Тренутни статус неуропротекције код урођених срчаних болести, 2. део

Микроскопске слике су затим подвргнуте прорачуну слике помоћу софтвера ИмагеЈ (Национални институт за здравље, Бетхесда, МД, САД). Сигнал Хсп60 је помножен са "х".

Хсп60 је важан протеински молекул који игра важну биолошку улогу у људском телу. Истраживања последњих година су показала да је присуство Хсп60 уско повезано са људским памћењем.

Хсп60 је молекуларни протеин шаперон који је углавном укључен у савијање, одвијање, стабилизацију и деградацију протеина. Ови процеси су веома важни за нормалан метаболизам и ћелијску функцију људског тела. Истовремено, Хсп60 такође има антиоксидативна, антиинфламаторна и имуномодулаторна дејства и игра велику улогу у одржавању здравља људи и равнотеже имуног система.

Истраживања су открила да Хсп60 игра кључну улогу у формирању и одржавању меморије. Током процеса учења и памћења, мождане ћелије производе велики број молекула Хсп60. Ови молекули могу заштитити ћелије од сметњи и оштећења из спољашње средине како би осигурали несметан напредак учења и памћења. Поред тога, Хсп60 такође може утицати на људско размишљање и понашање мењајући трансдукцију сигнала можданих ћелија и развој неурона и има позитиван утицај на когницију и отпорност на стрес.

Иако је улога Хсп60 показала позитивне ефекте на људско тело, људи такође морају да схвате да и вишак и недостатак Хсп60 могу имати негативне ефекте на људско здравље. Стога би требало да активно истражујемо и проучавамо механизам Хсп60 у различитим физиолошким и патолошким стањима људског тела да бисмо боље разумели положај и улогу Хсп60 у људском здрављу. Види се да морамо побољшати памћење, а Цистанцхе десертицола може значајно побољшати памћење, јер Цистанцхе десертицола има антиоксидативна, антиинфламаторна и анти-агинг ефекта, што може помоћи у смањењу оксидације и инфламаторних реакција у мозгу, чиме се штити здравље нервног система. Поред тога, Цистанцхе десертицола такође може да подстакне раст и поправку нервних ћелија, чиме се побољшава повезаност и функција неуронских мрежа. Ови ефекти могу помоћи у побољшању памћења, способности учења и брзине размишљања, а такође могу спречити развој когнитивне дисфункције и неуродегенеративних болести.

Кликните на Знај да бисте побољшали краткорочно памћење

Вредност "к" је одређена на следећи начин: одузимањем "к"-савијеног Хсп60 сигнала од сигнала митохондријалне ДНК у контролној групи, вредност митохондријалне ДНК је мања или једнака нули. Сигнал хистона Х2Б је помножен са "и".

Вредност "и" је одређена на следећи начин: одузимањем "и"-савијеног хистон-Х2Б сигнала од сигнала нуклеарне ДНК у контролној групи учинило је да вредност нуклеарне ДНК буде мања од или једнака нули. Ако позадински сигнал постане висок од множења, контраст умножене слике може се подесити за исте услове у свим узорцима.

Слика бојења дсДНК, минус прилагођена слика умноженог Хсп60 и хистона Х2Б, коришћена је за накнадну анализу. Користећи функцију "Адјуст-Тхресхолд", ове слике су бинаризоване. Одабрали смо дсДНК пунцта величине од 2 до 20 µм2 (кружност 0,1–1,0), а они су пребројани помоћу функције „Анализирај-анализирај честице“.

2.3. Електронска микроскопија

Један дан пре трансфекције, ХеЛа ћелије су постављене на густину од 600 ћелија/µЛ. Експресија гена од интереса је утишана у ХеЛа ћелијама коришћењем Стеалтх РНАи сиРНА (Тхермо Фисхер Сциентифиц) у реагенсу за трансфекцију Липофецтамине РНАиМАКС (ТхермоФисхер Сциентифиц) према упутства произвођача (са коначном концентрацијом РНК од 10 нМ).

Четири дана након пада сиРНА, ћелије су подвргнуте фиксацији. Узорци ћелијске културе су фиксирани са 2% ПФА и 2% глутаралдехида у 0.1 М фосфатном пуферу, пХ 7,4, на 37 ◦Ц, затим стављени у 4 ◦Ц фрижидер на 30 мин. Узорци су фиксирани у 2% глутаралдехида у 0.1 М фосфатном пуферу преко ноћи на 4 ◦Ц. Узорци су испрани три пута са 0.1 М фосфатним пуфером током 30 минута и накнадно фиксирани са 2% осмијум-тетроксида у 0,1 М фосфатном пуферу на 4 ◦Ц током 1 х.

Узорци су дехидратисани инградираним растворима етанола, пребачени у смолу (Куетол-812, Ниссхин ЕМ Цо., Токио, Јапан) и полимеризовани на 60 ◦Ц током 48 х. Полимеризоване смоле су исечене на ултратанке 70- нмсекције дијамантским ножем коришћењем ултрамикротома (Ултрацут УЦТ, Леица Мицросистемс, Ветзлар, Немачка) и затим су постављене на бакарне решетке.

Секције су обојене 2% уранил ацетатом на собној температури 15 минута и испране дестилованом водом, након чега је уследило секундарно бојење раствором за бојење олова (Сигма-Алдрицх, Токио, Јапан) на собној температури током 3 минута.

Мреже су посматране под трансмисионим електронским микроскопом (ЈЕМ-1400Плус, ЈЕОЛ Лтд., Токио, Јапан) на напону убрзања од 80 кВ (мозак зебрице) или 100 кВ (ћелија), а слике су снимљене помоћу камере са спојним пуњењем (ЦЦД) (ЕМ-14830РУБИ2,ЈЕОЛ Лтд.) .

2.4. Имуноелектронска микроскопија

Узорци на златним дисковима су замрзнути у течном пропану на -175 ◦Ц. Након што су узорци замрзнути, замрзнути су супституисани са 1% танинске киселине у етанолу и 2% дестиловане воде на -80 ◦Ц током 24 сата.

Узорци су затим држани на -20 ◦Ц током 4 сата, након чега је уследила инкубација на 4 ◦Ц током 1 сата. Затим су узорци дехидрирани у анхидрованом етанолу 3 пута по 30 мин. сваки пут, праћено инфилтрацијом са мешавином етаноланда у размери 50:50 (ЛР бело: Лондон Ресин Цо. Лтд., Беркшир, УК) на 4 ◦Ц током 1 сата. Узорци су пребачени у свежу 100% смолу и инкубирани на 4 ◦Ц током 30 минута, а овај процес је поновљен три пута.

Узорци су пребачени у свежу 100% смолу и полимеризовани на 50 ◦ЦО/Н. Полимеризоване смоле су ултра-танке пресечене на 90 нм дијамантским ножем коришћењем ултрамикротома (Ултрацут УЦТ; Леица), а пресеци су постављени на никловане решетке. Решетке су инкубиране са анти-дсДНК антителом (35И9 ДНК) (1/800, Абцам, Цат# аб27156, РРИД: АБ_470907) у 1% БСА/ПБС на 4 ◦ЦО/Н, након чега су уследила три испирања са 1% БСА/ПБС по 1 мин.

Они су затим инкубирани са овим секундарним антителом коњугованим са {{0}}нм златним честицама (козје анти-мишје ИгГ поликлонско антитело) током 2 сата на собној температури. Након испирања са ПБС, решетке су стављене у 2% глутаралдехидеин 0,1 М какодилат пуфер.

Након тога, решетке су осушене и затим бојене са 2% уранил ацетата током 15 минута и раствором олова (Сигма-Алдрицх) на собној температури 3 минута. Решетке су посматране преко трансмисионог електронског микроскопа (ЈЕМ-1400 плус ЈЕОЛЛтд.) на напону убрзања од 100 кВ. Дигиталне слике су добијене ЦЦД камером (ЕМ-14830РУБИ2, ЈЕОЛ Лтд.).

3. Резултати

3.1. Смањен ТФАМ или ГБА изазива повећање ектопичне митохондријалне ДНК

Прво, показали смо пример детекције цитоплазматске ДНК изведене из митохондрија у ХеЛа ћелијама у којима је ТФАМ протеин оборен сиРНА (Слика 1А). ТФАМ је кључни фактор митохондријске транскрипције и такође функционише у репликацији и поправци митохондријске ДНК [20] .

Полиморфизми секвенце у овом гену су повезани са Паркинсоновом болешћу [21,22]. После 3 дана уништавања ТФАМ протеина, много дволанчаних ДНК тачака је откривено у цитоплазми ХеЛа ћелија.

Хистони су позитивни маркери за ДНК нуклеарног порекла у цитоплазми, а негативни маркери за митохондријску ДНК и ДНК митохондријалног порекла у цитоплазми [23]. Ове тачке се нису ко-локализовале са хистонима, што сугерише да нису ДНК нуклеарног порекла. Штавише, неке од ових цитоплазматских, ектопичних ДНК тачака нису се ко-локализовале са Хсп60, маркером за митохондријску матрицу, што указује да се налазе изван митохондрија (Слика 1Б, Ц).

Електронска микроскопија је такође показала да је ектопична ДНК исцурила из митохондрија (Слика 2А, Б). Укратко, повећање ектопичних ДНК тачака у цитоплазми ТФАМ-ом нокауном настало је због цурења митохондријалне ДНК из митохондрија. Друго, показали смо још један пример детекције цитоплазматске ДНК изведене из митохондрија у ХеЛа ћелијама у којима је ГБА протеин оборен сиРНА. (Слика 1А).

ГБА је узрочник за Гауцхерову болест, али хетерозиготна мутација ГБА је такође фактор ризика за Паркинсонову болест [24]. Много дволанчаних ДНК тачака је откривено у цитоплазми ХеЛа ћелија након 3 дана обарања ГБА протеина. Неке ДНК тачке су биле ко-локализоване са хистонима, што сугерише да су ДНК изведене из нуклеарног материјала.

Остале ДНК тачке нису биле ко-локализоване са хистонима, што сугерише да нису ДНК изведена из нуклеарног система, већ ДНК изведена из митохондрија (слика 1Д). Укратко, повећање ектопичних ДНК тачака у цитоплазми због ГБА нокдауна је барем делимично последица цурења митохондријалне ДНК из митохондрија.

For more information:1950477648nn@gmail.com