Ефикасност ограничења калорија на митохондријалну биогенезу и оштећење МтДНК у јетри пацова у зависности од старости

Контактирајтеoscar.xiao@wecistanche.comза више информација

Апстрактан:Рестрикција калорија (ЦР) је најефикаснији третман за одлагање појаве промена повезаних са узрастом, као што је митохондријска дисфункција. Међутим, осетљивост митохондријалних маркера на ЦР и старосне границе ефикасности ЦР нису у потпуности разјашњене. Користили смо узорке јетре пацова храњених ад либитумом (АЛ) подељене на:18-месечне (АЛ-18), 28-месечне (АЛ-28) , и 32-монтх-олд(АЛ-32) група, и од ЦР-третираних (ЦР) 28-монтхолд (ЦР-28) и 32- месец дана (ЦР-32) колегама да се испита ефекат ЦР на неколико митохондријалних маркера. Смањење активности цитрат синтазе у вези са узрастом, у количинама протеина ТФАМ, МФН2 и ДРП1, и садржаја мтДНК у АЛ-28 групи, спречено је у ЦР-28 групама. Сходно томе, ЦР је смањио оксидативно оштећење мтДНК процењено кроз инциденцу оксидисаних пурина у специфичним регионима мтДНК код ЦР-28 животиња. Ови налази подржавају ефекат ЦР против старења до 28 месеци. Насупрот томе, количине протеина ЛонП1, Цит ц, ОГГ1 и АПЕ1 и садржај делеције мтДНК од 4,8 Кб нису били погођени код ЦР-28 пацова. Одсуство значајних разлика између вредности АЛ-32 и параметара ЦР-32 указује на старосну границу ЦРеффицаци у овом узрасту.пуритански витамин цМеђутим, ово само делимично смањује предности ЦР-а у сузбијању генерализованог опадања старења и повезаног митохондријалног укључивања.

Кључне речи:јетра пацова; старење; ограничење калорија; митохондријална биогенеза; оштећење мтДНК; ефикасност ЦР у зависности од старости

Кликните овде да бисте сазнали више

1. Представљање

У складу са импресивном прогресијом студија које истражују процес старења, неколико различитих дефиниција процеса је узастопно састављено, а скуп путева и медијатора је идентификован као такозвана обележја старења [1,2]. Међу њима, митохондријална дисфункција, оксидативни стрес и молекуларна оштећења митохондрија су се појавили као кључни фактори. Важна карактеристика старења је специфичност ткива која је истакнута за укљученост митохондрија [3,4], епигенетске промене [5] и друге промене као што је дужина теломера [6]. Међу различитим третманима који имају за циљ превенцију или одлагање почетка промена у вези са узрастом, ограничење калорија (ЦР) је најстарија предложена стратегија [7], и још увек представља златни стандард за веома велики број корисних ефеката које ова интервенција преноси. Заиста, недавне студије о молекуларним механизмима изазваним ЦР су показале да ова нутритивна интервенција има позитиван утицај на неколико путева [8-10].систанцхеШтавише, ови налази такође снажно подржавају постојање „пластичности“ старења [5,9,11,12] која се може модулисати интеракцијама са околином као што су нутритивне или фармацеутске интервенције или животне навике. Већ је показано да ЦР спречава промене у митохондријалној биогенези и метаболизму у вези са узрастом у неколико ткива пацова са ткивно-специфичним ефектима [3,13,14]. Прецизније, претходне студије наше групе о јетри пацова, која је дубоко захваћена старењем на митохондријском нивоу, испитивањем органелних маркера показала су позитиван ефекат ЦР на митохондријалне промене везане за узраст. У ствари, код старијих 28-месечних пацова третираних ЦР, садржај митохондријалне ДНК (мтДНК), количина протеина укључених у митохондријалну биогенезу или РОС-осетљивост, и степен везивања митохондријалног транскрипционог фактора А(ТФАМ) на специфичним регионима мтДНК представљене су вредности које су значајно различите од оних код парова који су храњени ад либитум (АЛ) и нису статистички различити од оних код млађих 18-месечних животиња храњених АЛ [15]. Недавно, анализа митохондријалне биогенезе и оштећења мтДНК у јетри од АЛ-старих (28-месечних) и екстремно старих (32-месечних) пацова, омогућила нам је да проучавамо разнолик низ митохондријалних параметара и да сугерише другачији темпо старења у односу на укљученост митохондрија, код неколико животиња које природно достижу дуговечност у односу на већину оних који старе [16,17]. Са овим претпоставкама, имали смо за циљ да проценимо ефикасност ЦР на великом скупу митохондријалних маркера у различитим узрастима у јетри пацова. За ове сврхе користили смо животиње из веома дуговечног хибридног соја Фисцхер 344× Бровн Норваи, од којег су као контроле изабрани 18-месечни пацови храњени ад либитумом (АЛ-18), да се упореди са животињама храњеним ад либитум, старим (АЛ-28) и екстремно старим (АЛ-32) животињама и ЦР-третираним животињама одговарајућег узраста (ЦР-28 и ЦР{ {39}}). У овим групама пацова, проценили смо: активност митохондријалног ензима цитрат синтазе, експресију скупа протеина укључујући ТФАМ, Лон протеазу (ЛонП1) и цитохром ц(Цит ц), ензиме за поправку мтДНК 8- оксо ДНК гликозилаза/апуринска или апиримидинска(АП) лиаза (ОГГ1) и апуринска/апиримидинска ендонуклеаза 1(АПЕ1), и протеини митохондријалне динамике митофусин 2 (МФН2) и протеин 1 (ДРП1) повезан са динамином. Коначно, одређен је садржај мтДНК и оксидативна оштећења у одређеним регионима.

2. Резултати

2.1. Процена старости и ефеката ЦР на маркере митохондријалне функционалности

Активност цитрат синтазе, која је такође маркер митохондријалне масе, одређена је у свих пет група пацова да би се проценила осетљивост митохондријалне функционалности на старење и ЦР (Слика 1).

Статистички значајно смањење активности цитрат синтазе у вези са узрастом примећено је код АЛ-28(-41 процената) и АЛ-32(-40 процената) пацова у поређењу са АЛ{{ 5}} контрола старости. Није пронађена статистички значајна разлика између АЛ-28 и АЛ-32 група. Ефекат ЦР је демонстриран значајно вишом (плус 40 процената) ензимском активношћу код ЦР-28 пацова у поређењу са вредношћу АЛ-28 пацова одговарајућег узраста. Штавише, активност ЦР-28 била је слична оној уоченој код млађих АЛ-18 контролних пацова (Слика 1). Уместо тога, овај ефекат је пригушен код ЦР-32 животиња. У ствари, у старијој доби од 32 месеца, није се могла приметити статистичка разлика између АЛ и ЦР група.

цистанцхе може против старења

Да би се продубила анализа утицаја старости и ЦР на функционалност митохондрија, количина протеина ТФАМ и ЛонП1 је одређена у митохондријама изолованим из свих група пацова Вестерн блот анализама, у којима је протеин из спољашње митохондријалне мембране ВДАЦ коришћен као унутрашња контрола оптерећења (слика 2).

Слика 2. Количина ТФАМ и ЛонП1 протеина у изолованим митохондријама јетре из АЛ-18, АЛ-28, ЦР-28, АЛ-32 и ЦР-32-месеца -стари пацови. (А). Количине ТФАМ протеина у изолованим митохондријама јетре из различитих група пацова. У инсету, репрезентативни Вестерн блот је изведен на једном пацовима из сваке анализиране групе. Имунореактивне траке, од врха до дна, представљају, респективно, сигнале из ТФАМ-а и ВДАЦ-а. Хистограм показује квантификацију интензитета трака ТФАМ, нормализованог на интензитет ВДАЦ.(Б). Количине протеина ЛонП1 у изолованим митохондријама јетре из различитих група пацова. У инсету, репрезентативни Вестерн блот је изведен на једном пацовима из сваке анализиране групе. Од врха до дна, имунореактивне траке представљају, респективно, сигнале из ЛонП1 и ВДАЦ.шта је цистанчеХистограм показује квантификацију интензитета трака ЛонП1, нормализованог на интензитет ВДАЦ. (А, Б) Подаци представљају резултате из три примерка Вестерн блот експеримената и анализирани су коришћењем Оне-ваи АНОВА теста и Тукеи-овог теста вишеструког поређења . Траке представљају средње вредности и СД за пет експерименталних група. Подаци су нормализовани у односу на вредност АЛ-18 пацова, фиксиран као 1.*п<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.="" n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" aging="" led="" to="" a="" statistically="" significant="" (-31%)decrease="" in="" the="" tfam="" amount="" comparing="" al-18="" control="" rats="" with="" both="" al-28="" and="" al-32="" animals,="" whereas="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" values="" of="" al-28="" and="" al-32="" groups.="" as="" an="" effect="" of="" cr,="" the="" cr-28="" rats="" had="" a="" tfam="" amount="" significantly="" higher(+39%)="" than="" that="" of="" the="" age-matched="" al="" counterparts="" and="" not="" different="" from="" that="" of="" the="" younger="" al-18="" controls.="" conversely,="" such="" diet="" effect="" was="" not="" visible="" anymore="" in="" the="" cr-32="" animals="" that="" showed="" a="" tfam="" amount="" not="" statistically="" different="" from="" that="" of="" the="" age-matched="" al="" group="" and="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" al-18="" rats.="" as="" for="" the="" lonp1="" amount,="" there="" was="" a="" statistically="" significant="" (-65%)="" age-related="" decrease="" in="" the="" al-28="" group="" with="" respect="" to="" the="" al-18="" value.="" the="" age="" progression="" made="" the="" statistically="" significant="" decrease="" in="" the="" lonp1="" amount,="" with="" respect="" to="" the="" al-18="" rats,="" more="" marked(-75%)in="" the="" al-32="" group.="" interestingly,="" there="" was="" no="" evident="" effect="" of="" cr="" on="" the="" lonp1="" amount="" since="" the="" comparison="" between="" the="" al-28="" value="" and="" the="" cr="" age-matched="" counterpart="" did="" not="" show="" any="" significant="" difference="" and="" the="" same="" occurred="" for="" the="" comparison="" between="" the="" al-32="" and="" cr-32="">

Да бисмо проценили ефекат старења и ЦР на другу метаболичку функцију митохондрија, која је иницијација митохондријалног интринзичног апоптотичког пута, ми смо, помоћу Вестерн блот експеримената, утврдили интрамитохондријалну количину Цит ц (Слика 3).

Слика 3. Количина Цит ц протеина у изолованим митохондријама јетре из АЛ-18, АЛ-28, ЦР-28, АЛ-32 и ЦР-32-месечно стари пацови. У инсету, репрезентативни Вестерн блот је изведен на једном пацовима из сваке анализиране групе. Од врха до дна, имунореактивне траке представљају, респективно, сигнале из Цит ц и ВДАЦ. Хистограм показује квантификацију интензитета трака Цит ц нормализованог на интензитет ВДАЦ. Сви подаци су представљали резултате трипута Вестерн блот експеримената и анализирани су коришћењем Оне-ваи АНОВА теста и Тукеи-овог теста вишеструког поређења. Траке представљају средње вредности и СД за пет експерименталних група. Подаци су нормализовани у односу на вредност АЛ-18 пацова, фиксиран као 1.* п<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.="" n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" the="" age-related="" effect="" on="" the="" intra-mitochondrial="" cyt="" c="" amount="" was="" peculiar="" since="" there="" was="" a="" marked(-44%)statistically="" significant="" decrease="" passing="" from="" the="" al-18="" rats="" to="" the="" al-28="" animals,="" but="" such="" decrease="" was="" partially="" prevented="" in="" the="" al-32="" group="" showing="" a="" small(-13%)="" decrease="" in="" comparison="" with="" the="" al-18counterpart="" and="" a="" significant="" marked="" (+55%)="" increase="" in="" comparison="" with="" the="" al-28="" rats.="">Цистанцхе против старењаЕфекат ЦР уопште није био релевантан јер није било значајних разлика у количинама Цит ц протеина између АЛ и ЦР група одговарајућег узраста са 28 као и са 32 месеца. Смањење количине Цит ц у ове две групе у вези са узрастом показало је тренд сличан оном уоченом у групама АЛ-28 и АЛ-32 са релевантнијим смањењем код ЦР-28 животиња делимично спречен код старијих ЦР-32 пацова.

2.2. Процена старости и ефеката ЦР на ензиме за поправку мтДНК

Пошто се показало да је старење у великој мери повезано са акумулацијом оштећења мтДНК, измерили смо, помоћу Вестерн блот експеримената, у изолованим митохондријама јетре експресију два главна ензима за поправку мтДНК, односно 8-оксо ДНК гликозилазе/апуринске или апиримидинска(АП)лиаза (ОГГ1) и апуринска/апиримидинска ендонуклеаза 1(АПЕ1), обе укључене у поправку ексцизије базе (БЕР) која је преовлађујући механизам поправке мтДНК (Слика 4).

Слика 4. Количина ОГГ1 и АПЕл протеина у изолованим митохондријама јетре из АЛ-18, АЛ-28, ЦР-28, АЛ-32 и ЦР-32-месеца -стари пацови. (А). У инсету, репрезентативни Вестерн блот је спроведен на једном пацовима из сваке анализиране групе. Имунореактивне траке, од врха до дна представљају, респективно, сигнале из ОГГл и ВДАЦ. Хистограм показује квантификацију интензитета трака ОГГ1 нормализованог на интензитет ВДАЦ.(Б). На инсету, репрезентативни Вестерн блот је изведен на једном пацовима из сваке од испитиваних група.цистанцхе бенефициосОд врха до дна, имунореактивне траке представљају, респективно, сигнале из АПЕ1 и ВДАЦ. Хистограм показује квантификацију интензитета трака АПЕ1 нормализованог на интензитет ВДАЦ. (А, Б) Подаци су представљали резултате утростручених Вестерн блот експеримената и анализирани су коришћењем Оне-ваи АНОВА теста и Тукеи-овог теста вишеструког поређења. Траке представљају средње вредности и СД за пет експерименталних група. Подаци су нормализовани у односу на вредност АЛ-18 пацова, фиксно као 1. н: Број анализираних животиња.

Количине интрамитохондријалног протеина оба ензима су имале сличне трендове као код старости и ефеката ЦР. Конкретно, ОГГ1 и АПЕ1 нису показали никакву статистички значајну промену у вези са узрастом у групама АЛ и ЦР што указује да уопште нема утицаја на старост. Неочекивано, такође ЦР није изазвао никакав значајан ефекат на количине ОГГ1 и АПЕ1 у групи ЦР-28 у поређењу са АЛ животињама одговарајућег узраста, као и између 32-месечних група.

2.3. Евалуација старости и ефеката ЦР на митохондријалну динамику

Пошто смо претходно пријавили значајан утицај старости на експресију протеина укључених у фузију (МФН2) и фисију (ДРП1) [16], овде смо проценили ефекте ЦР током дугог временског периода на ове маркере. Према томе, количине протеина МФН2 и ДРП1 су одређене, Вестерн блот експериментима, у изолованим митохондријама јетре из свих група пацова (Слика 5).

Слика 5. Количина МФН2 и ДРП1 протеина у изолованим митохондријама јетре из АЛ-18, АЛ-28, ЦР-28, АЛ-32 и ЦР-32-месеца -стари пацови. (А). У инсету, репрезентативни Вестерн блот је спроведен на једном пацовима из сваке анализиране групе. Од врха до дна, имунореактивне траке представљају, респективно, сигнале из МФН2 и ВДАЦ. Хистограм показује квантификацију интензитета трака МФН2 нормализованог на интензитет ВДАЦ.(Б). У инсету, репрезентативни Вестерн блот је изведен на једном пацовима из сваке анализиране групе. Имунореактивне траке, од врха до дна представљају, респективно, сигнале из ДРП1 и ВДАЦ. Хистограм показује квантификацију интензитета трака ДРП1 нормализованог на интензитет ВДАЦ. (А, Б) Подаци представљају резултате из три примерка Вестерн блот експеримената и анализирани су коришћењем Оне-ваи АНОВА теста и Тукеи-овог теста вишеструког поређења. Траке представљају средње вредности и СД за пет експерименталних група. Подаци су нормализовани у односу на вредност АЛ-18 пацова, фиксно као 1. *п<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="">

Пронашли смо статистички значајно смањење (-43 процената) МФН2 у вези са узрастом код АЛ-28 пацова у поређењу са АЛ-18 контролама. Такво смањење је спречено код АЛ-32 пацова који показују комплексан ефекат старости, сличан оном који је пријављен за Цит ц. Међутим, за разлику од Цит ц, ЦР је имао веома позитиван ефекат на 28-месечне животиње, спречавајући код ЦР-28 пацова смањење старости АЛ-28 животиња и што је довело до значајног значајног повећања ( плус 52 процента ) у МФН2 у поређењу са АЛ колегом који одговара узрасту. Штавише, количина МФН2 код ЦР-28 пацова није се разликовала од вредности у АЛ-18 контролама, што указује на ефикасну превенцију ефекта везаног за узраст. Није нађена значајна разлика између група АЛ-32 и ЦР-32, што указује на ограничен ефекат ЦР код најстаријих животиња. Штавише, није пронађен ефекат везан за узраст за МФН2 у групи АЛ-32 у поређењу са АЛ-18 колегом. Слично томе, количине ДРП1 протеина су показале значајно смањење у зависности од старости (-49 процената) код АЛ-28 пацова у поређењу са АЛ-18 групом што је спречила ЦР у {{29 }}месечне животиње. Заиста, група ЦР-28 је показала позитивну разлику (плус 50 процената) у поређењу са АЛ-28, показујући снажан ЦР ефекат. Међутим, одсуство разлике између АЛ-32 и ЦР-32 у погледу количине ДРП1 протеина даље указује на ограничену ефикасност ЦР у продуженом старењу. Опет, није било евидентног утицаја старости ни за износе ДРП1 који су прелазили из групе АЛ-18 у групу АЛ-32. Затим смо одредили вредности индекса фузије (ФИ као однос између МФН2/ДРП1 за сваког од испитиваних пацова (слика 6).

Вредности ФИ у групи АЛ{{0}} покривале су уски опсег од 1,37 до 2,64, док су у групи АЛ-28 све вредности биле веће у распону од 2,20 до 8,24 . Вредности ФИ групе ЦР{{10}} кретале су се од 0,99 до 5,14 и биле су прилично сличне онима код АЛ-18 пацова. Код АЛ-32 животиња, вредности ФИ су се кретале од 0,70 до 2,27, покривајући тако интервал сличан оном у АЛ-18 групи, што указује на одсуство израженог утицаја старости. У групи ЦР-32, вредности ФИ су се кретале од 0,87 до 2,02 и биле су упоредиве са онима код АЛ-32 животиња, што подржава идеју да продужено старење (32 месеца) може бити мање осетљиво на ЦР него старење (28 месеци).

Статистичка анализа вредности ФИ из свих група приказана је на слици 7. У поређењу између АЛ-18 и АЛ-28 група, виша вредност ФИ ове последње указује на промену у вези са узрастом. динамичка равнотежа. Што се тиче пацова третираних ЦР-ом, вредност групе ЦР-28 није се разликовала од вредности АЛ-18 пацова и подржавала је ефикасност исхране у поређењу са пацовима који су храњени АЛ-ом одговарајућег узраста . Анализирајући вредности АЛ-32 и ЦР-32 ФИ, уочљиво је одсуство значајне разлике између њих, што је поткрепило идеју о смањеној ефикасности исхране код животиња које природно достижу продужено старење. Штавише, вредности ФИ обе 32-месечне групе нису се разликовале од АЛ-18 пандана, што потврђује одсуство израженог ефекта старости код најстаријих животиња.

Овај чланак је преузет из Инт. Ј. Мол. Сци. 2021, 22, 1665