60–63. Алтернативне стратегије да се заобиђу ови проблеми имају за циљ локализацију ИЛ{{10}} на туморе, било кроз интратуморско испоруку или инжењеринг ИЛ-12 фузионих протеина да би се искористиле јединствене особине туморског микроокружења. Један недавно описан приступ је фузија са доменом вон Виллебранд фактора А3 који служи као домен за везивање колагена (ЦБД, слика 6а) и омогућава везивање фузионих протеина за изложени колаген у поремећеној туморској васкулатури64. Показало се да системска ЦБД-ИЛ-12 терапија преобликује туморско микроокружење имунолошки „хладних“ модела рака дојке код миша и меланома кроз побољшану ИФН-сигнализацију и да сарађује са анти-ПД{{20}} инхибиција имунолошке контролне тачке да би се индуковала ерадикација тумора65. Питали смо да ли ЦБД-ИЛ-12 може бити ефикасан у претварању рака простате из „хладног“ у „вруће“ и изазивању антитуморских одговора. Поткожни, сингени РМ9 и Миц-ЦаП тумори су установљени код мужјака Ц57Бл/6 и ФВБ мишева, респективно, а мишеви су рандомизирани на третман са носачем, анти-ПД-1 или ЦБД-ИЛ-12 . Системска примена ЦБД-ИЛ-12 изазвала је значајну инхибицију раста тумора и у сингеним моделима РМ9 и Миц-ЦаП тумора који су иначе слабо реаговали на анти-ПД-1 терапију (слика 6б, додатна слика 16а) . Да бисмо стекли даљи увид у механизме деловања ЦБД-ИЛ-12, извршили смо једноћелијску РНА-сек (сцРНА-сек) анализу РМ9 тумора код мишева лечених или носачем или ЦБДИЛ-12. Графичке апроксимације и пројекције униформног вишеструког дијаграма откриле су значајно смањење одељења епитела тумора, фибробласта и ендотелних ћелија (допунска слика 16б) у складу са антитуморском активношћу. Профилисање на основу маркера подскупова урођених и адаптивних имуних ћелија (слика 6ц,д) у сцРНА-сек подацима је идентификовало значајно повећање ЦД8+ Т ћелија (7,55 наспрам 0,76%) , ћелије које унакрсно представљају антиген укључујући КСЦР1+ ИРФ8+ конвенционалне дендритске ћелије типа 1 (цДЦ1, 1,33 наспрам 0%), ЦД86+ ИНОС2+ М1 поларизоване макрофаге ( 2,26 према 0%) и ЦД64+ Ф4/ 80+ моноцити/макрофаги (29,2 наспрам 4,43%) код тумора из групе која је третирана ЦБДИЛ-12 у поређењу са контролном групом са носачем. Смањење имуносупресивних ЦД163+ ЦД206+ М2 поларизованих макрофага (0 према 0,25%) и Ли6Г+ неутрофила (0,52 наспрам 1,08%) је такође повезано са терапијом ЦБД-ИЛ-12. ИХЦ анализа је потврдила да тумори РМ9 третирани носачем генерално немају ЦД8+ Т ћелије, док су они третирани ЦБД-ИЛ-12 показали видљиво значајну инфилтрацију ЦД8+ Т ћелија (додатна слика 16ц) . Туморске ћелије су показале обогаћену експресију протеазомских и имунопротеазомских подјединица Псмб8 и Псмб9 и гена Х2-К1, Х2-Д1 и Б2м главног комплекса хистокомпатибилности класе И (МХЦ И), у складу са појачаном регулацијом обраде антигена и машине за презентацију (слика 6е, додатна слика 16д). Паралелно, Т ћелије су показале појачану експресију гена повезану са сигнализацијом рецептора Т ћелија и имунорегулаторним интеракцијама између лимфоидне и нелимфоидне ћелије (слика 6ф, додатна слика 16е). Ћелије мононуклеарног фагоцитног система (МПС) показале су обогаћену експресију гена у вези са процесирањем антигена и унакрсном презентацијом, као и сигнализацијом цитокина (додатна слика 16ф, г). Ове студије су утврдиле антитуморску активност ЦБД-ИЛ- 12 на моделима рака простате кроз репрограмирање микроокружења тумора и ангажовање и урођеног и адаптивног имунолошког система.
Побољшана контрола тумора уз истовремену терапију СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама и ЦБД-ИЛ-12
Следеће смо претпоставили да би проширење антитуморског имуног одговора са ЦБД-ИЛ-12 терапијом могло побољшати терапијску ефикасност СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијске терапије код рака простате борбом против хетерогености туморских антигена и спасавањем обраде антигена и презентација. Стога смо установили сингене, неклонске РМ9-СТЕАП1-фЛуц метастазе код мушких хетерозиготних хСТЕАП1-КИ мишева и рандомизирани на третман са било 5 × 106 нетрансдуковане мишје Т ћелије или мишје СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелије ињекцијом у репну вену са или без недељне терапије ЦБД-ИЛ-12 ињекцијом у ретроорбитални синус. Групе које су примале терапију ЦБД-ИЛ-12 саму или у комбинацији са СТЕАП1-мББζ ЦАР Т терапијом нису примале циклофосфамид који исцрпљује лимфу (слика 7а). Серијски БЛИ је открио брзу прогресију болести код мишева лечених нетрансдукованим Т ћелијама и ЦБД-ИЛ-12, док су они који су примали СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелије у комбинацији са ЦБД-ИЛ-12 терапијом показали значајну кашњење у прогресији тумора (слика 7б, ц). Важно је да је комбиновано лечење мишјим СТЕАП1- мББζ ЦАР Т ћелијама и недељним ЦБД-ИЛ-12 повезано са статистички значајним продужењем укупног преживљавања у поређењу са свим другим групама за лечење (слика 7д). Анализа цитокина у плазми на ретроорбиталним крварењима прикупљеним на дан 0 и дан 8 третмана показала је значајно повећање нивоа проинфламаторних цитокина ИФН-, ТНФ-, ИЛ-6 и ИЛ-4 (слика 7е, додатна слика 17) код мишева третираних СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама и ЦБД-ИЛ-12. Резидуални тумори су сакупљени на некропсији и СТЕАП1 ИХЦ је показао губитак антигена код тумора код мишева лечених и са СТЕАП1- мББζ ЦАР Т ћелијама самим иу комбинацији са ЦБД-ИЛ-12 (слика 8а). Поред тога, приметили смо повећање експресије тумора Б2м (слика 8а) повезано са терапијом ЦБД-ИЛ-12. ЦД3+ Т ћелије су такође повећане (слика 8б) у туморским стањима подвргнутим терапији ИЛ-12, али, иако је тренд био цењен, нисмо пронашли статистички значајно повећање интратуморалних Т ћелија између СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелија и комбиноване СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелије и ЦБД-ИЛ-12 групе третмана. Резидуални тумори укључујући и оне од мишева третираних комбинованом СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама и ЦБД-ИЛ-12 прикупљеним при максималном одговору на лечење (надир) 10. дана и на крајњим тачкама саосећања за прогресију тумора (релапс) су дисоциране на појединачне ћелије и подскупине имуних ћелија су окарактерисане мултипараметријском проточном цитометријом (додатна слика 18). У складу са нашим сцРНА-сек резултатима, третман ЦБД-ИЛ-12 самим или у комбинацији са СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама довео је до значајног повећања ЦД11б+ Ли6Ц-/+Ф4/{{68 }} МХЦ-ИИ+ макрофаги (слика 8ц, д, додатна слика 19а). ЦД11б+ Ли6ЦФ4/80+ МХЦ-ИИ+ ћелије представљају зреле макрофаге који представљају антиген66 и ова популација је првенствено обогаћена и показала повећану експресију индуковане синтазе азот оксида (иНОС) као маркера проинфламаторне М1 поларизације са ЦБД-ИЛ{{84} } терапија. Такође смо приметили проширење популације цДЦ1 и смањење популације конвенционалних дендритских ћелија типа 2 (цДЦ2) (слика 8е, додатна слика 19б). цДЦ1 је умешан у активацију антитуморских цитотоксичних ЦД8+ Т ћелија и потенцијалне механизме терапијске резистенције. Нисмо пронашли знаке миграције ћелија у тумор док су цДЦ2 важни за активацију значајне разлике у односима КЛРГ1+ и КЛРГ1- природног убице ЦД4+ Т ћелија укључујући Трегс67 . У складу са налазима цДЦ2, ћелије у групама третмана (додатна слика 19д). Профилисање фреквенција ЦД4+ ФОКСП3+ Трег-ова је открило смањење Трегс-а као и Ф40/80+ СиглецФ+ еозинофили су повећани док је Ли6Г+ неуциран ЦБД-ИЛ-12 терапијом (додатни Слика 19ц). Од интереса, трофили су смањени додатком ЦБД-ИЛ-12 у СТЕАП1- приметили смо да код релапсних тумора после комбиноване терапије СТЕАП1-мББζ мББζ ЦАР Т ћелија (Слика 8ф, г). Приметно је да је у учесталости ових ЦАР Т ћелија и ЦБД-ИЛ-12 терапије дошло до смањења цДЦ1, а неутрофили повезани са тумором су повећани са лечењем са повећањем Трегс-а, што имплицира смањено пуњење цитотоксичног ЦД8 СТЕАП{{120 }}мББζ ЦАР Т ћелије у поређењу са нетрансдукованим Т ћелијама (54 у односу на Т ћелије и обогаћивање имуносупресивне Трег сигнализације за 34%), смањене у условима са ЦБД-ИЛ-12 терапијом, али повећане након релапса тумора након комбинованог СТЕАП-а 1-мББζ ЦАР Т ћелија и ЦБД-ИЛ-12 терапија (19 до 42%). Ови налази сугеришу да имуносупресивна својства неутрофила повезаних са тумором могу играти истакнуту улогу у посредовању резистенције на третман и прогресије тумора. Све у свему, ове анализе указују на то да третман ЦБД-ИЛ-12 враћа непријатељски имуносупресивни туморски миље у проинфламаторно стање и проширује антитуморско деловање у комбинацији са терапијом СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама која је усвојена. Даље смо извршили анализу ТЦР репертоара коришћењем мултиплексног секвенцирања бета ланца ТЦР бета ланца заснованог на ПЦР-у68 на туморима који носе плућа прикупљеним из сваке групе третмана на обдукцији. Приметили смо значајно смањење Симпсонове клоналности у узорцима мишева лечених само ЦБД-ИЛ-12 и у комбинацији са СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијском терапијом, што је индикативно за повећану интратуморалну разноликост Т ћелија (Сл. 8х). Ови налази показују да додавање ЦБД-ИЛ-12 као додатка СТЕАП1 ЦАР Т ћелијској терапији може бити корисно кроз ремоделирање микроокружења тумора рака простате, побољшање обраде и презентације антигена и ангажовање имунитета домаћина ради промовисања ширења епитопа.
Слика 6|Системска терапија фузијом цитокина ИЛ-12 (ЦБД-ИЛ-12) домена који везује колаген инхибира раст тумора рака простате и репрограмира имунолошко микроокружење тумора. Шема ЦБД-ИЛ-12, састављена од п35 и п40 подјединица спојених са ЦБД из домена вон Виллебранд фактора А3. б Количина РМ9 поткожних тумора код сингених Ц57Бл/6 мишева током времена уз третман са вехикулумом, анти-ПД-1 (клон 29 Ф.1А12) 200 Μг интраперитонеалном ињекцијом сваких 5 дана, или ЦБД-ИЛ-12 25 Μг интравенском ињекцијом сваких 5 дана почевши од дана 0. н=7 мишева у вехикулу и групама третираним ЦБД-ИЛ-12 и н=8 мишева у анти - ПД1 третирана група. п < 0,0001 9. и 12. дана. Траке представљају средњу вредност са СЕМ. П-вредности су изведене из двосмерне АНОВА са Дунеттовим тестом вишеструких поређења, нс није значајно. ц Уједначена вишеструка апроксимација и пројекција (УМАП) дијаграма различитих подскупова имуних ћелија (горе) из анализе једноћелијске РНА-сек (сцРНА-сек) пет РМ9 тумора агрегираних од мишева третираних носачем или ЦБД-ИЛ{{41} }. УМАП графикони обојени експресијом гена маркера специфичних за подскуп имуних ћелија за пан-моноците/макрофаге, М1 и М2 поларизоване макрофаге, конвенционалне дендритичке ћелије типа 1 (цДЦ1), природне ћелије убице (НК) и Т помоћне тип 1 (Тх1) ћелије. д Графике које приказују учесталост популација специфичних имуних ћелија (у односу на имуне ћелије ЦД{50}}) идентификованих сцРНА-сек анализом укључујући ЦД4+ и ЦД8+ Т ћелије, Тх1 (Инфг+ Тбк{ {56}}) и Тх2 (цМАФ+ Гата3+) ћелије, Ли6Ц+/− моноцити/макрофаги (Ли6Ц+/− Адгре1+), М1 макрофаги (ЦД80+ ЦД{{67} } ИНОС2+), М2 макрофаги (ЦД163+ Мрц1+ цМАФ+), цДЦ1 (КСЦР1+ ИРФ8+), конвенционалне дендритске ћелије типа 2 (цДЦ2 , ЦД1+ ИРФ4+), миграторне ЦД103+ дендритске ћелије (Итгае+), еозинофили (СиглецФ+), неутрофили (Ли6Г+) и НК ћелије (Клрб1ц+ Нцр1+) код тумора лечених носачем или ЦБДИЛ-12. Вулкански графикони који показују диференцијалну експресију гена у (е) туморским ћелијама и (ф) Т ћелијама из РМ9 тумора мишева третираних ЦБД-ИЛ-12 у односу на оне третиране вехикулом. ФЦ фолд промена, ФДР стопа лажног откривања. Изворни подаци се налазе у датотеци изворних података.
Дискусија
Ефикасност ЦАР Т ћелијске терапије и других циљаних терапеутика заснованих на имуности у великој мери зависи од доследне експресије антигена на свим или већини ћелија које чине популацију тумора унутар појединачног пацијента. Међутим, хетерогеност антигена је изражена код чврстих тумора укључујући рак простате, где су прогресија до мЦРПЦ и отпорност на лечење повезани са појавом дивергентних подтипова болести обележених различитим транскрипционим програмима-71 и експресијом антигена на површини ћелије. Док се ПСМА сматра једним од најважнијих биомаркера у карциному простате са значајном прекомерном експресијом која се налази у читавом спектру прогресије болести, наш рад потврђује налазе из недавне публикације14 који указују на то да је експресија ПСМА хетерогена у смртоносном мЦРПЦ. Показали смо да је СТЕАП1 шире изражен од ПСМА у овој поставци, али нипошто није једнако изражен на високим нивоима у свим мЦРПЦ ткивима. Ниједна терапија усмерена на антиген, укључујући терапију ЦАР Т ћелијама, можда неће моћи да превазиђе већ постојећу хетерогеност туморског антигена у мЦРПЦ. Стога је од критичне важности да се темељно акредитују додатни терапеутски циљеви као што је СТЕАП1 у мЦРПЦ који могу омогућити комбинаторне терапије које врше непремостиви терапеутски притисак. Ово укључује двоструко циљане антигенске терапије (нпр. ПСМА и СТЕАП1) ЦАР Т ћелијске терапије или мултимодалне стратегије које комбинују терапије ЦАР Т ћелија са АДЦ, Т-БсАбс или другим третманима који снажно промовишу антиген независно и зависно убијање тумора. Конструисали смо СТЕАП1-циљану ЦАР Т ћелијску терапију која је високо специфична за антиген и функционално локализовала епитоп који је ЦАР препознао на други ЕЦД СТЕАП1. Наше СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелије показују значајну антитуморску активност против вишеструких модела дисеминованог карцинома простате, како у студијама на човеку у мишу, тако иу студијама миш у мишу. Важно је да је наш СТЕАП1-ББζ ЦАР способан да индукује активацију Т ћелија и цитолизу циљних ћелија чак и у условима ниске густине антигена, што доказује реактивност на ПЦ3 модел рака простате. Међутим, ова осетљивост СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелија на ниске нивое експресије СТЕАП1 може бити корисна из перспективе повећања антитуморске ефикасности, али би такође могла да нагласи одговорности од токсичности ван тумора на мети. Системска експресија СТЕАП1 је раније пријављена као практично одсутна у нормалним људским ткивима18,72 осим у простати где је описана мембранска експресија у епителним ћелијама простате27. Да бисмо ушли у безбедност СТЕАП1-ББζЦАР Т ћелијске терапије у претклиничком окружењу, генерисали смо хуманизовани СТЕАП1 модел миша. Модел миша хСТЕАП1-КИ рекапитулирао је експресију хуманог СТЕАП1 у простатној жлезди и показао експресију у кортексу надбубрежне жлезде. Уверљиво, СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијска терапија у дози довољној да изазове антитуморско деловање није довела до очигледне системске токсичности код хСТЕАП1-КИ мишева, укључујући токсичност ван тумора на местима где се налази хумани СТЕАП1 израз. Понављајући механизам релапса и прогресије рака простате након терапије СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијама у нашим студијама био је бекство туморског антигена. С једне стране, овај налаз наглашава укупну моћ терапије СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијама. Међутим, нејасно је да ли је губитак експресије СТЕАП1 тумора искључиво последица инхерентне хетерогености туморског антигена или постоји и адаптивна смањење експресије СТЕАП1. Недавна публикација је показала да метилација промотера СТЕАП1 модулира експресију СТЕАП1 и епигенетску дерегулацију инхибицијом ДНК метилтрансферазе и хистон деацетилазе била довољна да значајно повећа експресију СТЕАП173. Третман епигенетским инхибиторима у комбинацији са СТЕАП1 ЦАР Т ћелијском терапијом могао би истовремено побољшати експресију СТЕАП1 тумора и репрограмирати ЦАР Т ћелије у повољна стања диференцијације отпорне на исцрпљеност74,75, чиме би се ублажио губитак туморског антигена и побољшала антитуморска ефикасност код рака простате. Наша студија такође имплицира да СТЕАП1 игра функционалну улогу у регулисању прогресије ћелијског циклуса и ћелијског метаболизма код рака простате. СТЕАП1 је јединствен од осталих чланова породице СТЕАП (СТЕАП2, 3 и 4) по томе што му недостаје интрацелуларни оксидоредуктазни домен22 који је неопходан за активност метало редуктазе. Као резултат тога, СТЕАП1 хомотримери, али не и хетеротримери са другим СТЕАП протеинима, немају ензимску функцију да редукују Фе3+ у Фе2+ и Цу2+ у Цу1+. Да ли и како учешће СТЕАП1 у металним јонима и ћелијском метаболизму промовише прогресију рака тек треба да се утврди и вреди даљег истраживања. Имунолошки 'хладно' туморско микроокружење рака простате главна је препрека ефикасности имунотерапије против рака. На пример, експлоративне студије повезане са клиничким испитивањем фазе И ПСМА ЦАР Т ћелијске терапије оклопљене да експримирају рецептор доминантно-негативног трансформишућег фактора раста (ТГФ Р-ДН) у мЦРПЦ су показале да се експресија имуносупресивних сигналних молекула у туморском микроокружењу повећава након инфузије ЦАР Т13. У нашим студијама, критични налаз је била повезаност између губитка експресије СТЕАП1 и смањења регулације обраде и презентације антигена, како у СТЕАП1 нокаут ћелијама, тако иу туморима губитка антигена СТЕАП1 након терапије СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијама. Према томе, губитак антигена СТЕАП1 код рака простате промовише не само директну резистенцију на терапију СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијама, већ такође може ограничити адаптивни антитуморски имунитет домаћина. Губитак експресије циљног антигена тумора и конверзија у имуносупресивније стање са повећаном инфилтрацијом Трегс-а и већом експресијом имуносупресивних молекула такође је примећен у фази И студије ЕГФР-вИИИ ЦАР Т ћелија код учесника са рекурентним глиобластомом76. Додатни рад ће бити неопходан да би се разумели функционални механизми који леже у основи губитка антигена СТЕАП1 и уопштено како динамички ефекти адоптивне терапије ЦАР Т ћелијама могу допринети губитку антигена и имуноедитовању модулацијом туморско-имуно-стромалних интеракција у солидним туморима.
Слика 7|Комбиновање ЦБД-ИЛ-12 са СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијском терапијом побољшава укупно преживљавање и нивое инфламаторних цитокина. Шема експеримента са изазивањем тумора за дисеминовани модел РМ9-хСТЕАП1 код хСТЕАП1-КИ/+ мишева који истражују комбинацију ЦБД-ИЛ-12 са СТЕАП{{1{{18} }}}мББζ ЦАР Т ћелијска терапија. Цициклофосфамид (за предкондиционирање). Креирано са БиоРендер.цом. б Серијски живи БЛИ од хСТЕАП1-КИ/ + мишева са усађеним РМ9-хСТЕАП1- фЛуц метастазама и третираних једном интравенском ињекцијом 5 × 106 мишева без трансдукције Т ћелије или СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелије на дан 0 са или без третмана ЦБД-ИЛ- 12 недељно. Црвени Кс означава угинуле мишеве. Приказана је скала зрачења. (ц) Графикон који приказује квантификацију укупног флукса током времена из живог БЛИ сваког миша у (б). д Каплан–Меиерове криве преживљавања мишева у (б) са статистичком значајношћу утврђеном лог-ранк (Мантел-Цок) тестом (п=0.002). е Графике које показују нивое серумских цитокина ИФН- (лево, п=0.002) и ТНФ- (десно, п < 0,0001) на основу ПроцартаПлек имунотеста из ретроорбиталног крварења хСТЕАП1-КИ/+ мишева ( н=4 мишева по групи) који носе РМ9-хСТЕАП1-фЛуц метастазе пре (дан 0) и после третмана (дан 8) са нетрансдукованим Т ћелијама миша или мишјим СТЕАП{{38} }мББζ ЦАР Т ћелије са или без терапије ЦБД-ИЛ-12. Трака грешке представља средњу вредност са СЕМ. За панел (е), п-вредности су изведене из двосмерне АНОВА са Сидаковим тестом вишеструких поређења. Изворни подаци се налазе у датотеци изворних података.
Фиг. 8|Комбиновањем ЦБД-ИЛ-12 са СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијском терапијом репрограмира се имунолошко микроокружење тумора и промовише презентација антигена и ширење епитопа. а Микрофотографије СТЕАП1 (горе), Б2м (средина) и ЦД3 (доле) ИХЦ бојења РМ9-хСТЕАП1 тумора плућа након третмана нетрансдукованим Т ћелијама миша или СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама са или без ЦБД-ИЛ-12 третмана. Скала траке=50 µм. б Графичка трака која приказује ИХЦ квантификацију ЦД3 позитивних ћелија које инфилтрирају метастатске туморе плућа (н=4 тумора по групи). Једносмерна АНОВА п=0.{{80}}021. Трака грешке представља средњу вредност са СД. Графикони који приказују фреквенције (ц) Ли6Ц− Ф4/{{20}} МХЦ-ИИ+ (лева, једносмерна АНОВА п=0.00{ {98}}5) и Ли6Ц − Ф4/80+ иНОС2+ (десно, једносмерна АНОВА п=0.0017) макрофаги, (д) Ли6Ц+ Ф4/ {{36} } МХЦ-ИИ+ (лево, једносмерна АНОВА п=0.0038) и Ли6Ц+ Ф4/80+ иНОС2+ (десно, једносмерна АНОВА п=нс) макрофаги, (е) ЦД11б+ КСЦР1+ цДЦ1 (једносмерна АНОВА п=0.0003), (ф) Ф4/80+ СиглецФ+ еозинофили (једносмерна АНОВА п=0. 0008), и (г) Ли6Г+ неутрофили (једносмерни АНОВА п=0.0035) нормализовани на укупне ЦД45+ ћелије као што је утврђено мултипараметријском проточном цитометријом након третмана са нетрансдукованим Т ћелијама, СТЕАП{{67 }}мББζ ЦАР Т ћелије, нетрансдуковане Т ћелије и ЦБД-ИЛ-12, и СТЕАП1- мББζ ЦАР Т ћелије и ЦБД-ИЛ-12 при максималном одговору на лечење (надир) и релапсу тумора (повраћај). х Графичке траке које представљају Симпсонову клоналност као меру 'уједначености' репертоара ТЦР анализираног ТЦРБ секвенцирањем на ћелијама које се инфилтрирају тумором прикупљеним од мишева у (а). н=4 тумора по групи. П-вредности за нетрансдуковане Т ћелије + ЦБД-ИЛ-12 у поређењу са нетрансдукованим Т ћелијама и СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама су 0,008 и 0,02, респективно; и СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелије + ЦБД-ИЛ-12 у поређењу са нетрансдукованим и СТЕАП1-мББζ ЦАР Т ћелијама су 0,004 и 0,01, респективно. Трака грешке представља средњу вредност са СД. За панеле (ц–г) н=3 тумора по групи, *п < 0,05; **п < 0,01, ***п < 0,001, п-вредности у панелима (б–х) су из једносмерне АНОВА са Дановим тестом вишеструких поређења. Изворни подаци се налазе у датотеци изворних података.
Да бисмо проширили антитуморски одговор, истражили смо системску примену ЦБД-ИЛ-12 у комбинацији са СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијском терапијом у дисеминованом, сингеничном РМ9-хСТЕАП1 моделу тумора у хСТЕАП 1-КИ мишеви за апроксимацију имуносупресивне природе мЦРПЦ-а на основу претходне карактеризације РМ9 као слабо имуногеног модела57,77. Ко-третман са ЦБД-ИЛ12 довео је до побољшања укупног преживљавања, производње цитокина, презентације туморског антигена и интратуморске разноликости Т ћелија у складу са ширењем епитопа. Блиско истраживање имунолошког микроокружења тумора открило је да додавање ЦБД-ИЛ-12 СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијској терапији индукује реверзију туморске строме и побољшава активиране макрофаге и цДЦ1 док смањује неутрофиле повезане са тумором. Међутим, излечење није постигнуто у нашим студијама, и ми истичемо потенцијалне компензационе, адаптивне механизме резистенције и прогресије тумора, укључујући повећане фреквенције имуносупресивних неутрофила и цДЦ2 који могу да промовишу индукцију Трег-а. Важно је напоменути да даља оптимизација дозе и распореда примене ЦБД-ИЛ-12 може бити потребна да би се максимизирали антитуморски одговори. Међутим, ови резултати подржавају истраживање комбинаторних имунотерапеутских приступа као што је оклоп ЦАР Т ћелија за експресију рекомбинантних цитокина78 (нпр. ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15 или ИЛ{{24 }}), истовремени третман са имуномодулаторима (нпр. анти-ПД-1/ПД-Л1 или анти-ЦТЛА4), или радиотерапијом усмереном на тумор за ремоделовање микроокружења тумора рака простате и побољшање ефекторске функције ЦАР Т ћелија. Док је овај рукопис био у припреми, студија групе у Норвешкој известила је о претклиничком развоју СТЕАП1 ЦАР Т ћелијске терапије са антитуморском активношћу у поткожном 22Рв1 моделу код имунокомпромитованих мишева79. Пријављени СТЕАП1 ЦАР се разликује од СТЕАП1-ББζ ЦАР јер укључује синтетички сцФв назван Осло1 и ЦД8 шарку и трансмембрански домен. Друга карактеристика диференцијације је да се СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелије припремају као дефинисани производ са нормалним односом ЦД4/ЦД8 Т ћелија док Осло1 СТЕАП1 ЦАР Т ћелије нису. Механизми резистенције и безбедносне студије у вези са Осло1 СТЕАП1 ЦАР Т ћелијском терапијом нису пријављени. Међутим, биће интересантно видети како ове разлике у ЦАР инжењерингу и саставу ћелијских производа могу утицати на антитуморску ефикасност, постојаност и безбедност као и Осло1 СТЕАП1 ЦАР Т ћелијска терапија и наша СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијска терапија програми се преводе на клинику. Налази наших студија довели су до партнерства са Програмом експерименталне терапије (НЕкТ) Националног института за рак (НЦИ) како би се СТЕАП1-ББζ ЦАР Т ћелијска терапија превела у прво испитивање на људима за мушкарце са мЦРПЦ. Сигнали о безбедности и ефикасности из овог клиничког испитивања у раној фази ће помоћи да се утврди да ли такође може бити корисно истраживање овог терапијског приступа за друге типове рака који високо експримирају СТЕАП1.
Референце
1. Сиегел, РЛ, Миллер, КД, Фуцхс, ХЕ & Јемал, А. Цанцер статистицс, 2022. ЦА: Цанцер Ј. Цлиницианс 72, 7–33 (2022).
2. Армстронг, АЈ ет ал. Предвиђање петогодишњег преживљавања и безбедносни исходи са ензалутамидом код мушкараца са метастатским карциномом простате отпорним на кастрацију који нису били на хемотерапији из испитивања ПРЕВАИЛ. ЕУР. Урол. 78, 347–357 (2020).
3. Физази, К. ет ал. Абиратерон плус преднизон код метастатског карцинома простате осетљивог на кастрацију. Н. Енгл. Ј. Мед. 377, 352–360 (2017).
4. Сцхер, ХИ ет ал. Повећано преживљавање са ензалутамидом код рака простате након хемотерапије. Н. Енгл. Ј. Мед. 367, 1187–1197 (2012).
5. Паркер, Ц. ет ал. Алфа емитер радијум-223 и преживљавање код метастатског карцинома простате. Н. Енгл. Ј. Мед. 369, 213–223 (2013).
6. Сартор, О. ет ал. Лутецијум-177–ПСМА-617 за рак простате отпоран на метастатску кастрацију. Н. Енгл. Ј. Мед. 385, 1091–1103 (2021).
7. Кантофф, ПВ ет ал. Сипулеуцел-Т имунотерапија за рак простате отпоран на кастрацију. Н. Енгл. Ј. Мед. 363, 411–422 (2010).
8. Јацксон, ХЈ, Рафик, С. & Брентјенс, РЈ Дривинг ЦАР Т-целлс напријед. Нат. Рев. Цлин. Онцол. 13, 370–383 (2016).
9. Веинер, ГЈ Изградња бољих терапија заснованих на моноклонским антителима. Нат. Рев. Цанцер 15, 361–370 (2015).
10. Цхавез, ЈЦ, Бацхмеиер, Ц. & Кхарфан-Дабаја, МА ЦАР Т-ћелијска терапија за Б-ћелијске лимфоме: резултати клиничког испитивања доступних производа. Тхерапеутиц Адв. Хематол. 10, 2040620719841581 (2019).
11. Стернер, РЦ & Стернер, РМ ЦАР-Т ћелијска терапија: тренутна ограничења и потенцијалне стратегије. Рак крви Ј. 11, 69 (2021).
12. Словин, СФ и др. Студија фазе 1 П-ПСМА-101 ЦАР-Т ћелија код пацијената са метастатским карциномом простате отпорним на кастрацију (мЦРПЦ). Ј. Цлин. Онцол. 40, 98–98 (2022).
13. Нараиан, В. ет ал. ПСМА циљане ТГФ-неосетљиве оклопне ЦАР Т ћелије у метастатском карциному простате отпорном на кастрацију: испитивање фазе 1. Нат. Мед. 28, 724–734 (2022).
14. Пасцхалис, А. ет ал. Хетерогеност мембранског антигена специфична за простату и дефекти поправке ДНК код рака простате. евро. Урол. 76, 469–478 (2019).
15. Цхен, Н., Ли, Кс., Цхинтала, НК, Тано, ЗЕ & Адусумилли, ПС Вожња аутомобила на неравном путу хетерогености антигена у солидним туморима. Цурр. Опин. Иммунол. 51, 103–110 (2018).
16. Морган, РА ет ал. Извештај о случају озбиљног нежељеног догађаја након примене Т ћелија трансдукованих химерним антигенским рецептором који препознаје ЕРББ2. Мол. Тхер. Џем. Соц. Гене Тхер. 18, 843–851 (2010).
17. Лее, ЈК ет ал. Системско површинско профилисање идентификује циљне антигене за терапију засновану на имуности код подтипова узнапредовалог рака простате. Проц. Натл. Акад. Сци. САД 115, Е4473–е4482 (2018).
18. Хуберт, РС и др. СТЕАП: антиген ћелијске површине специфичан за простату високо експримиран у хуманим туморима простате. Проц. Натл Ацад. Сци. УСА 96, 14523–14528 (1999).
19. Нолан-Стеваук, О. Апстракт ДДТ02-03: АМГ 509: Ново, хуманизовано, продужено полу-живот, биспецифично СТЕАП1 × ЦД3 Т ћелија које регрутује КсмАб® 2+1 антитело. Цанцер Рес. 80, ДДТ02-03-ДДТ02-03 (2020).
20. Груневалд, ТГ ет ал. Висока експресија СТЕАП1 повезана је са побољшаним исходима код пацијената са Евинговим саркомом. Анн. Онцол. Ван. Ј. Еур. Соц. Мед. Онцол. 23, 2185–2190 (2012).
21. Мореаук, Ј., Кассамбара, А., Хосе, Д. & Клеин, Б. СТЕАП1 је прекомерно изражен у канцерима: обећавајући терапеутски циљ. Биоцхем. Биопхис. Рес. Цоммун. 429, 148–155 (2012).
22. Оостерхеерт, В. & Грос, П. Структура крио-електронске микроскопије и потенцијална ензимска функција хуманог шестотрансмембранског епителног антигена простате 1 (СТЕАП1). Ј. Биол. Цхем. 295, 9502–9512 (2020).
23. Јиао, З. ет ал. Шест-трансмембрански епителни антиген експресије простате 1 промовише метастазе рака јајника помажући прогресију транзиције епитела у мезенхим. Хистоцхем. Целл Биол. 154, 215–230 (2020).
24. Гомес, ИМ, Аринто, П., Лопес, Ц., Сантос, ЦР & Маиа, ЦЈ СТЕАП1 је прекомерно изражен код карцинома простате и лезија интраепителне неоплазије простате и позитивно је повезан са Глеасоновим резултатом. У уролошкој онкологији: семинари и оригинална истраживања. вол. 32, 53.е23–53.е29 (Елсевиер, 2014).
25. Хуо, С.-ф. ет ал. СТЕАП1 олакшава метастазу и епително-мезенхимску транзицију аденокарцинома плућа преко ЈАК2/ СТАТ3 сигналног пута. Биосци. Реп. 40, БСР20193169 (2020).
26. Гомес, ИМ ет ал. Обарање СТЕАП1 инхибира раст ћелија и индукује апоптозу у ЛНЦаП ћелијама рака простате супротстављајући се ефекту андрогена. Мед. Онцол. 35, 1–10 (2018).
27. Гомес, ИМ, Маиа, ЦЈ & Сантос, ЦР СТЕАП протеини: од структуре до примене у терапији рака. Мол. Цанцер Рес. МЦР 10, 573–587 (2012).
28. Данила, ДЦ ет ал. Студија прве фазе ДСТП3086С, коњугата антитело-лек који циља шестотрансмембрански епителни антиген простате 1, код метастатског карцинома простате отпорног на кастрацију. Ј. Цлин. Онцол. Ван. Џем. Соц. Цлин. Онцол. 37, 3518–3527 (2019).
29. Келли, ВК ет ал. Фаза И студија АМГ 509, СТЕАП1 к ЦД3 Т ћелија које регрутују КсмАб 2+1 имунолошку терапију, код пацијената са метастатским карциномом простате отпорним на кастрацију (мЦРПЦ). Ј. Цлин. Онцол. 38, ТПС5589–ТПС5589 (2020).
30. Лин, Т.-И., Парк, ЈА, Лонг, А., Гуо, Х.-Ф. & Цхеунг, Н.-КВ Ново снажно анти-СТЕАП1 биспецифично антитело за преусмеравање Т ћелија за имунотерапију рака. Ј. Иммунотхер. Цанцер 9, е003114 (2021).
31. Сцхобер, СЈ ет ал. МХЦ класе И-рестриктиране ТЦР-трансгене ЦД4(+) Т ћелије против СТЕАП1 посредују у локалној контроли тумора Евинг саркома ин виво. Ћелије 9, 1581 (2020).
32. Роудиер, МП ет ал. Фенотипска хетерогеност крајњег стадијума карцинома простате метастатског у кости. Зујати. Патхол. 34, 646–653 (2003).
33. Гомес, ИМ, Сантос, ЦР, Соцорро, С. & Маиа, ЦЈ Шест транс мембрански епителни антиген простате 1 је смањен сексуалним хормонима у ћелијама простате. Простата 73, 605–613 (2013).
34. Схарп, А. ет ал. Експресија варијанте спајања андрогеног рецептора-7 јавља се са отпорношћу на кастрацију код рака простате. Ј. Цлин. Инвест. 129, 192–208 (2019).
35. Бакхт, МК ет ал. Неуроендокрина диференцијација рака простате доводи до супресије ПСМА. Ендоцр.-Релат. Рак 26, 131–146 (2018).
36. Ихласех-Цаталано, СМ ет ал. Прекомерна експресија протеина СТЕАП1 је независни маркер за биохемијски рецидив у карциному простате. Хистопатологија 63, 678–685 (2013).
37. Гомес, ИМ ет ал. Обарање СТЕАП1 инхибира раст ћелија и индукује апоптозу у ЛНЦаП ћелијама рака простате супротстављајући се ефекту андрогена. Мед. Онцол. 35, 40 (2018).
38. Логан, АЦ ет ал. Фактори који утичу на титар и инфективност лентивирусних вектора. Зујати. Гене Тхер. 15, 976–988 (2004).
39. Морган, РА, Греи, Д., Ломова, А. & Кохн, ДБ Генска терапија хематопоетским матичним ћелијама: напредак и научене лекције. Целл Стем Целл 21, 574–590 (2017).
40. Ларсон, СМ ет ал. Предклинички развој модификације гена хематопоетских матичних ћелија са химерним антиген рецепторима за имунотерапију рака. Зујати. Ваццин Иммунотхер. 13, 1094–1104 (2017).
41. Салтер, АИ ет ал. Фосфопротеомска анализа сигнализације химерних антигенских рецептора открива кинетичке и квантитативне разлике које утичу на функцију ћелије. Сци. Сигнал. 11, еаат6753 (2018).
42. Мајзнер, РГ ет ал. Подешавање захтева за густином антигена за активност ЦАР Т-ћелија. Цанцер Дисцов. 10, 702–723 (2020).
43. Цхаллита-Еид, ПМ ет ал. Моноклонска антитела на шест трансмембранских епителних антигена простате-1 инхибирају међућелијску комуникацију ин витро и раст хуманих туморских ксенографта ин виво. Цанцер Рес. 67, 5798–5805 (2007).
44. Худечек, М. ет ал. Несигнални екстрацелуларни спејсер домен химерних антигенских рецептора је одлучујући за ин виво антитуморско деловање. Цанцер Иммунол. Рес. 3, 125–135 (2015).
45. Гомес, ИМ, Сантос, ЦР & Маиа, ЦЈ Експресија СТЕАП1 и СТЕАП1Б у ћелијским линијама простате, и претпостављена регулација СТЕАП1 пост-транскрипцијским и пост-транслационим механизмима. Генес Цанцер 5, 142–151 (2014).
46. Бернсел, А., Виклунд, Х., Хеннердал, А. & Елофссон, А. ТОПЦОНС: консензус предвиђање топологије мембранског протеина. Нуклеинске киселине Рес. 37, В465–В468 (2009).
47. Крогх, А., Ларссон, Б., Вон Хеијне, Г. & Соннхаммер, ЕЛ Предвиђање трансмембранске топологије протеина са скривеним Марковљевим моделом: примена за комплетирање генома. Ј. Мол. Биол. 305, 567–580 (2001).
48. Лонг, АХ ет ал. 4-1ББ костимулација побољшава исцрпљеност Т ћелија изазвану тоничним сигнализирањем химеричних антигенских рецептора. Нат. Мед. 21, 581–590 (2015).
49. Бергер, Ц. ет ал. Адоптивни трансфер ефекторских ЦД8+ Т ћелија изведених из централних меморијских ћелија успоставља трајну Т ћелијску меморију код примата. Ј. Цлин. Инвестиг. 118, 294–305 (2008).
50. Гатинони, Л. ет ал. Подскуп Т ћелија људске меморије са својствима сличним матичним ћелијама. Нат. Мед. 17, 1290–1297 (2011).
51. Ксу, И. ет ал. Блиско повезане матичне ћелије Т-меморије су у корелацији са ин виво експанзијом ЦАР.ЦД19-Т ћелије су сачуване помоћу ИЛ-7 и ИЛ-15. Крв 123, 3750–3759 (2014).
52. Циери, Н. ет ал. ИЛ-7 и ИЛ-15 упућују на стварање матичних Т ћелија људске меморије из наивних прекурсора. Крв 121, 573–584 (2013).
53. Хансел, ДЕ ет ал. Заједничка мутација гена ТП53 у морфолошки и фенотипски различитом истовременом примарном неуроендокрином карциному малих ћелија и аденокарциному простате. Простата 69, 603–609 (2009).
54. Цузицк, Ј. ет ал. Прогностичка вредност потписа експресије РНК изведене из гена за пролиферацију ћелијског циклуса код пацијената са раком простате: ретроспективна студија. Ланцет Онцол. 12, 245–255 (2011).
55. Цхен, МЕ, Лин, СХ, Цхунг, ЛВ & Сикес, РА Изолација и карактеризација ПАГЕ-1 и ГАГЕ-7. Нови гени експримирани у моделу прогресије рака простате ЛНЦаП који деле хомологију са антигенима повезаним са меланомом. Ј. Биол. Цхем. 273, 17618–17625 (1998).
56. Балеи, ПА, Иосхида, К., Киан, В., Сехгал, И. & Тхомпсон, ТЦ Прогресија до неосетљивости на андрогене у новом ин витро моделу миша за рак простате. Ј. Стероид Биоцхем. Мол. Биол. 52, 403–413 (1995).
57. Мурад, ЈП ет ал. Претходно кондиционирање модификује ТМЕ како би се побољшала ефикасност ЦАР Т ћелија солидног тумора и ендогени заштитни имунитет. Мол. Тхер. Џем. Соц. Гене Тхер. 29, 2335–2349 (2021).
58. Брунда, МЈ ет ал. Антитуморска и антиметастатска активност интерлеукина 12 против тумора мишева. Ј. Екп. Мед. 178, 1223–1230 (1993).
