Апстрактан:Основни циљ овог рада је да се диференцијалном анализом процене различите биолошке активности садржаја укупних фенола у алкохолним екстрактима три врсте урмених палми осетљивих или отпорних на Фусариум окиспорум. сп Албидинис. Овде су доказани стилбенски производи са антиоксидативним и биоактивним капацитетима у отпорној сорти Таабдоунт (ТААР). Штавише, метанолна фракција сорте урме отпорне на ТААР садржи значајан производ, одређен ЛЦМС/МС и 1Х, 13Ц НМР, који припада породици хидрокси стилбена, који показује антиоксидативне капацитете, инхибира активност тирозиназе печурака и активира и има заштитни ефекат на оштећење изазвано хипохлоритом у 20С протеазому ћелија старих хуманих дермалних фибробласта. Све у свему, садашњи резултати показују да хидрокситолуен присутан у отпорној Пхоеник дацтилифера Л. треба проучити како би се разумео начин на који стилбен може да испољи способност против старења.

Цистанцхе гликозид такође може повећати активност СОД у ткивима срца и јетре и значајно смањити садржај липофусцина и МДА у сваком ткиву, ефикасно хватајући различите реактивне радикале кисеоника (ОХ-, Х₂О₂, итд.) и штитећи од оштећења ДНК изазваног од стране ОХ-радикала. Цистанцхе фенилетаноидни гликозиди имају јаку способност уклањања слободних радикала, већу редукциону способност од витамина Ц, побољшавају активност СОД у суспензији сперме, смањују садржај МДА и имају одређени заштитни ефекат на функцију мембране сперме. Цистанцхе полисахариди могу да појачају активност СОД и ГСХ-Пк у еритроцитима и плућним ткивима експериментално остарелих мишева изазваних Д-галактозом, као и да смање садржај МДА и колагена у плућима и плазми и повећају садржај еластина. добар ефекат чишћења на ДППХ, продужава време хипоксије код старијих мишева, побољшава активност СОД у серуму и одлаже физиолошку дегенерацију плућа код експериментално сенесцентних мишева Са ћелијском морфолошком дегенерацијом, експерименти су показали да Цистанцхе има добру антиоксидативну способност и има потенцијал да буде лек за превенцију и лечење болести старења коже. Истовремено, ехинакозид у Цистанцхе-у има значајну способност да уклони слободне радикале ДППХ и има способност да уклони реактивне врсте кисеоника и спречи деградацију колагена изазвану слободним радикалима, а такође има добар ефекат поправљања оштећења ањона слободних радикала тимина.

Кликните на роу цонг ронг бенефиције

【За више информација:george.deng@wecistanche.com / ВхатАпп:86 13632399501】

Кључне речи:Пхоеник дацтилифера Л.; Фусариум окиспорум. сп Албидинис (ФоА); антиоксидативне активности; активност против тирозиназе; активација протеасома; ЛЦ-МС/МС анализа; деривати стилбена

1. Представљање

Датум палме (Пхоеник дацтилифера Л.) је вишегодишња једносупница из породице Арецацеае. Ово дрво је од највеће важности у животима сахарске популације јужног и југоисточног Марока, како економски тако и социјално. Бајоудова болест, коју изазива земљишна гљива Фусариум окиспорум ф. сп Албидинис (ФоА) [1], значајно је смањио принос мароканских урминих палми последњих година [2]. Процењује се да је ФоА нестала из две трећине мароканског наслеђа феницикола, али наставља да уништава између 4,5 и 12 процената најквалитетнијих комерцијалних сорти урминих палми [2]. Учињени су бројни напори у борби против ове болести и објашњењу неких механизама одбране урмене палме [3]. Прве студије о могућим одбрамбеним механизмима урмене палме истакле су улогу фенолних једињења и антиоксидативног капацитета у толеранцији на ФоА [4,5]. Биохемијска анализа отпорних и осетљивих сорти фенолних једињења корена била је прва биохемијска студија која је разјаснила корист одбрамбених механизама урмене палме. Заиста, литература указује да су сорте отпорног корена богатије 5-кафеоил шикиминском киселином и њеним изомерима положаја од сорти са осетљивим кореном [5]. Ова једињења су ефикасно показала потенцијалну антифунгалну активност ин витро против ФоА [6].

Велики капацитет природних антиоксиданата да уклоне слободне радикале је оно што покреће њихову све већу популарност у прехрамбеним и медицинским студијама [7–10].

На пример, реактивне врсте кисеоника су отежавајући фактори у ћелијским повредама и процесима старења [11] и стога су повезани са многим болестима. Као резултат тога, молекули антиоксиданса могу помоћи људском здрављу спречавањем дегенеративних болести и успоравањем последица старења [12]. У овој студији, заинтересовани смо за способност антиоксиданата да промовишу активацију 20С-протеазома и заштите од његовог оксидативног оштећења. Протеасом заиста доприноси одржавању ћелијске хомеостазе омогућавајући ћелијски процес чишћења оштећених протеина и контролисано уништавање краткотрајних протеина [13]. Стога се активирање протеазома антиоксидансима може показати као нова стратегија против старења [14]. Штавише, овај рад има за циљ да истражи потенцијал садржаја фенола резистентних корена на ФоА као активних биолошких једињења.

2. Материјал и методе

2.1. Плант Сампле

Студија је спроведена за сваки узорак са материјалом од 10 одрасле сорте урме (Пхоеник дацтилифера Л.) узгојених са контаминираних или неконтаминираних парцела које се налазе у Палмариа Фигуиг, југоисточни Мароко. Главни корени (укључујући њихове коренове који дишу ваздух) имају пречник од 0,5 до 2 цм осетљивих сорти, као што су цхарас Боуффегоус инфицед (БИ) или оне неинфициране (БНИ). Поред тога, сакупљена је сорта Таабдоунт (ТААР) отпорна на ФоА, а листови две лековите биљке коришћени су локално као филактички третман против ФоА. Поред тога, рузмарин (Р, Росмаринус оффициналис) и шипак (Г, Пуница гранатум Л.) [15] такође су сакупљени у истој неконтаминираној парцели при чему су анализирани и коришћени као контрола. Узорци су узимани током два периода у години, у септембру и крајем јануара (између 2013. и 2015. године), и херметички чувани на собној температури. Пошто су узорци добијени од палмера, они су прописно сертификовани (идентификација и класификација) од стране министра пољопривреде Марока [16].

2.2. Припрема екстракта

Након дуготрајног прања водом, корење или листови су осушени у хладу, а затим уситњени у блендеру. За сваки узорак (БИ, БНИ, ТААР, Р и Г), 10 мЛ метанола је додато у 1 г сувог материјала и затим остављено да се меша 4 х на собној температури. Затим су филтрирани и упарени на 37 ◦Ц помоћу ротационог испаривача. Суви екстракт је стављен у раствор метанола у коначној концентрацији од 10 мг/мЛ или 50 мг/мЛ (касније коришћен за испитивање биолошких активности ин витро). За тестове биолошке активности извршене су три независне екстракције за сваки узорак.

2.3. Биолошке активности

2.3.1. Фенолни садржај и антиоксидативна активност

Поступак који су описали Нацоулма ет ал. је примењен за процену укупног садржаја фенола и укупног садржаја флавоноида у сваком екстракту [17], са коначном адаптацијом запремине од 200 µЛ за коришћење на читачу микроплоче. Апсорбанца на 760 нм и 510 нм, респективно, одређена је на слепо од метанола. Стандардне калибрационе криве галне киселине (0–300 мг/Л) (и=0.0083к плус 0,9106, р2=0.978) и кверцетина (0–100 мг/Л) (и {{14 }}.0008к плус 0,0597, р2=0.994), респективно.

Користећи 1,1-дифенил-2-пикрилхидразил слободни радикал, испитана је активност уклањања антиоксиданса (ДППХ). Коришћењем коначног прилагођавања запремине од 300 µЛ и 275 µЛ, респективно, да би се користио читач микроплоче, процењен је капацитет екстраката да смање гвожђе (ИИИ), као што су описали Нацоулма ет ал. [17]. У поређењу са слепим метанолом, апсорбанца је мерена на 517 нм и 700 нм, респективно. Затим, користећи следећу једначину, активност уклањања слободних радикала сваког раствора је процењена као проценат инхибиције:

Стандардна калибрациона крива је добијена коришћењем аскорбинске киселине ({{0}}–100 мг/Л) као стандарда антиоксиданса (и=0.0014к плус 0.0875, р2=0.998).

2.3.2. ФоАМиц хелијумски тест инхибиције раста

Уз малу модификацију, метод који су описали Нери ет ал. [18] је коришћен за одређивање степена до којег чисте хемикалије инхибирају раст ФоА мицелија. 7-дана дана стара култура ФоА имала је пет милиметара мицелијских дискова постављених на Петријеве посуде са ПДА медијумом допуњеним чистим хемикалијама наведеним изнад у 50, 75 и 100 µг/мЛ. Плоче су инкубиране 5 дана на 28 ◦Ц. Просечан пречник колоније мерен под два права угла је коришћен за процену инхибиције раста ФоА мицелија. Сваки третман се састојао од три теста коришћењем три различита соја ФоА: ФоА 41818, ФоА 41814 (БЦЦМ, Белгија) и ФоА Лоцал (Палемераие оф Фигуиг, Мароко), као и негативне контроле користећи медијум који није додат.

2.3.3. Виабилност ћелија и активност 20С протеазома

Коришћени су нормални људски дермални фибробласти од {{0}}годишњег мушкарца (НХДФ) (Промоцелл, Хајделберг, Немачка) при чему су ћелије постављене на густину од 100,{{3 }} ћелија/мЛ у РПМИ 10 процената са додатком 10 процената (в/в) ФБС, 1 проценат (в/в) Л-глутамина, 100 јединица/мЛ пеницилина и 100 µг/мЛ стрептомицина. Држани су у белим или провидним 96-плочама са микро-јажицом 24 сата на 37 ◦Ц у инкубатору са влажном средином од 5 процената ЦО2. За тест активности протеазома, као и за процену заштитних ефеката на оштећење изазвано хипохлоритом, ћелије су затим третиране тест материјалима (чисто једињење од 5 до 50 µг/мЛ, позитивна контрола на 0,5 и/или 1 µМ, и метанолних биљних екстраката од 15 до 50 µг/мЛ) током 24 х са максимално 0,3 процента ДМСО у коначној концентрацији, истовремено, без промена, у односу на негативну контролу. Истраживање заштитних ефеката ТААР екстракта или чистих једињења на активност протеазома значило је да су ћелије фибробласта касније подвргнуте 50 µМ ОЦл− током 35 минута (одабрано као оптимално, без токсичности за ћелије, оксидант-инхибитор стања 20С протеазома) [19]. Следеће експерименталне фазе су завршене методологијом добављача (Протеасоме-Гло Цхимотрипсин-Лике Целл-Басед Ассаи, Промега Цорпоратион, УСА): Прво, истовремени експеримент одрживости ћелија који користи кристално љубичасту колориметрију или МТТ тестове који су спроведени под апсолутно сличним условима је коришћен за нормализацију овог теста биолуминисценције ћелија. Приказане су стандардне девијације и просечна флуоресценција у три примерка из два одвојена теста (н=6). Сва мерења и независни експерименти (н=2) изведени су два пута.

2.3.4. Инхибиторни ефекат на тирозиназу гљива без ћелија

Да би се испитао ефекат на активност ензима, испитивани материјали (чисти антиоксиданти или метанолни биљни екстракти) су претходно инкубирани са ензимима у фосфатном пуферу на собној температури. Укратко, у 96-микроплоча са 100 мЛ воденог раствора тирозиназе печурака (20 јединица). Током 40 минута, смеша за испитивање је инкубирана на 25 ◦Ц. После инкубације, ниво производње допахрома у реакционој смеши је мерен спектрофотометријски на 492 нм [20]. Стандардна калибрациона крива је нацртана коришћењем галне киселине (0–1000 µг/мЛ) (и=-0,087 × плус 0,45; р2=0,97). Свако независно мерење и експеримент (н=2) изведени су два пута.

2.4. Процедуре анализе, изолације и објашњења структуре

Млевени корен (20 г) је екстрахован са 200 мЛ метанола, мешан 24 х на собној температури, филтриран, центрифугиран на 10,000× г 15 минута, а затим упарен на 35 ◦Ц помоћу ротационог уређаја. апарат за вакуумско испаравање. Сирови екстракт је разблажен са 20 мЛ дестиловане воде, поново екстрахован са 2 × 20 мЛ етил ацетата, а затим концентрован коришћењем ротационог система за вакуумско испаравање на 35 ◦Ц. Главни производ је пречишћен препаративном ХПЛЦ коришћењем Ватерс Ц18 колоне (СимметриПреп 150 × 19 мм, величина честица 7 µм) са истим условима ЛЦ градијента који су коришћени горе и брзином протока од 5 мЛ/мин. Пик на собној температури био је између 38,8 и 40,8 мин, сакупљен између 39,2 и 40,2 мин; укупна запремина колекције је лиофилизована да би се добило 27 мг једињења. МС и НМР 1Х и 13Ц су га затим идентификовали.

Анализе су обављене са системом брзе резолуције ЛЦ 1200 серије помоћу детектора диодног низа (ДАД) који се користи за праћење УВ спектра на 320 нм (Агилент Тецхнологиес, ​​Санта Цлара, Калифорнија, САД). Одвајање једињења је изведено на Бецкман Ц18 колони (УЛТРАСПХЕРЕ 250 мм × 4,6 мм, величина честица 5 µм) коришћењем градијента од 47 минута 10 мМ амонијум ацетата/0,2 процента мравља киселина у води (в/в), пХ 2,9 ({{ 13}}растварач А) и мешавина ацетонитрила/метанола 30/70 (=растварач Б). Брзина протока је била 0,8 мЛ/мин, а растварач Б је повећан са 5 на 35 процената за 45 минута и поново еквилибрисан током 2 минута. У серији са ДАД, ЕСИ-КТОФ 6520 серија (Агилент Тецхнологиес, ​​Санта Цлара, Калифорнија, САД) је коришћена за МС високе резолуције и циљане тандем МС (МС/МС) анализе. Спектри су добијени у режимима аквизиције негативне и високе резолуције (4 ГХз).

1Х НМР и 13Ц НМР спектри су снимљени на Брукер Аванце 300 спектрометру који ради на 300 МХз. Слободни индукциони распади су обрађени са МестреНова 5.3.2 НМР пакетом из МестреЛаб Ресеарцх СЛ.

2.5. Статистичка анализа

Сви независни експерименти су изведени у три примерка. Сви подаци су представљени као средње вредности ± СД. Користећи верзију 6 програма ГрапхПад Присм, резултати су анализирани коришћењем непараметарског Крускал-Волисовог теста заједно са Дун-овим тестом вишеструког поређења. П-вредности 0.05 и ниже се сматрају значајним.

3. Резултати и дискусија

3.1. Укупан садржај фенола и флавоноида у метанолним екстрактима

Због својих редокс својстава, откривено је да биљна фенолна једињења имају различите биолошке утицаје, укључујући антиоксидативну активност [21]. Табела 1 приказује укупан садржај фенола у екстрактима корена метанола (500 µг/мЛ) осетљивих сорти гхаграс Боуффегоус инфицираних (БИ) и неинфицираних (БНИ) ФоА или отпорних као Таабдоунт (ТААР). Њихова концентрација је варирала од 171 ± 14 до 253 ± 47 мг екв. галне киселине/г. Највећа количина ових једињења пронађена је у сорти БНИ, док је најмања концентрација била у метанолном екстракту корена БИ. Број флавоноида у овим истим екстрактима (Табела 1)) варирао је од 240 ± 25 до 406 ± 66 мг кверцетина екв./г, а, још једном, највећа количина је приписана сорти БНИ. Постоји губитак од приближно 1/3 количине укупног броја полифенола и флавоноида између неинфицираних (БНИ) сорти и инфицираних (БИ) или резистентних (ТААР) сорти на ФоА. Стога је вредно пажње проверити како губитак једињења, описаних као критичан за антиоксидативни капацитет биљке, може утицати на биолошке активности за које смо заинтересовани.

3.2. Антиоксидативни потенцијал метанолних екстраката

Активност уклањања радикала ДППХ је метода која се широко користи за скрининг антиоксидативне активности биљних екстраката [22]. Овај тест утврђује да ли су антиоксидативне хемикалије које се налазе у екстрактима способне да уклоне стабилне радикалне врсте ДППХ. Експериментални подаци (Слика 1) откривају да ће сви метанолни екстракти (на 100 или 500 µг/мЛ) вероватно имати ефекат уклањања слободних радикала са највећом активношћу чишћења ДППХ примећеном у коренима ТААР (87,0 проценат инхибиције ДППХ). Чини се да антиоксидативна активност не зависи од присуства укупне количине полифенолних или флавоноидних једињења. Међутим, боља активност метанолних екстраката корена ТААР-а може бити последица више компоненти које донирају водоник садржаних у екстракту.

Редукциона снага се оцењује способношћу метанолног екстракта да трансформише Фе (ИИИ) у Фе (ИИ). Ова способност редукције Фе (ИИИ) може се приписати броју и положају хидроксилних група присутних у фенолним једињењима и њиховом капацитету да донирају водоник [23]. У табели 2 приказана је редукциона активност метанолних екстраката наших биљних узорака у поређењу са аскорбинском киселином као стандардом. Метанолни екстракти корена ТААР садрже високе редукције (95 ± 1 мг екв. аскорбинске киселине/г), док је најмањи садржај добијен из екстракта корена БНИ (27 ± 2 мг екв. аскорбинске киселине/г).

За корелацију добијених резултата извршена је регресиона анализа (коефицијент корелације (Р)). Пронађене су значајне линеарне корелације између укупног садржаја фенола и флавоноида (Р {{0}}}.849, п < 0.05) и између ДППХ и теста смањења снаге (Р=0. 816, п < 0,05), али их није било између садржаја фенола или флавоноида у метанолним екстрактима и њихових антиоксидативних активности. Коначно, сви метанолни екстракти су показали значајну антиоксидативну активност против активности уклањања радикала ДППХ и теста смањења снаге, али ове антиоксидативне активности изгледа нису повезане са укупним садржајем фенола или флавоноида. Стога, ови налази имплицирају да је одређена врста хемикалије, а не количина фенолних или флавоноидних једињења која се налазе у нашим разноврсним екстрактима, највероватније одговорна за антиоксидативну активност биљних екстраката који се разматрају. Неколико фенолних компоненти које су претходно описане и које су високо активне особе такође могу имати утицај на антиоксидативну активност биљних екстраката: независно од њихове концентрације, фенолна једињења која се налазе у одлежалом црвеном вину могу показати различита антирадикална својства повезана са њиховим структурним аспектима [ 24].

Сорта отпорна на ТААР ФоА показује највећу антиоксидативну активност међу различитим врстама урминих палми. Позивајући се на литературу, развој резистенције код ових конкретних урминих палми може се приписати повећању количине различитих позиционих изомера кафеоил шикиминске киселине [5].

3.3. Активност тирозиназе гљива

Активност тирозиназе дифенолазе из печурака катализује оксидацију два деривата допахинона што доводи до синтезе меланина. Резултати представљени у табели 3 показују способност једињења присутних у метанолним екстрактима ТААР, БИ и БНИ да ометају хидроксилацију л-ДОПА кроз инхибицију активности тирозиназе печурака. Штавише, ови резултати показују да је метанолни екстракт ТААР-а статистички активнији од екстраката БИ (п < 0.05) и БНИ (п < 0,05) на активност тирозиназе печурака. Дакле, чини се да капацитет екстракта корена палминих урми да инхибира активност тирозиназе прати исти тренд као и код антиоксидативних способности.

Тирозиназе су првенствено повезане са пигментацијом коже, очију и косе. Заиста, тирозиназе су ензими меланогенезе укључени у прве кораке биосинтезе меланина, а меланин је повезан са заштитом од ултраљубичастог (УВ), сунчевог или гама зрачења, смањеном ћелијском осетљивошћу и отпорношћу ћелијског зида на хидролитичке ензиме [20]. Супротно томе, прекомерна производња меланина може играти улогу у аномалијама коже или озбиљнијим болестима као што је рак (нпр. меланом), а вишак допахинона може довести до неуродегенеративне болести (нпр. Паркинсонове болести) [20,25]. Штавише, пријављено је да меланогенеза производи водоник пероксид и друге РОС, излажући људске меланоците високим нивоима оксидативног стреса [26]. Неколико природних антиоксидативних једињења (феноли, флавоноиди и други) добијени из биљака инхибирали су активност тирозиназе фенолазе [27,28]. Овде се чини да екстракт ТААР садржи једињења која су подложна инхибицији старења коже и меланогенезе.

3.4. Протеазомска активност метанолних екстракта палминог корена

Пријављено је да повишени нивои 20С протеасома доводе до повећане толеранције на оксидативни стрес [13]. Због тога је испитивана регулација активности протеазома екстрактима корена сорти БИ, БНИ и ТААР. Измерена активност 20С протеазома је повезана са активношћу налик на химотрипсин (ЦТ-Л) у ћелијама које су старе НХДФ (видети Материјали и методе). Као што је илустровано на слици 2А, ћелије третиране са 50 µг/мЛ метанолних екстраката током 24 х показале су значајну активацију ЦТ-Л за БИ и ТААР екстракте и инхибицију за БНИ без стварања више од 30 процената токсичности ћелија. Екстракт корена ТААР-а показао је ангажовану активацију протеазома у поређењу са активацијом од 1 µМ липоичне киселине (Цт плус) (212 процената и 248 процената, респективно). Протеазом је цилиндрични протеиназни комплекс који садржи језгро од четири наслагана прстена одговорна за уклањање абнормално деградираних (26С) протеазома и оксидативно (20С протеолитичко језгро комплекса) оштећених протеина (Циецхановер, 1998). Као што је представљено у Хванговом раду [29], дисфункција протеазома може допринети старењу људске коже. Заиста, показало се да старење и репликативне старе ћелије имају смањену активност протеасома, као и нивое протеина у подјединицама протеасома. Чињеница да се и оксидовани и/или оштећени ћелијски протеини чешће акумулирају у овим ћелијама сугерише да је убиквитин-протеасомски пут деградације протеина умешан у унутрашње процесе старења. Слике 2Б и Ц показују способност ТААР метанолног екстракта да заштити ћелије старе НХДФ од инхибиције активности 20С протеазома ОЦл− оксидантом. Заиста, ОЦл− оксидант инхибира са 50 процената протеазомску активност контролних ћелија (Цт), док највећи 20С-протеазомски активатор (липоична киселина на 1 µМ, Цт плус) са више од 50 процената активности инхибиције не успева да преокрене инхибицију активности 20С протеазома од стране ОЦл−, док се чини да све друге тестиране концентрације (15, 50 и 75 µг/мЛ) ТААР метанолног екстракта поништавају ову инхибицију (0 до 19 процената инхибиције). Ови резултати сугеришу да екстракти корена ТААР-а могу да садрже молекуле који би могли да одложе старење коже не само повећањем активности протеазома, већ и спречавањем инхибиционих ефеката оксидационих агенаса. Међу овим молекулима је највероватније присутна кофеоил шикимична киселина, као и друга једињења. Даље, ЛЦ-ДАД-МС (МС) и НМР анализе су спроведене да би се идентификовала главна једињења екстраката и о њима се говори у следећем одељку.

3.5. Спецтрометриц Аналисес

3.5.1. ЛЦ-ДАД-МС анализа метанолних екстраката

Компаративна студија корена урмене палме није открила квалитативне разлике, али су, уместо тога, у извесном степену примећене полу-квантитативне разлике (у ДАД и МС хроматограмима) између сорти (Слика 3А, Д). Заиста, садашњи резултати не дозвољавају везу између отпорности урминих палми на повећање количине различитих позиционих изомера кофеоил шикиминске киселине јер резистентна сорта (ТААР) показује најмању релативну заступљеност ових једињења (Слика 3Ц). Сва три позициона изомера кафеоил шикиминске киселине (м/з=335.0768 са грешком од 1,2 ппм) идентификована су њиховим МС/МС спектрима (слика С6) са фрагментом на м/з 179,0340, што одговара фрагменту кофеинске киселине А (Ц9Х7О4) и фрагменту на м/з 135,0443, што одговара декарбоксилацији кафеинске киселине (Ц8Х7О2). Без обзира на то, чини се да се још једно једињење које не одговара кофеоил шикиминским киселинама (слика 3Ц) и чије је време задржавања 29 минута са м/з=259.0607 (или 373,0543 за ТФА адукт), јасно разликује између различитих сорти. (Слика 3Д). Разлика у акумулацији овог једињења у корену осетљивих и отпорних сорти (0,135 процената), са односом око 1:35 (из м/з=259.06, МС подаци), могла би да објасни истакнути биолошки активности примећене за метанолни екстракт овог корена.

【За више информација:george.deng@wecistanche.com / ВхатАпп:86 13632399501】