Глобална преваленција хроничне болести бубрега (ХББ) расте са старењем становништва

За више информација контактирајте oscar.xiao@wecistanche.com

Позадина:Фиброза је једна од најчешћих патолошких карактеристика процеса старења бубрега, а фиброза у бубрезима старења такође отежава процес хроничне бубрежне болести (ЦКД). Цораллодисцус флабеллата БЛБуртт (Ц.флабеллата, ЦФ) је уобичајено коришћени ботанички лек у кинеском фолклору. Међутим, неколико студија је пријавило његове фармаколошке ефекте. Ова студија је имала за циљ да истражи ефекат екстракта етанола ЦФ на фиброзу бубрега код САМП8 мишева и идентификује потенцијално активна једињења.

Методе:Као животињски модели коришћени су мишеви склони 8 са убрзаним старењем (САМП8), а различите дозе ЦФ су даване путем сонде током једног месеца. Да се ​​посматра степен старења бубрега код мишева коришћењем бојења -галактозидазом. Массоново бојење и нивои експресије Цол-лИ, а-СМА и ФН коришћени су за процену бубрежне фиброзе код мишева. Измерени су нивои експресије протеина Нрф2 пута и Внт/-цатенин/РАС пута у бубрезима. И -галактозидаза (-гал) индуковала је НРК-52Е ћелије као ин витро модел за скрининг активних компоненти ЦФ.

Кликните овде да бисте сазнали више

Резултати:Екстракт ЦФ етанола значајно је инхибирао активност реналне -галактозидазе и нивое експресије Цолл, а-СМА и ФНин САМП8 мишева и побољшао Массоново бојење код САМП8 мишева. ЦФ је значајно смањио уринарни протеин, креатинин, азот урее и нивое ТНФ-а и ИЛ-1 у серуму код САМП8 мишева и значајно повећао нивое СОД и ГСХ-Пк. Штавише, ЦФ је активирао Нрф2 пут и блокирао пут Внт/-цатенин/РАС у бубрезима мишева. Поред тога, 3,4-дихидрокси фенил етанол (СДЦ-0-14,16) и (3,4-дихидрокси фенил етанол-8-О-[4-О-транс -кафеоил- -Д-апиофуранози-(1→3)- -Д-глукопиранозил (1→6)]- -Д-глукопиранозид (СДЦ-1-8) су изоловани из ЦФ , што је смањило старење НРК-52Е ћелија, а можда и активни састојци ЦФ који играју улогу против старења.

Закључци:Наши експерименти су осветлили да екстракт ЦФ етанола може побољшати реналну фиброзу код САМП8 мишева путем Внт/-цатенин/РАС пута. А СДЦ-0-14,16 и СДЦ-1-8 могу бити материјална основа за ЦФ за испољавање ефеката у вези са старењем бубрега.

Кључне речи:Старење, Цораллодисцус флабеллата, бубрези, фиброза бубрега, САМП8, старење, Внт/ -цатенин/РАС

Увод

Глобална преваленција хроничне болести бубрега (ХБК) расте са старењем становништва и представља значајан терет за друштво [1-3]. Најчешћа патолошка манифестација ЦКД је неки облик бубрежне фиброзе[4]. Такође, фиброза бубрега је такође један од знакова старења бубрега [2]. Студије су показале да су оксидативни стрес, инфламација, Внт/-катенин, ренин-ангиотензин-алдостерон систем (РАС) и рапамицин (мТОР) сигнали повезани са ЦКД изазваном старењем [5]. Бубрежна фиброза у бубрезима старења је уско повезана са активацијом Внт/-катенина и РАС сигналног пута [6]. Након активације Внтс-а, -катенин у цитоплазми се транслоцира у језгро, где се везује за фактор везивања лимфоидног појачивача (ЛЕФ)/фактор транскрипције Т-ћелија (ТЦФ) и покреће транскрипцију низводних циљних гена. Занимљиво је да промоторски регион гена РАС такође садржи ЛЕФ/ТЦФ везујућа места, што омогућава -цатенин да промовише везивање ЛЕФ-1 за ова места[7].цистанцхе холестерол,Према томе, циљање на Внт/-цатенин/РАС сигнални пут може бити потенцијална терапијска стратегија за бубрежну фиброзу [8,9]. Последњих година, супституциона терапија бубрежне фиброзе природним производима привукла је пажњу многих научника [10]. . Ксиаоиан Схен и сарадници су открили да гинсенозид Ргл побољшава гломеруларну фиброзу током старења бубрега инхибирањем активације НЛРП3 инфламасома код САМП8 мишева [11]. Ова студија је истраживала ефекат екстракта Ц. флабеллате(ЦФ) на фиброзу бубрега код САМП8 мишева из Внт/-цатенин/РАС пута.

Цистанцхе може против старења

ЦФ као лековита биљка у Кини је први пут забележена у „Диан Нан Бен Цао. Цела биљка се обично користи за лечење дизентерије, преране ејакулације, болести семенских везикула и болести бубрега у етничким мањинама у Кини [12]. Тренутно , има мало извештаја о ЦФ у савременим истраживањима Фармаколошке студије у нашој лабораторији су показале да екстракт ЦФ има диуретичко дејство и побољшава отказивање јетре изазвано липополисахаридом/Д-галактозамином и оштећење мозга код пацова [13, 14] И фитокемијске студије на открило је да су фенилетаноидни гликозиди и флавоноиди главне хемијске компоненте ЦФ [15,16] Циљ ове студије је био да се испита ефекат ЦФ екстракта на бубрежну фиброзу код САМП8 мишева и да се разјасни њен могући механизам, како би се обезбедио експериментални докази за лечење болести бубрега са ЦФ описани у древним књигама.

материјали и методе

Сакупљање и екстракција биљног материјала

„Иуннан Цхинесе Хербал Медицине“ бележи да се ЦФ може сакупљати током целе године. Биљке ЦФ коришћене у овом експерименту убране су у округу Ксикиа, провинција Хенан, Кина у септембру. Идентификовао га је професор Суикинг Цхен са Универзитета кинеске медицине Хенан, а узорци су похрањени у библиотеци лабораторијских узорака.цистанцхе десертицола нежељени ефектиБиљке (1 кг) су рефлуксоване са 50% етанола (3×12 Л, сваки 1 х), а смеша је филтрирана са 16 слојева газе. Комбиновани филтрати су осушени ротационим упаравањем коришћењем сушача смрзавањем. Коначно, процентуални принос 50% етанолног сировог екстракта ЦФ био је 15,5%. Осушени екстракт чуван је у фрижидеру до даље употребе. Додатни материјали наводе релевантне податке о ознаци састојка екстракта ЦФ.

У овој студији је коришћен још један процес одвајања који је раније објављен да би се добила елуциона фракција воде, 20 процената елуционе фракције етанола, 30 процената елуционе фракције етанола и 40 процената елуционе фракције етанола из ЦФ [13]. Фракција од 40 процената етанола је одвојена коришћењем Сепхадек ЛХ-20 и колоне силика гела и пречишћена полупрепаративном течном хроматографијом високих перформанси (ХПЛЦ) да би се коначно добила једињења као што су СДЦ-0-14,16, СДЦ{ {10}}, СДЦ-0-60(п-хидрокси бензил алкохол).

Животиње и администрација

У овој студији коришћени су шестомесечни мужјаци САМП8 и мишеви 1 (САМР1) отпорни на старење са убрзаним старењем из Прве придружене болнице Универзитета традиционалне кинеске медицине у Тиањину (Тиањин, Кина). Животиње су биле смештене у условима контролисане светлости (12-х светло/тамни циклус), температуре (23-25 степен Ц) и влажности (45-55 процената) и добијале су стандардну исхрану и оглас за воду либитум. Укупно 48 САМП8 мишева је подељено у четири експерименталне групе (н=12/група): САМП8 модел мишева (М), САМП8 мишеви третирани ниским дозама ЦФ етанолног екстракта (ЦФ-Л, 387,5 мг/кг, интрагастрично), средњим дозама САМП8 мишева третираних ЦФ екстрактом етанола (ЦФ-М, 775 мг/кг, интрагастрично) и САМП8 мишева третираних високим дозама екстракта ЦФ етанола (ЦФ-Х,1550 мг/ кг, интрагастрично). Мишеви у САМРИ контроли (Цон, н=10) и САМП8 моделној групи (М) третирани су физиолошким раствором (0,9 процената). Сви мишеви су третирани орално током 1 месеца. Све експерименте на животињама одобрила је етичка комисија Универзитета кинеске медицине у Хенану и спроведена у складу са институционалним смерницама (Хенан, Кина број одобрења: ХАЦТЦМ-2018009060-19). Током експеримента, дошло је до смрти једног миша у свакој од Цон и М група, а два миша су умрла у ЦФ-Х групи.

Узимање узорака

На крају експеримента, мишеви су смештени појединачно у метаболичке кавезе за 12-х колекција урина. Мишеви су затим анестезирани изофлураном, а узорци крви су сакупљени ретро-орбиталним крварењем. Бубрези сваког миша су затим хируршки уклоњени и држани на 80 степени до анализе.

Ћелијска култура и ин витро студија

НРК-52Е ћелије купљене од Банке ћелија Кинеске академије наука (Шангај, Кина) су култивисане да би се истражио ефекат екстракта ЦФ на старење ћелија изазвано Д-галактозом (Д-гал, С11050, Иуание, Шангај, Кина). НРК-52Е ћелије су узгајане у Дулбеццо-овој модификацији Еагле-овог медијума Дулбеццо (ДМЕМ,12,100,046, Тхермо Фисхер, Массацхусеттс, УСА) са 10% феталног говеђег серума у ​​инкубатору на 37 степени Ц и у присуству процената , ЦО.ћелије су узгајане у 96-плочама са бунарима или 6-плочама са бунарима до 80-85 процента конфлуенције и затим третиране медијумом за раст који садржи различите комбинације лекова: Медијум плус Д-гал ( 20 мг/мЛ）, Медијум плус Д-гал плус ЦФ (10, 25,50, 100 уг/мЛ) или Медиј плус Д-гал плус мономерно једињење (10 μМ) током 48 х. Након тога, метил тиазолил тетразолијум( МТТ) тест је коришћен за откривање виталности ћелије, а бојење -галактозидазом је коришћено за посматрање старења ћелија.

Бојење галактозидазом повезано са старењем

Замрзнути бубрези мишева исечени на делове дебљине 10-μм и НРК-52Е ћелије су обојени галактозидазом повезаном са старењем (СА- -гал, Ц0602, Беиотиме Биотецхнологи, Шангај, Кина) пратећи протоколе произвођача.

Хистолошка анализа

Секције бубрега су фиксиране са 4 процента пуферованог параформалдехида, а 10-μм дебели парафински делови су обојени Массоновим трихромом (Г1006, Сервице, Вухан, Кина) и посматрани микроскопски. Плаво обојене области у Массоновим трихромом обојеним пресецима мерене су квантитативно из шест насумично одабраних поља и анализиране помоћу софтвера Имаге-Про Плус 6.0.

Биохемијска мерења

Узорци серума и хомогената бубрега су одмрзнути до собне температуре, а нивои супероксид дисмутазе (СОД, ЦСБ-Е08556м, Вухан Хуамеи, Вухан, Кина), глутатион пероксидазе (ГСХ-Пк, А005-1-2, Нањинг Јианцхенг, Нањинг, Кина), интерлеукин-1 (ИЛ-1, РК00006, АБцлонал, Вухан, Кина), фактор некрозе тумора- (ТНФ-, РК00027, АБцлонал, Вухан, Кина), азот урее (Ц{ {10}}, Нањинг Јианцхенг, Нањинг, Кина), креатинин (Цр, Ц011-2-1, Нањинг Јианцхенг, Нањинг, Кина) у серуму миша, укупни протеини у урину (Ц035-2-1, Нањинг Јианцхенг, Нањинг , Кина) у урину миша и нивоима експресије колагена типа И (Цол-И, МУ30364, Био-Свамп, Вухан, Кина), -актин глатких мишића (-СМА, МУ30359, Био-Свамп, Вухан, Кина), фибронектин (ФН, МУ30179, Био-Свамп, Вухан, Кина) у ткивима бубрега миша мерена су секвенцијално према протоколу произвођача комплета за анализу.

Имунохистохемијска анализа

Имунохистохемијска анализа је обављена рутинском методом [17]. Коришћена антитела су укључивала следеће: Внт4 (14371-1-АП, Протеинтецх, Чикаго, САД), -цатенин(17565-1-АП,Протеинтецх, Чикаго, САД), рецепторе ангиотензина ИИ типа 1 (АГТР1,{{ 7}}АП, Протеинтецх, Чикаго, САД), фактор 2 повезан са п-нуклеарним фактором еритроидом 2- (п-Нрф2, аб76026, Абцам, Цамбридге, УК), пц-Фос(аб27793, Абцам, Цамбридге, УК ), фактор раста везивног ткива (ЦТГФ, ГБ11078, Сервице, Вухан, Кина). Секције су посматране под микроскопом (Олимп, Токио, Јапан).цистанцхе досаге реддитИзмерите површину и интегрисану оптичку густину (ИОД) површине са експресијом преплануле боје помоћу софтвера Имаге-Про Плус 6.0 и израчунајте средњу оптичку густину (МОД, МОД=ИОД/област) за полу -квантитативна анализа.

Вестерн блот анализа

Вестерн блот тест је спроведен како је описано у претходној студији [18]. Укратко, ткива бубрега су хомогенизована у пуферу за лизу и квантификована коришћењем Брадфордовог комплета за анализу протеина (АР0197, Бостер Биологицал Тецхнологи, Вухан, Кина). Хомогенати су затим подвргнути електрофорези на натријум додецил сулфат-полиакриламидном гелу, пребачени на поливинилиден флуоридну мембрану и блокирани у пуферу за блокирање (4 процента немасног сувог млека) током 90 минута. Затим су инкубирани са примарним антителима (Внт4; ренин; АГТР1; п-Нрф2; пц-Фос; протеин 1 повезан са ЕЦХ налик Келцху (Кеапл, ГБ11847, Сервице-био, Вухан, Кина); -актин (АЦ026, Абцлонал, Вухан, Кина); и глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (ГАПДХ, АЦ033, Абцлонал, Вухан, Кина)) преко ноћи на 4 степена, након чега следи инкубација са одговарајућим секундарним антителом коњугованим са флуо-присутношћу 1 х на собној температури . Протеини од интереса су скенирани Одиссеи ИР скенером (ЛИ-ЦОР Биосциенцес, Небраска, САД), а интензитети сигнала су квантификовани коришћењем софтвера Имаге Студио. Нивои протеина су нормализовани у односу на -актин или ГАПДХ.

УПЛЦ-К-ТОФ-МС анализа за узорке бубрега

Бубрежна ткива су измерена и хомогенизована у ледено хладном физиолошком раствору (в/в=1:1). Затим је 1 мЛ ацетонитрила додат у 200 μЛ узорака хомогената ткива, након чега је уследила ултразвучна екстракција током 30 мин. Екстракт је центрифугиран на 12,000 г и 4 степена 10 мин. Супернатант је узет у бочицу за анализу. Хроматографско раздвајање је спроведено на течној хроматографији ултраперформансе (УПЛЦ) (Дионек УлтиМате 3000 Систем, Тхермо Сциентифиц, Массацхусеттс, УСА), са ЛЦ системом који се састоји од колоне Аццлаим РСЛЦ 120 Ц18 (2,2 μм, 2,1×100 мм; Тхермо Сциентифиц).предности екстракта цистанцхеМобилна фаза се састојала од растварача А (ацетонитрил) и воде са {{0}}.1 процента мравље киселине (Б). Раздвајање је извршено елуирањем градијента на следећи начин:10-70 проценат А од 0 до 3 мин,70-78 проценат А од 4 до 13 мин,78-90 проценат А од 14 до 15 мин, 90 процената -10 процената А од 15 до 16 мин и 10 процената А од 16 до 20 мин. Запремина ињекције тестног узорка била је 2 μЛ. Масена спектрометрија (МС) анализа је извршена коришћењем ЕСИ извора под следећим условима: капиларни напон у позитивном моду је био 3,5 кВ, а капиларни напон у негативном режиму био је 3,2 кВ. Притисак небулизатора је био 2,0 бара, температура сувог гаса је била 230 степени, а брзина протока је била 8 Л/мин.

Статистичка анализа

The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}}.05; за поређење између група коришћена је једносмерна анализа варијансе. АП вредност мања од 0,05 сматрана је статистички значајном.

Резултати

ЦФ је побољшао старење и фиброзу бубрега код САМП8 мишева

Да би се истражио ефекат ЦФ на бубреге САМП8 мишева, мерена је активност СА- -гал у бубрезима. На слици ла, активност СА- -гал у ткивима бубрега значајно је повећана у М групи (плаво појачање). Примена ЦФ-Л и ЦФ-М значајно је инхибирала активност -галактозидазе у бубрезима САМП8 мишева док побољшање ЦФ-Х није било значајно. Такође, индекс бубрега моделне групе био је значајно нижи од индекса контролне групе (сл. 1б, П<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>

ЦФ је побољшао функцију бубрега, оксидативни стрес и нивое упале код САМП8 мишева

Поред тога, испитивани су индикатори бубрежне функције сваке групе мишева, који су укључивали запремину урина код мишева током 12 х, нивое азота Цр и уреје у серуму и протеина у урину. Као што је приказано на слици 2а-д, нивои протеина у урину, Цр у серуму и азота урее у серуму у моделној групи били су значајно виши од оних у контролној групи (Сл. 2а, П<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">Чистанче Џингис канЗатим је истражено да ли ЦФ благотворно модулира оксидативни стрес и упалу у бубрезима брзо остарјелих мишева. Као што је приказано на слици 2е-х, нивои СОД и ГСХ-Пкин у бубрезима М групе били су значајно нижи од оних у Цон групи, а нивои ИЛ-1 су били значајно виши од оних у група Цон. Након третмана ЦФ, горе наведени показатељи су побољшани, посебно је бољи ефекат побољшања ЦФ-Л и ЦФ-М.

ЦФ је активирао Нрф2 пут у бубрезима САМП8 мишева

Ниво експресије п-Нрф2 је мерен у ткивима бубрега да би се испитало да ли је пут Нрф2 укључен у заштитни ефекат ЦФ (Слика 3а-ц) у овој студији. Ниво експресије п-Нрф2 значајно се смањио само у групи САМП8 (П<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">

ЦФ је ослабио Внт/-катенин/РАС сигналну активацију у бубрезима САМП8 мишева

У циљу даљег истраживања потенцијалног механизма ЦФ који има антифиброзни ефекат. Локализација протеина је извршена помоћу имунохистохемије. Као што је приказано на слици 4а, ниво експресије Внт4 и

-катенин је индукован претежно у бубрежним тубуларним ћелијама. Слични резултати су примећени када су процењени АГТР1, циљеви низводног пута Внт сигнализације (слика 4а). Након тога, ниво експресије протеина је квантификован, а резултати су показали да су протеини Внт4, -катенин, ренин и АГТР1 акумулирани у ткиву бубрега мишева у моделној групи, док је ЦФ значајно инхибирао те промене (Слика 4б-ф ). Поред тога, ниво експресије ЦТГФ-а је такође лоциран и квантитативно анализиран. У складу са горе наведеним резултатима, ЦТГФ је углавном био експримиран у бубрежним тубулима, а ЦФ је значајно инхибирао активност ЦТГФ (Слика 4д г).

ЦФ и његова једињења инхибирали су старење НРК-52Е ћелија изазвано Д-гал

НРК-52Е ћелије изазване Д-галом коришћене су за скрининг одређених активних састојака у ЦФ, да би се утврдила материјална основа за лечење сенилних бубрега екстрактом ЦФ. Резултати су показали да ЦФ повећава виталност ћелија на начин који зависи од дозе и једињења

СДЦ-0-14,16 и СДЦ-1-8 изоловани из ЦФ су имали боље ефекте на пролиферацију ћелија. Осим тога, 25 уг/мЛ ЦФ и једињења СДЦ-0-14,16 и СДЦ-1-8 сви су показали ефекат инхибиције активности -галактозидазе (Сл.5).

ЦФ побољшана ПЦА анализа ткива бубрега код САМП8 мишева Анализа главних компоненти (ПЦА) је извршена да би се истражили ефекти ЦФ на САМП8 мишеве. Као што је приказано на слици 6а, постојало је очигледно груписање између контролне и моделне групе (Р2Кс=0.542; К2=0.38), што сугерише да су ендогени метаболити САМП8 мишева били другачији од САМР1 мишева, што доводи до њиховог одступања од САМР1 групе. Као што је приказано на слици 6б, различите ЦФ групе су се такође групирале у различите класе из контролне и моделне групе, а ЦФ групе су се приближиле контролној групи, што указује да

ендогени метаболити САМП8 мишева са интервенцијом ЦФ били су слични онима код САМР1 мишева.

Дискусија

Старење игра важну улогу у напредовању ЦКД [19]. Како фиброза ЦКД напредује, старе ћелије експримирају и луче профибротичке факторе (ТГФ-, ЦТГФ и тако даље) и проинфламаторне факторе (ИЛ-1, ИЛ-6, ТНФ- и тако даље ), који су секреторни фенотипски фактори повезани са старењем, чиме се убрзава бубрежна фиброза [20, 21]. Тренутно је традиционална кинеска медицина постигла добре резултате у лечењу реналне фиброзе са мање нежељених ефеката [22]. Ова студија је истраживала интервентне ефекте екстракта ЦФ на фиброзу бубрега код САМП8 мишева. Сој миша одабран за ову студију био је САМП8, који је развијен на основу животног века, старења и патолошких фенотипских оцена АКР/ мишева и био је модел убрзаног старења искључиво генетског порекла [23,24]. Студије су показале да промене у бубрежној патологији САМП8 мишева (9 месеци) укључују тубулоинтерстицијалну фиброзу и фокалну сегменталну гломерулосклерозу [25]. Утврђено је да је фиброза бубрега код САМП8 мишева повезана са узрастом [6]. Стога смо тестирали активност -галактозидазе и

ниво фиброзе бубрега код САМП8 мишева и открили да ЦФ-Л и ЦФ-М побољшавају фиброзу бубрега и активност -галактозидазе код САМП8 мишева (Сл.1). Такође смо тестирали излучивање урина код мишева. У складу са претходно објављеним студијама које указују да ЦФ добијен два различита процеса има диуретичке ефекте [13], екстракт значајно повећава запремину урина код САМП8 мишева. Такође, ова студија је показала да суплементација ЦФ побољшава бубрежну функцију, активност антиоксидативних ензима и нивое инфламаторних фактора код САМП8 мишева (Сл.2).

Кеап1-Нрф2 систем је привукао пажњу многих научника последњих година због својих антиоксидативних и антиинфламаторних својстава. Његов фармаколошки потенцијал у лечењу бубрежних болести је опширно проучаван у неклиничким и клиничким студијама [26]. Нрф2 је главни регулатор транскрипције за гене повезане са редокс статусом и антиоксидативним ефектима [27]. Студије су показале да је фосфорилација потребна за активацију Нрф2 и индукцију циљног гена [28]. Активација Нрф2 је побољшала напредовање ЦКД спречавањем оксидативног стреса и одржавањем ћелијске редокс хомеостазе [29]. Као кључни фактор транскрипције, Нрф2 игра кључну улогу у одбрани од оксидативног стреса тако што регулише низводне антиоксиданте и ензиме за детоксикацију [30]. Ким и др. известили су да ресвератрол, као моћан активатор Нрф2, ублажава прогресивно оштећење бубрега повезано са старењем [31]. У овој студији, ЦФ је побољшао слабљење Нрф2 у бубрезима САМП8 мишева без утицаја на ниво експресије Кеапл, што сугерише да ЦФ сирови екстракт може побољшати оксидативно оштећење у бубрезима активирањем Нрф2 пута (слика 3).

Бубрежна фиброза се карактерише прекомерним таложењем екстрацелуларног матрикса (ЕЦМ) што доводи до стварања ожиљака у бубрежном паренхима [32]. Сматра се да је трансформишући фактор раста (ТГФ-) кључни цитокин у хиперактивацији фибробласта [33, 34]. Наравно, циљање само на ТГФ-сигнални пут није довољно за смањење бубрежне фиброзе. Неке студије су показале да су ЦТГФ, Внт/-катенин, систем ренин-ангиотензин, оксидативни стрес и тако даље, умешани у фиброзу бубрега [35-37]. Внт/-катенин је еволутивно очуван сигнални пут укључен у регулацију хомеостазе ткива, развој органа и поправку повреда[38]. Цистернас и др. расправљали су о профиброзном ефекту Внт сигнализације иу скелетним мишићима и у бубрезима [39]. Све више доказа је показало да сигнални пут Внт/-катенина игра кључну улогу у регулисању развоја и прогресије бубрежних фиброзних лезија након повреде [40-42]. Сигнал Внт/-цатенин је релативно тих у бубрезима здравих одраслих особа и активира се када су бубрези подвргнути различитим врстама оштећења [43].

Код сисара, породица Внт има најмање 19 чланова породице критичних за развој бубрега. И најмање 15 од ових чланова породице је различито регулисано у бубрезима који старе, укључујући Внт4 [6]. Резултати ове студије су показали да је ниво експресије Внт4 протеина у бубрезима САМП8 мишева био значајно виши него код САМР1 мишева, што је верификовано и Вестерн блот и имунохистохемијским анализама (сл. 4а, д и ф). Случајно, ниво експресије -катенин протеина је такође повећан. Такође, и Внт4 и -катенин су експримирани у ћелијама епитела бубрежних тубула, што је откривено имунохистохемијском анализом (сл. 4а и ф). Внт/-катенин је изазвао фиброзу бубрега индукујући више фиброгених гена као што су компоненте РАС, матрикс металопротеиназа-7 (ММП-7), инхибитор активатора плазминогена 1 (ПАИ-1) и пуж [37 ]. Зхоу ет ал. описао је Внт/-катенин као главни узводни регулатор, који контролише експресију свих тестираних компоненти РАС у бубрезима [44]. Зхоу и сарадници су користили модел пацова 5/6 нефректомије (5/6 НКС) да би показали нивое експресије главних компоненти РАС у мозгу и бубрезима, као што су ангиотензиноген, ензим који конвертује ангиотензин и ангиотензин ИИ АТ{{25 }}рецептор је значајно повећан. Повећани ниво експресије био је инхибиран централним блокатором Внт, који је био адено-повезани вирусни вектор који је прекомерно експримирао ДКК1 ген [45]. Слично томе, ова студија је открила да је АГТР1 и даље експримиран у бубрежном тубуларном епителу, а нивои експресије ренина и АГТРл у ткивима бубрега САМП8 мишева били су значајно већи од оних код САМР1 мишева (сл. 4а и дг). Ови резултати су показали да је сигнални пут Внт/-цатенин/РАС активиран у бубрезима САМП8 мишева, а ЦФ је ефикасно инхибирао активацију овог пута.

ЦТГФ има више биолошких функција, укључујући промовисање митозе хемотактичких ћелија, индуковање адхезије и промоцију пролиферације ћелија и синтезе ЕЦМ [35,46]. ЦЦН2(ЦТГФ) је модулисао Внт сигнализацију везивањем за протеин 5/6 који је повезан са рецептором липопротеина ниске густине (ЛРП5/6) да би даље посредовао у фибрози [39, 47]. Друге студије су користиле утишавање гена да би откриле и потврдиле да Нрф2 регулише Внт пут регулацијом нивоа експресије ЦТГФ-а, утичући на интерстицијску болест бубрега. Такође, Нрф2 је регулисао ниво транскрипције ЦТГФ углавном преко ЦТГФ транскрипционог регулатора ц-Фос [48]. Имунохистохемијска анализа је открила да су ЦТГФ и пц-Фос експримирани углавном у бубрежним тубуларним епителним ћелијама, а пц-Фос су такође распоређени у гломерулима. Квантитативна анализа је показала да ЦФ инхибира нивое експресије оба протеина (слике 3б и е и 4а и ц). Коначно, ПЦА анализа је коришћена да се даље потврди да је ЦФ побољшао оштећење бубрега код САМП8 мишева (Слика 6). Ова студија је пружила доказе да ЦФ не само да је активирао Нрф2 сигнализацију, већ се такође ослањао на Нрф2 да уравнотежи оксидативни стрес и упалу, инхибирао Внт/-цатенин/РАС сигнализацију и побољшао старење бубрега и бубрежну фиброгенезу. Међутим, такође смо открили недоследно побољшање у ефекту ЦФ на Массоново и СА{27}}гал бојење у овом експерименту. Нагађа се да би то могло бити због недоследног напредовања бубрежног старења и бубрежне фиброзе код САМП8 мишева. Степен старења бубрега код мишева у овом експерименту може бити озбиљнији од фиброзе. Стога, побољшање ефекта ЦФ-Х на старење бубрега код САМП8 мишева није било тако очигледно као код бубрежне фиброзе.

Као редукциони моносахарид, Д-галактоза се широко користи код различитих болести повезаних са старењем ин виво и ин витро. Утврђено је да Д-гал изазива старење и повреде у НРК-52Е ћелијама [49], изазива старење проксималних тубуларних епителних ћелија људског бубрега (ХКЦ-8 ћелије) и повећава нивое експресије два бубрежна протеини маркери фиброзе ФН и а-СМА [6]. У овој студији, Д-гал је коришћен за индукцију НРК-52Е ћелија ин витро. Користећи МТТ тест и бојење -галактозидазом за откривање једињења изолованих из ЦФ, откривено је да СДЦ-0-14,16 и СДЦ-1-8 побољшавају виталност ћелија изазвану Д-гал и инхибирају Д-гал-индуковану старење ћелија (слика 5). Ово сугерише да СДЦ-0-14,16 и СДЦ-1-8 могу бити материјална основа за ЦФ за одлагање старења бубрега. СДЦ-1-8 је један од фенилетаноидних гликозида. Утврђено је да фенилетаноидни гликозиди продужавају животни век Цаенорхабдитис Елеганс [50], са анти-старењем, [51] и неуропротективним ефектима [52-54]. Ово даје правац за нашу накнадну студију о фармаколошким ефектима ЦФ.

Закључци

У закључку, ин виво студије су показале да ЦФ смањује фиброзу бубрега код старијих мишева. Неки потенцијални активни састојци су пронађени ин витро експериментима. Ови налази су пружили фармаколошку подршку за лечење болести бубрега коришћењем ЦФ и смер за даља истраживања о активним састојцима ЦФ.

Овај чланак је преузет из Цао ет ал. БМЦ комплементарна медицина и терапије (2022) 22:52