Терахерц спектроскопија високе резолуције топлотног разлагања гасних продуката дијабетичке и недијабетичке крвне плазме и пелета бубрежног ткива

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Апстрактан

значај:Један од савремених трендова у медицинској дијагностици заснива се на метаболомици, приступу који омогућава одређивање метаболита који могу бити специфичности болести. Гасна спектроскопија високе резолуције омогућава испитивање садржаја гасног метаболита у узорцима биолошког порекла. Представљамо разраду методе проучавања дијабетичких и недијабетичких биолошких узорака, припремљених у облику пелета, терахерц (ТХз) спектроскопијом високе резолуције.

Циљ:Основна идеја рада је проучавање садржаја гасних продуката термичке разградње дијабетичких и недијабетичких осушенихкрвна плазмаиткива бубрегаза откривање скупа гасних маркера који карактеришу дијабетес методом ТХз спектроскопије високе резолуције.

Приступ:Представљамо приступ проучавању дијабетичара и недијабетичаракрвна плазма(људи и пацови) иткива бубрега(пацови), коришћењем спектроскопије високе резолуције засноване на нестационарном ефекту фреквенцијског опсега ТХз. Развијене су методе припреме узорака крви и ткива бубрега у облику пелета и испаравања узорака.

Резултати:Мерење ротационих апсорпционих спектра пара при загревању пелета припремљених од крви иткиво бубрегаизведене су у фреквенцијском опсегу од 118 до 178 ГХз. Линије апсорпције које се појављују у спектрима пара узорка су детектоване и идентификоване. Молекуларни садржаји производа термичке разградње су се разликовали за недијабетичке и дијабетичке узорке; на пример, главни маркер је ацетон који се појављује у крви дијабетичара (људи и пацова) и код дијабетичараткиво бубрега.

Закључци: Наш рад илуструје потенцијалну могућност одређивања садржаја метаболита у биолошким узорцима за дијагностику и прогнозу болести за клиничку медицину. © Тхе Аутхорс. Објавио СПИЕ под лиценцом Цреативе Цоммонс Аттрибутион 4.0 Унпортед. Дистрибуција или репродукција овог дела у целини или делимично захтева потпуну атрибуцију оригиналне публикације, укључујући њен ДОИ. [ДОИ: 10.1117/1.ЈБО.26.4.043008] Кључне речи: терахерц спектроскопија високе резолуције; термичко разлагање; ткиво;крвна плазма; дијабетес; лиофилизација.

Кључне речи:терахерц спектроскопија високе резолуције; термичко разлагање; крвна плазма; дијабетес; лиофилизација, бубрежно ткиво.

цистанцхе искуство

1. Представљање

Проблем дијагностике друштвено значајних болести (дијабетес, канцерогена обољења и др.), укључујући и рану фазу, данас изазива велику пажњу научних група у свету.Један од нових приступа који отвара нове могућности у дијагностици и лечењу различитих болести је метаболомика. Метаболомика је област науке која истражује коначне и међупроизводе метаболизма биолошког система (ћелије, органа или целог организма). Метаболомика може открити метаболите који могу бити специфичне карактеристике болести и могу играти велику улогу у дијагнози и прогнози болести. Медији, који садрже крајње и међупродукте метаболизма у људском организму и корисни за откривање метаболита повезаних са болестима и патологијама, су издахнути дах, крв, урин, пљувачка итд.

Једна од друштвено значајних болести која угрожава квалитет живота људи је дијабетес. Дијабетес мелитус тип 2 је раније био болест средњих година, а сада се дијагностикује код одраслих, младих и деце. Резултати метаболомских испитивања узорака крви и урина пацијената са дијабетесом од 18 година, као и деце од 1 до 13 година, представљени су у бази података хуманог метаболома (ХМДБ).1 Углавном, крв (21 хемијска супстанца укључујући изомере), урин ( Испитивано је 30 хемијских супстанци укључујући изомере) и цереброспинална течност (1 хемијска супстанца). На пример, (Р)-3-хидроксибутерна киселина је откривена у све три врсте течности. Неке супстанце (ацетосирћетна киселина, Д-фруктоза и Д-глукоза) су откривене у обе течности (крви и урину). Карактеристичнија карактеристика дијабетеса (ацетон, ЦХ3ЦОЦХ3) била је присутна само за урин. Узорци течности, резултати истраживања представљени у ХМДБ, испитивани су различитим методама – гасна хроматографија; 2 гасна хроматографија са масеном спектрометријом; 3,4 гасно-течна хроматографија са масеном спектрометријом; 5 спектроскопија високе резолуције нуклеарног протонска магнетна резонанца;6 и методе које користе посебне уређаје за праћење стања пацијената са дијабетесом, систем за континуирано праћење глукозе.7

Развој хроничне болести бубрега је главна компликација дијабетес мелитуса. Иако је одређивање гликованог албумина уобичајен приступ скринингу, оштећење бубрега може почети много пре него што се појаве клинички значајне промене у албумину у урину. С обзиром на мултифакторску патогенезу хроничне бубрежне болести, различити маркери су разматрани за њен скрининг.8,9 Међутим, њихова дијагностичка вредност без биопсије бубрега је била сумњива.

Спектроскопски приступ може пружити информације о садржају биолошких узорака који се могу користити за медицинску дијагностику. Опсег фреквенција терахерца (ТХз) је веома важан за проучавање гасова, течности и ткива живих организама. Постоје неки прегледи посвећени примени метода ТХз фреквенцијског опсега, укључујући ТХз спектроскопију у временском домену, ТХз рефлектометрију и ТХз снимање за биологију и медицину.10

ТХз спектроскопија у временском домену омогућава детекцију спектра, где коефицијент апсорпције или индекс преламања има неке спектралне карактеристике које одговарају присуству неких биомолекула (протеина, шећера, итд.) у узорцима или њиховим различитим концентрацијама.11

Молекуларна апсорпциона спектроскопија, а посебно ТХз гасна спектроскопија је веома обећавајући приступ за истраживање вишекомпонентних гасних смеша различитог порекла.12 Узорци у течном и чврстом стању могу се истраживати испаравањем или термичком разградњом. Метаболити-маркери друштвено важних болести (дијабетес, рак, итд.) могу се открити по његовим спектралним линијама у апсорпционим спектрима који се врше при преносу зрачења кроз узорке гаса.

Ниво ацетона у узорцима издахнутог даха и урина узетим од пацијената са дијабетесом (12 особа) мерен је спектрометром терахерцног опсега са фазним померањем делујућег зрачења. Експерименти су рађени у сарадњи са Националним медицинским истраживачким центром Алмазов. Мерења су вршена на апсорпционим линијама ацетона са централним фреквенцијама од 150,537 и 151,647 ГХз. Мерења су обављена без грејања. Истовременом анализом узорака издахнутог даха и урина дијабетичара утврђено је да је ниво ацетона у урину био много већи него у издахнутом даху, у неким случајевима и за ред величине.13,14

Резултати испитивања гасне спектроскопије високе резолуције ТХз закрвна плазмаболесника и пацова (условно здравих и са дијабетесом) као и пацоваткиво бубрега(здрави и са дијабетесом) представљени су сушени и пресовани у пелете. Ткива иликрвна плазмаживих организама, без икакве припреме, мора се испитати одмах након узорковања. Припрема у облику пелета омогућава испитивање након довољно дугог времена након узимања узорака крви или биопсије бубрега.

2 Експерименти и методологија

2.1 Метода за припрему пелета крвне плазме и пелета за бубреге

Венска крв од пацијената са дијабетесом меллитусом типа 2 и условно здравих учесника прикупљена је на Одељењу за ендокринологију Националног медицинског истраживачког центра Алмазов; центар пружа медицинску негу за дијабетичаре. Три пацијента и два учесника били су мушкарци, одговарајућег узраста (39 до 43 године). Сви експериментални протоколи коришћени у овом истраживању прегледани су и одобрени од стране пацијената и учесника и Комисије за употребу Медицинског центра. Венска крв је сакупљена ујутру после 8 до 12 сати гладовања у епрувету са антикоагулансом К3ЕДТА (Вацутест Кима, Италија). Плазма је добијена за анализу биохемијских параметара центрифугирањем пуне крви на 3000 о/мин у трајању од 15 мин у лабораторијској центрифуги (Еппендорф 5702Р, Немачка) на температури од þ4 степена. Вредности биохемијских параметаракрвна плазмаузорци и референтни интервали су приказани у табели 1 (ниво гликованог хемоглобина је добијен на целој крви). Табела 1 показује да се концентрација глукозе, триглицерида и гликованог хемоглобина у узорцима болесника са дијабетесом повећава 1,5, 2, односно 2,3 пута.

Студија је такође спроведена на мушким пацовима Вистар старости од 8 недеља и тежине од 180 до 200 г, према протоколу експерименталних студија који је одобрила Комисија за негу и употребу животиња Института за експерименталну медицину Националног медицинског истраживачког центра Алмазов. Ниво глукозе код животиња експерименталне групе био је 21 ммол ∕ л након 120 мин након пуњења глукозом. Интактни пацови су коришћени као контролна група. Венска крв је сакупљена из доње шупље вене пре него што су животиње еутаназиране. Такође, бубрег је узет. Узорци крви су сакупљени у епрувете које садрже антикоагулант.

Испитни узорци су замрзнути на температури од −80 степени (хладњак за ниске температуре ДВ-86Л388А, Хаиер, Кина). Затим је лиофилизован сушењем замрзавањем Вацо 2 (ЗирБус, Немачка) на температури од −50 степени и притиску од 3 Па. Замрзавање се врши пре лиофилизације, јер током лиофилизације под утицајем високог унутрашњег притиска биолошке компоненте могу бити уништени. Осушени узорци су били сунђер који се састојао од биолошких кристала. Сунђер је уништен металном лопатицом и здробљен до кристала величине неколико десетина микрометара. Употреба малтера и тучка је била немогућа, јер би млевење протеина у саставу узорака довело до њиховог нежељеног приањања и формирања округлих гранула.

Прашак лиофилизованих узорака је измерен (аналитичка вага ОХАУС Дисцовери, Швајцарска) и затим стављен у челичну преса. Користећи лабораторијске пресе (Ангкор, Русија и Спецац, УК) на одређеном притиску калупа,крвна плазмадобијене су пелете и пелете за бубреге. Сваки кристал пелета садржи одређени проценат масти (триглицерида), протеина (албумина) и фибриногена - сви су нормални или гликовани (у случају дијабетичара). Пелете узорака из контролне групе у даљем тексту се називају „недијабетичке пелете“, а пелете узорака изгрупа дијабетичара у даљем тексту се назива "дијабетичка пелета".

Експериментална поставка спектроскопије високе резолуције од 2,2 ТХз

ТХз спектроскопија високе резолуције заснована на нестационарним ефектима омогућава анализу саставног састава гаса и паре вишекомпонентних гасних смеша. Спектрометри пружају осетљивост близу теоријске границе са резолуцијом ограниченом само Доплеровим ефектом и могу да снимају брзе процесе. Осетљивост је очувана чак и уз значајно смањење притиска гаса и износи приближно 0.2 ппб у режиму скенирања за неке гасове (нпр. амонијак на мерењима апсорпционе линије близу фреквенције од 572 ГХз). Поред тога, омогућава одређивање компонентног састава гасне смеше са високом поузданошћу.12 Студија производа термичког разлагања пелета спроведена је методом ТХз нестационарне гасне спектроскопије опсега од 118 до 178 ГХз. Спектрометар користи фазно закључану петљу за аутоматску контролу фреквенције лампе уназад таласа и фазног померања, регистрацију у временском домену, усредњавање и обраду спектроскопског прелазног сигнала. Уређај региструје сигнал у временском домену. Пара узорака је анализирана коришћењем следеће процедуре. Пелете су стављене у епрувету уз помоћ вакуум пумпе, постепено загреване епрувете (до 240 степени) и добијена мешавина производа термичког разлагања узорка је пуштена у мерну ћелију. Датотека са подацима обично укључује снимке изабраног или укупног радног опсега спектрометра. Због тога се супстанце могу идентификовати по апсорпционим линијама које се појављују у укупном спектру узорка, а динамика концентрација у смеши се може пратити упоређивањем неколико датотека са подацима. Супстанце су идентификоване претрагом у отвореним базама података МВ, ммв и ТХз.15,16

3 Анализа пара крвне плазме и пара у бубрезима помоћу терахерц спектрометра високе резолуције

Са нашим ТХз-ТДС системима, измерили смо пренос пелета у спектралном опсегу од 0.2 до 1,4 ТХз,17 али знамо да биомолекули, а посебно производи његовог распадања у гасном стању, имају информативни одговор (ротациона апсорпција спектри) на овим и нижим фреквенцијама, тако да смо извршили додатну студију на гасном спектрометру високе резолуције ТХз. Откривене апсорпционе линије супстанци код људи са дијабетесомкрвна плазмапоклапају се са супстанцама људи који немају дијабетескрвна плазма, осим ацетона. Постоји много апсорпционих линија ацетона које леже у опсегу радне фреквенције спектрометра (118 до 178 ГХз). Обично је више него довољно детектовати неку апсорпциону линију једне супстанце за недвосмислено одређивање присуства супстанце у вишекомпонентној гасној смеши. Пример снимања делова апсорпционог спектра са апсорпционом линијом ацетона је приказан на Сл. 1. Ацетон се може појавити у крви код поремећаја метаболизма угљених хидрата. Како се у литератури наводи, крв пацијената са дијабетесом је садржавала -ОХ-бутират и ацетоацетат, али су се касније ове супстанце разлагале на ацетон и угљен-диоксид.18 Угљен-диоксид нема диполни момент; дакле, нема ротационих прелаза. Његов повећан садржај може се открити само проучавањем вибрационог спектра узорка у ИЦ опсегу.

Супстанце пара плазме, као што су карбонил сулфид (ОЦС), сумпор диоксид (СО2), мравља киселина (ХЦООХ), изоцијанска киселина (ХНЦО) и амонијак (НХ3), откривене су и у узорцима дијабетичара и људи који нису дијабетичари. У неким случајевима постоји једна експериментална линија откривена у спектрима узорка која одговара више линија од једне за једну супстанцу (нпр. изоцијанску киселину) у каталошким подацима (видети табелу 2).15,16

Ово се објашњава чињеницом да каталози садрже податке о хиперфиним структурама супстанци које нису разрешене у овом експерименту јер линије имају коначну ширину реда неколико стотина кХз. Добијене апсорпционе линије проучаваних супстанци поклапају се са апсорпционим спектрима пара капиларне крви икрвна плазмапацијената са дијабетесом и условно здравих учесника који су објављени у нашем претходном раду.19 Откривене гасовите супстанце су могле да настану током припреме узорка као продукти хемијске трансформације аминокиселина. Питање да ли су ова једињења од дијагностичке вредности захтева истраживање. У клиничкој пракси у дијабетологији, анализа садржаја ових супстанци се још не користи.

Испарења одкрвна плазмаздравих пацова су садржавали карбонил сулфид (ОЦС), метанетиол (ЦХ3СХ), бутиронитрил (Ц3Х7ЦН), ацеталдехид (ЦХ3ЦХО) и мрављу киселину (ХЦООХ). Узорак одкрвна плазмадијабетичких пацова се разликовало по присуству ацетона. Поред апсорпционих линија пропионитрила (Ц2Х5ЦН), детектован је метил формат (ЦХ3ОЦХО).

Узорци пара сушених пелета здравих и дијабетичких пацоваткива бубрегасу проучавани. Испарења одткиво бубрегаздравих пацова садрже карбонил сулфид (ОЦС), сумпор диоксид (СО2), мрављу киселину (ХЦООХ), изоцијанску киселину (ХНЦО), етил формат (Ц2Х5ОЦХО) и пропилен гликол (ЦХ2ðОХÞЦХðОХÞЦХ3). Садржај паре дијабетичног пацоваткиво бубрегасе разликовао од здравог пацова по присуству не само карбонил сулфида (ОЦС) већ и његовог изотопола ОЦС-34. Ацеталдехид (ЦХ3ЦХО), метанетиол (ЦХ3СХ), етилен сулфид (Ц2Х4С), метанол (ЦХ3ОХ) и гликолалдехид (ЦХ2ðОХÞЦХО) су такође откривени у парама пелета дијабетичног пацоваткиво бубрега(види сл. 2 и сл. 3).

Присуство једињења сумпора, као што је метанетиол, може се одредити термичким разлагањем сумпорних аминокиселина (метионин, цистеин и цистин) у саставу протеина крви. Метионин је есенцијална аминокиселина која се не синтетише у људским организмима. Добија се из хране и извор је сумпора за биосинтезу цистеина. Када су сумпорне аминокиселине загрејане до температуре од око 240 степени, у масеном спектру ових супстанци откривени су метанетиол и етилен сулфид (распадање метионина).20

4. Закључак

Молекуларни садржај људи и пацовакрвна плазмаи пацовткиво бубрегатоком термичке декомпозиције узорака је проучаван помоћу ТХз спектрометра високе резолуције. Приказан је начин припреме биолошких узорака у облику пелета. Ова метода даје могућност складиштења и транспорта узорака. Гасна спектроскопија високе резолуције омогућава одређивање садржаја вишекомпонентних мешавина гаса било ког порекла, укључујући биолошке са концентрацијама гасних компоненти у траговима. Ацетон је откривен код дијабетичаракрвна плазмаУзорци. Информације о разлици садржаја дијабетичара и здравихкрвна плазмамушкараца и пацова и дијабетичара и здравих пацоваткива бубрегадобијен је из апсорпционих ротационих спектра пара. Употреба ТХз спектроскопије високе резолуције омогућава квалитативну анализу садржаја компоненти узорака пара крви иткива бубрегапелета. Могућност извођења квантитативне процене концентрација важних гасних маркера дијабетеса у зависности од стања пацијенататреба проучити у даљим истраживањима.