Фактор који изазива оралну хипоксију Инхибитор пролил хидроксилазе Енародустат супротставља се променама у метаболизму енергије бубрега у раним стадијумима дијабетесне болести бубрега

Контакт: emily.li@wecistanche.com

Увод

Одсек за нефрологију и ендокринологију, Медицински факултет Универзитета у Токију, Токио, Јапан; Истраживачка стипендија за младе научнике, Јапанско друштво за промоцију науке, Токио, Јапан; Лабораторије за биолошка и фармаколошка истраживања,

Централни фармацеутски истраживачки институт, Јапан Тобаццо Инц., Такатсуки, Јапан; Катедра за системску фармакологију, Медицински факултет Универзитета у Токију, Токио, Јапан; Лабораторија за синтетичку биологију, РИКЕН Центар за истраживање динамике биосистема, Суита, Јапан; и ВПИ Међународни истраживачки центар за неуроинтелигенцију, Институти за напредне студије Универзитета у Токију (УТИАС), Универзитет у Токију, Токио, Јапан.

Инхибитори пролил хидроксилазе фактора који изазива хипоксију (ХИФ), познати и као стабилизатори ХИФ, повећавају производњу ендогеног еритропоетина и служе као нови терапеутски агенси против анемије кодхроничнабубрегаболест. ХИФ индукује експресију различитих гена повезаних са енергетским метаболизмом као адаптивни одговор на хипоксију. Међутим, остаје нејасно како метаболичко репрограмирање унутрашњег ткива ХИФ стабилизацијом утиче на патофизиологијубубрега болести. Претходне студије сугеришу да системски метаболички поремећаји као што су хипергликемија и дислипидемија изазивају промене у бубрежном метаболизму, што доводи до бубрежне дисфункције укључујући дијабетесну болест бубрега. Овде анализирамо ефекте енародустата (ЈТЗ-951), оралног ХИФ стабилизатора, на метаболизам енергије бубрега у раним стадијумима дијабетесне болести бубрега, користећи дијабетичке пацове изазване стрептозотоцином и дијабетичке мишеве изазване алоксаном. Анализа транскриптома је открила да енародустат делује против промена у метаболизму бубрега код дијабетеса. Анализа транскриптома је показала да је метаболизам масних киселина и аминокиселина појачан у дијабетичком бубрежном ткиву и смањен енародустатом, док је метаболизам глукозе био појачан. Ове симетричне промене су потврђене анализом метаболома. Док су метаболити гликолизе и циклуса трикарбоксилне киселине акумулирани, а аминокиселине смањене у бубрежном ткиву животиња са дијабетесом, ови метаболички поремећаји су ублажени енародустатом. Штавише, енародустатин је повећао однос глутатиона и глутатион дисулфида и ублажио оксидативни стрес у бубрежном ткиву животиња са дијабетесом. Дакле, ХИФ стабилизација се супротставља променама у бубрежном енергетском метаболизму које се јављају у почеткудијабетичарбубрегаболест.

Цистанцхе је веома добар за функцију бубрега

Транслатионал Статемент

Инхибитори пролил хидроксилазе фактора који изазива хипоксију (ХИФ) (познати и као стабилизатори ХИФ) повећавају производњу ендогеног еритропоетина и служе као нови терапеутски агенси против анемије кодхроничнабубрегаболест. Наше анализе транскриптома и метаболома бубрежног ткива код дијабетичких модела пацова и миша откриле су да енародустат (ЈТЗ-951), орални ХИФ стабилизатор, делује против промена у метаболизму енергије бубрега у раним стадијумима дијабетесне болести бубрега. Резултати пружају важне податке за екстраполацију ефеката ХИФ стабилизатора на метаболизам енергије бубрега у клиничким условима, иако су потребне даље студије да би се разјаснило како ово репрограмирање бубрежног метаболизма помоћу ХИФ стабилизатора утиче на прогресијудијабетичарбубрегаболест.

Увод

Инхибитори фактора који изазива хипоксију (ХИФ) пролил хидроксилазе повећавају производњу ендогеног еритропоетина и служе као нови терапеутски агенси против анемије код хроничнебубрегаболест. Ћелије су обдарене одбрамбеним механизмом против хипоксије, а ХИФ је главни регулатор ове одбране. Бубрези су физиолошки изложени хипоксији, а хронична хипоксија је препозната као последњи заједнички пут који води до завршне фазе болести бубрега. Узимајући у обзир да ХИФ индукује експресију различитих гена повезаних са одговорима на хипоксију, ХИФ стабилизатори могу имати плеиотропне ефекте на прогресијубубрегаболестикао и побољшање анемије код хроничнебубрегаболест. Занимљиво је да ХИФ индукује експресију гликолитичких гена и пируват дехидрогеназе киназе, која инхибира пируват дехидрогеназу да користи пируват за напајање циклуса митохондријалне трикарбоксилне киселине (ТЦА).6,7 Ово метаболичко репрограмирање из ТЦА циклуса ради притиска на гликолизу и поновну потрошњу кисеоника. за адаптацију ћелија изложених хипоксичном окружењу. Међутим, остаје нејасно како метаболичко репрограмирање бубрежног ткива ХИФ стабилизацијом утиче на патофизиологијубубрега болести. Дијабетичка болест бубрега (ДКД) је главни узрок болести бубрега у завршној фази. Системски метаболички поремећаји као што су хипергликемија и дислипидемија изазивају промене у метаболизму бубрега, што доводи до бубрежне дисфункције укључујући ДКД. Претходне студије су показале повећан метаболички ток и акумулацију метаболита глукозе и ТЦА циклуса у дијабетичком бубрежном кортикалном ткиву, што би могло бити повезано са митохондријалном дисфункцијом и прогресијом ДКД. Претпоставили смо да би ХИФ стабилизатори могли да преокрену промене метаболизма у дијабетичком бубрежном кортикалном ткиву, с обзиром на то да ХИФ, као адаптивни одговор на хипоксију, смањује метаболички ток у ћелијама како би потиснуо потрошњу кисеоника. Стога смо, користећи анализе транскриптома и метаболома, спровели студију доказа о концепту да бисмо свеобухватно разумели како енародустат (ЈТЗ-951), орални ХИФ стабилизатор, утиче на промене метаболизма бубрега које се јављају у раним фазама ДКД.

РЕЗУЛТАТИ: Енародустат индукује метаболичко репрограмирање од ТЦА циклуса до гликолизе у ћелијама проксималних тубула бубрега

Како се бубрежни кортекс углавном састоји од проксималних тубула, прво смо испитали ефекте енародустата на метаболички флукс ћелија проксималних тубула бубрега ин витро. Прво, Мито Стресс Тест (Агилент Тецхнологиес, ​​Инц., Санта Цлара, Калифорнија) и Глицолитиц Рате Ассаи (Агилент) су спроведени у култивисаним ХК-2 ћелијама, хуманој епителној ћелијској линији проксималних тубула (Слика 1а). Енародустат је значајно смањио митохондријално дисање (ТЦА циклус) и повећао базалну гликолизу, што указује на метаболичко репрограмирање од ТЦА циклуса до гликолизе (Слика 1; Додатна слика С1). Такође смо спровели експеримент користећи малу интерферирајућу РНК (сиРНА) за ХИФ-1 (Слика 2; Додатна слика С2). Обарање ХИФ-1 сиРНА је преокренуло метаболичке промене (базно дисање, максимално дисање, резервни респираторни капацитет и производња аденозин трифосфата [АТП]) изазване енародустатом, што је показало да је метаболичко репрограмирање углавном било преко ХИФ-1 стабилизација (Слика 2; Додатна слика С2). Активност пируват дехидрогеназе, важан фактор за ћелије да користе пируват за погон ТЦА циклуса, такође је смањена енародустатом (Слика 2ф), што је било компатибилно са претходно објављеним запажањима.

Основни подаци дијабетичких пацова изазваних стрептозотоцином

Из резултата ин витро експеримената, претпоставили смо да би ХИФ стабилизатори могли ублажити промене метаболизма у дијабетичком бубрежном кортикалном ткиву путем метаболичког репрограмирања од ТЦА циклуса до гликолизе. Прво смо изабрали дијабетичке пацове изазване стрептозотоцином (СТЗ) као модел за експеримент доказивања концепта да бисмо тестирали горе поменуту хипотезу. У овом моделу, дијабетес се брзо индукује, што нам омогућава да посматрамо нето ефекте дијабетеса и ХИФ стабилизатора на енергетски метаболизам у бубрежном ткиву у кратком временском периоду. Протокол студије и основни подаци из експеримената на СТЗ-индукованим дијабетичким пацовима приказани су на слици 3а. Пацове смо поделили у 3 групе: групу А (лажна), групу Б (ДКД) и групу Ц (ДКД þ енародустат). Нивои глукозе у крвној плазми, гликозилованог хемоглобина ХбА1ц, триглицерида и укупног холестерола 14. дана су значајно повећани у дијабетичарским групама у поређењу са групом А, док није било значајних разлика између група Б и Ц (Слика 3д–г). Иако се нивои креатинина у плазми нису разликовали између група, излучивање албумина у урину је значајно повећано и гломеруломегалија је приметна у групи Б у поређењу са групом А, а енародустат је имао тенденцију да преокрене ове промене (Слика 4). Нивои азота уреје у крви били су виши у групама са дијабетесом, што одражава дехидрацију услед дијабетеса. Укратко, бубрези пацова третираних СТЗ у нашој студији представљају ране фазе ДКД. Анализе транскриптома и метаболома су спроведене коришћењем бубрежног кортикалног ткива ових пацова.

Анализа транскриптома бубрежног кортикалног ткива

Резултати транскриптомске анализе бубрежног кортикалног ткива приказани су на сликама 5 и 6. Анализа главних компоненти и анализа хијерархијског груписања су показале да су групе А, Б и Ц раздвојене у различите кластере (Слика 5а и б). Диференцијално експримирани гени су одабрани помоћу │лог2 фолд-цханге (ФЦ) │ веће од или једнако 0.5 и К вредност < 0.05.="" онтологија="" гена="" и="" анализе="" канонских="" путева="" откриле="" су="" да="" су="" гени="" повезани="" са="" метаболизмом="" масних="" киселина="" појачано="" регулисани="" у="" групи="" б="" у="" поређењу="" са="" групом="" а.="" насупрот="" томе,="" гени="" повезани="" са="" метаболизмом="" глукозе="" и="" одговором="" на="" хипоксију,="" укључујући="" хиф-1="" мрежу,="" били="" су="" појачано="" регулисани="" у="" групи="" ц="" у="" поређењу="" са="" групом="" б="" (слика="" 5ц="" и="" д).="" такође="" смо="" спровели="" анализу="" обогаћивања="" генског="" скупа="" (гсеа)="" користећи="" транскриптомске="" податке="" (слика="" 6,="" табеле="" 1="" и="" 2).="" скупови="" гена="" метаболизма="" масних="" киселина="" и="" аминокиселина="" су="" били="" појачано="" регулисани="" у="" групи="" б="" у="" поређењу="" са="" групом="" а="" (слика="" 6).="" насупрот="" томе,="" ови="" сетови="" гена="" су="" били="" смањени,="" а="" скупови="" гена="" метаболизма="" глукозе="" су="" били="" појачани="" у="" групи="" ц="" у="" поређењу="" са="" групом="" б,="" показујући="" да="" је="" енародустат="" преокренуо="" промене="" метаболизма="" изазване="" дијабетесом="" (слика="" 6).="" штавише,="" сетови="" гена="" тца="" циклуса="" су="" смањени="" у="" групи="" ц="" у="" поређењу="" са="" групом="" б="" (табела="" 2),="" што="" је="" компатибилно="" са="" појмом="" метаболичког="" репрограмирања="" изазваног="" енародустатом="" у="" проксималним="" тубулима="" уоченим="" у="" нашој="" ин="" витро="" студији.="" укратко,="" енародустат="" се="" супротставио="" променама="" метаболизма="" бубрега="" код="" дијабетеса="" из="" транскриптомске="">

Анализа метаболома бубрежног кортикалног ткива

Измерили смо апсолутне концентрације 116 метаболита повезаних са енергијом у бубрежном кортикалном ткиву пацова (н =4, за сваку групу) насумично одабраних из сваке групе (додатна табела С1; додатна слика С3). Да би се проценио значај класне дискриминације, извршена је парцијална дискриминантна анализа најмањих квадрата (ПЛС-ДА) (Слика 7). Спровели смо анализу обогаћивања скупа метаболита (МСЕА) користећи метаболите са ПЛС-ДА променљивим значајем у пројекцији (ВИП) скор $1. Разлике у метаболизму аминокиселина, као што су глицин, серин, метионин, аспартат, глутамат, аргинин, пролин, и б-аланин између група А и Б су забележени. Разлике у метаболизму аминокиселина су такође примећене између група Б и Ц. Штавише, процеси метаболизма глукозе, као што су гликолиза и глуконеогенеза, показали су различите трендове између група Б и Ц (Слика 7).

Визуелизација података о транскриптому и метаболому на мапи енергетског метаболичког пута

Визуелизирали смо податке о транскриптому и метаболому за свеобухватно разумевање промена енергетског метаболизма (Слика 8). Утврђено је да се метаболити гликолизе и ТЦА циклуса акумулирају у групи Б у поређењу са групом А, што може бити последица прекомерног прилива глукозе и појачане регулације метаболизма масних киселина у ДКД. Концентрација аминокиселина је смањена у групи Б у поређењу са групом А, што одражава појачану регулацију метаболизма аминокиселина (Слика 8а). Насупрот томе, енародустат је ублажио акумулацију метаболита гликолизе, због олакшаног тока гликолизе. Енародустат је такође преокренуо промене изазване дијабетесом у метаболитима и аминокиселинама ТЦА циклуса (Слика 8б). Штавише, енародустат је ублажио акумулацију глутатион дисулфида (ГССГ) у дијабетичком бубрежном ткиву и тако показао већи однос глутатион/ГССГ, што сугерише да енародустат ублажава оксидативни стрес у ДКД (Слика 8а и б). Смањење оксидативног стреса потврђено је нивоима маркера липидне пероксидације малондиалдехида у бубрежном кортикалном ткиву: енародустат је преокренуо акумулацију малондиалдехида у дијабетичком бубрежном кортикалном ткиву (додатна слика С4). Укратко, интеграција података о транскриптому и метаболому је показала да енародустат делује против промена у метаболизму енергије бубрега које се јављају у раним фазама ДКД.

Симетричне промене метаболизма (дијабетес наспрам енародустата) потврђене су у алтернативном моделу

Спровели смо анализу транскриптома код дијабетичких мишева изазваних алоксаном, још једног животињског модела дијабетеса, да бисмо потврдили наше налазе у моделу пацова. Протоколи испитивања и основни подаци за модел миша приказани су на слици 9. Излучивање албумина у урину је значајно повећано у групи Б у поређењу са групом А, што је поништено енародустатом (Слика 9д). Поред тога, применили смо свеобухватну 3-димензионалну анализу (јасан, неометани коктели за сликање мозга/тела и компјутерску анализу [ЦУБИЦ]–бубрег)16 да бисмо визуелизовали гломеруле у бубрегу. Гломеруломегалија је била приметна у групи Б у поређењу са групом А, што је поништено енародустатом (Слика 9е). Анализа транскриптома бубрежног ткива код дијабетичких мишева изазваних алоксаном показала је симетричне промене метаболизма (дијабетес наспрам енародустата) на исти начин као у СТЗ-индукованом моделу дијабетичких пацова (Слика 10): метаболизам масних киселина је појачан дијабетесом, док је глукоза метаболизам је регулисао енародустат. Штавише, метаболизам аминокиселина је појачан дијабетесом, а смањен је енародустатом. Дакле, енародустат је супротставио промене метаболизма енергије бубрега које се јављају у раним фазама ДКД у моделу дијабетичког миша изазваног алоксаном, као и у моделу дијабетичког пацова изазваног СТЗ.

ДИСКУСИЈА

У овој студији смо показали да енародустат (ЈТЗ-951), орални стабилизатор ХИФ-а, делује против промена у метаболизму енергије бубрега које се јављају у раним фазама ДКД код модела дијабетеса пацова и миша. Анализе транскриптома и метаболома су показале симетричне промене метаболизма у бубрежном ткиву (дијабетес наспрам енародустата): метаболизам масних киселина и аминокиселина је био појачан у ДКД, док је енародустат смањио ове путеве и додатно појачао метаболизам глукозе (Слике 10).

Није у потпуности разјашњено да ли стабилизација ХИФ-а има заштитне ефекте на патофизиологију ДКД или не. Претходне студије су показале да је дијабетичко бубрежно ткиво изложено хипоксији17 и да је експресија ХИФ у бубрежном ткиву дијабетичара недовољна да реагује на њихова хипоксична стања, што је делимично узроковано оксидативним стресом.18 Стабилизација ХИФ-а кобалт хлоридом побољшала је статус оксидативног стреса и смањила протеинурију и тубулоинтерстицијално оштећење код СТЗ-индукованог ДКД.19 Резултати студија на животињама такође су показали да је стабилизација ХИФ-а штитила од развоја гојазности,20 побољшала осетљивост на инсулин,20 и снизила нивое холестерола у серуму.21 Ови резултати сугеришу заштитне ефекте стабилизације ХИФ-а у развоју ДКД. Насупрот томе, пријављено је да супрафизиолошка ХИФ стабилизација вон Хиппел-Линдау делецијом изазива фиброзу бубрега.22 Улога стабилизације ХИФ-а у прогресији ДКД-а може бити зависна од контекста с обзиром на плеиотропне ефекте ХИФ-а и постојање различитих фенотипова ДКД. Циљ овог истраживања био је да се разјасни нето ефекти стабилизације ХИФ-а на енергетски метаболизам у бубрезима дијабетичара. Претходни извештаји су показали да се промене енергетског метаболизма јављају у ДКД. Сас и сар.10 су показали повећан метаболички проток енергије и акумулацију метаболита глукозе у дијабетичком бубрежном кортикалном ткиву, што би могло бити повезано са митохондријалном дисфункцијом. Иоу ет ал.23 су известили да се фумарат, метаболит ТЦА циклуса, акумулирао у бубрежном ткиву дијабетичара и да је директно допринео напредовању ДКД. Раније смо показали да се метаболити ТЦА циклуса акумулирају у дијабетичком бубрежном ткиву, што је поништено инхибицијом натријум-глукозног котранспортера 2 или ограничењем калорија.11 Штавише, Ки ет ал.24 су показали да ензими у гликолитичким путевима укључујући пируват киназу М2 (ПКМ2), биле су повећане код пацијената са дијабетесом типа 1 без ДКД у поређењу са пацијентима са ДКД. Активација ПКМ2 преокренула је акумулацију метаболита гликолизе и обновила функцију митохондрија, делимично повећањем гликолитичког флукса.24,25 Ови претходни извештаји сугеришу да акумулација гликолизе и метаболита ТЦА циклуса може утицати на напредовање ДКД, што се може ублажити олакшаном гликолизом ПКМ2. активирање. У нашој студији, стабилизација ХИФ-а енародустатом је преокренула промене енергетског метаболизма и ублажила акумулацију метаболита гликолизе и ТЦА циклуса у дијабетичком бубрежном кортикалном ткиву (Слика 8). Експресија гликолитичких ензима укључујући ПКМ2 такође је повећана енародустатом (додатна слика С4Б). Штавише, енародустат је ублажио акумулацију ГССГ и повећао однос глутатион/ГССГ, што сугерише да је енародустат ублажио оксидативни стрес у ДКД (Слика 8). Ово смањење оксидативног стреса изазвано енародустатом такође је потврђено променама у нивоу малондиалдехида у бубрежном кортикалном ткиву (додатна слика С4А). Ови резултати сугеришу да стабилизација ХИФ-а треба да има заштитну улогу у патофизиологији ДКД барем из метаболичке перспективе. Сигурно је да не можемо испитати да ли метаболичко репрограмирање ХИФ стабилизацијом има директне ефекте на прогресију ДКД, јер је можда немогуће уочити нето ефекте промена метаболизма на ренални исход због плеиотропне улоге ХИФ. Међутим, у нашој студији, благо излучивање албумина у урину и патолошке абнормалности бубрега (гломеруломегалија и задебљање базалне мембране гломерула) изазване дијабетесом биле су ублажене енародустатом, у вези са нормализацијом енергетског метаболизма бубрега. Извукли смо гене чије су промене експресије биле у корелацији са нивоима албумина у урину (257 сонди; 232 гена) из података микромрежа у моделу дијабетичког миша изазваног алоксаном и спровели анализу обогаћивања пута (додатна слика С5). Као резултат тога, путеви који се односе на митохондријалну мембрану и респираторни транспорт електрона су појачано регулисани повезани са нивоима албумина у урину, што указује да је оптерећење митохондрија уско повезано са излучивањем албумина у урину. Дакле, постоји могућност да метаболичка нормализација дијабетичког бубрежног ткива помоћу ХИФ стабилизатора може смањити оптерећење митохондрија и ублажити прогресију ДКД. Наши подаци сугеришу патофизиологију ДКД из метаболичке перспективе на следећи начин: Хипергликемија ствара потребу за енергијом за реапсорпцију глукозе у проксималним тубулима бубрега; тако се ТЦА циклус у митохондријама присилно активира да би се задовољила потреба за енергијом у раним фазама ДКД (регулација метаболизма масних киселина и аминокиселина). И ХИФ стабилизатори могу ублажити ово оптерећење митохондрија метаболичким репрограмирањем од ТЦА циклуса до гликолизе (регулација метаболизма масних киселина и аминокиселина и повећање гликолизе), што може имати заштитну улогу против прогресије ДКД. Потребне су даље студије које укључују једноћелијску омику да би се разјаснило како оптерећење митохондрија у бубрежном ткиву директно утиче на патофизиологију ДКД. Још једно занимљиво питање је да ли ХИФ стабилизатори директно утичу на апсорпцију глукозе у проксималним тубулима. Наши ин витро подаци су показали да је производња АТП-а значајно смањена енародустатом кроз метаболичко репрограмирање од ТЦА циклуса до гликолизе (Слике 1 и 2). Узимајући у обзир да је АТП потребан за реапсорпцију глукозе помоћу натријум-глукозног котранспортера 2, прво смо претпоставили да би реапсорпција глукозе могла бити инактивирана енародустатом. Међутим, нивои глукозе у урину нису се значајно разликовали између групе Б и групе Ц у оба животињска модела (додатна слика С6). Вероватно је смањење производње АТП енародустатом много блаже у физиолошкој ситуацији у поређењу са његовим ефектом ин витро; тако, ХИФ стабилизација не утиче на апсорпцију глукозе преко натријум-глукозног котранспортера 2, барем у нашим експериментима на животињама. Наша студија је имала 2 ограничења. Прво, користили смо СТЗ-индуковане дијабетичке пацове и дијабетичке мишеве изазване алоксаном као моделе ДКД у раној фази и посматрали краткорочне ефекте дијабетичких стања. Међутим, у клиничком окружењу, ХИФ стабилизатори би се давали пацијентима са анемијом у касној фази ДКД. Потребно је више студија да би се разумео ефекат стабилизације ХИФ-а на промене бубрежног метаболизма у касној фази ДКД. Друго, студији је недостајала довољна статистичка моћ у погледу дисперзије концентрација метаболита у подацима о метаболому, док су подаци о транскриптому имали довољно велику статистичку моћ да разјасне целу слику енергетског метаболизма. Пошто није много метаболита показало значајну разлику између група, спровели смо ПЛС-ДА и одабрали метаболите са ПЛС-ДА ВИП резултатом већим или једнаким 1 за МСЕА. Иако је тешко верификовати метаболичку промену само помоћу метаболомских података, резултати анализе метаболома били су компатибилни са транскриптомским подацима (Слике 7 и 8), пружајући додатну подршку уоченим ефектима промена транскриптома на енергетски метаболизам бубрега. У закључку, енародустат (ЈТЗ-951), орални ХИФ стабилизатор, супротставља се променама енергетског метаболизма бубрега у раним фазама ДКД. Наша студија сугерише да стабилизација ХИФ-а може послужити као потенцијална интервенција која циља на дисрегулисани енергетски метаболизам бубрега у ДКД.

МЕТОДЕ

Мито стрес тест и тест гликолитичке стопе

ХК-2 ћелије су засејане на микроплочу 96-бунарића при густини од 1 к 10⁴ћелије / бунар. Следећег дана, метаболички флукс је мерен у реалном времену помоћу Сеахорсе КСФе96 анализатора (Агилент) користећи Мито Стресс Тест Кит (103015-100; Агилент) или Глицолитиц Рате Ассаи Кит (103344- 100; Агилент). Концентрације глукозе, пирувата и глутамина у медијуму културе биле су 10 ммол/л, 1 ммол/л и 2 ммол/л, респективно.

сиРНА трансфекција

ХИФ-1 нокдаун је спровео Стеалтх РНАи за људски ХИФ1А (ХСС104774 [#1] и ХСС104775 [#2]; Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА). Стеалтх РНАи сиРНА Негативе Цонтрол Мед ГЦ Дуплек #2 (12935112; Тхермо Фисхер Сциентифиц) је коришћен као негативна контрола.

Вестерн блоттинг

Примарна антитела коришћена за бојење била су анти-хумано ХИФ-1 антитело (зечје поликлонско, 1:500; Новус Биологицалс, Литтлетон, ЦО) и анти-хумано актинско антитело (зечје поликлонско, 1:1000; Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО). Секундарно антитело је било козје анти-зечје ИгГ антитело коњуговано с пероксидазом рена (170-6515, 1:5000; Био-Рад Лабораториес, Херцулес, ЦА).

Експерименти на животињама

Црл: ЦД (Спрагуе Давлеи) пацови и Црл: ЦД1 (Институт за истраживање рака) мишеви су добијени од Цхарлес Ривер Лабораториес Јапан Инц. (Јокохама, Јапан). Све експерименте је одобрио Институционални одбор за ревизију Универзитета у Токију (број одобрења П17-110). Све процедуре на животињама су спроведене у складу са смерницама Националног института за здравље (Водич за негу и употребу лабораторијских животиња). Протоколи студије су приказани на сликама 3 и 9.

Анализа транскриптома

Укупна РНК из бубрежног кортикалног ткива је изолована коришћењем ГенЕлуте сисарског минипреп комплета укупне РНК (РТН7{{10}}; Сигма-Алдрицх). Укупна РНК (100 нг) је обележена коришћењем комплета за обележавање са малим улазом за брзо појачало (Агилент), а затим хибридизована са СуреПринт Г3 Рат ГЕ в2 8к60К Мицроарраи (за пацове; Агилент) и СуреПринт Г3 Моусе ГЕ в{{7 }}к60К Мицроарраи (за миша), респективно. Сви експерименти са микромрежама су изведени од стране ДНК Цхип Ресеарцх Инц. (Токио, Јапан). Сирови подаци су обрађени помоћу Р пакета лимма у Биоцондуцтор-у (хттп://ввв.биоцондуцтор.орг/) да би се извршила корекција позадине и нормализација података коришћењем методе квантилне нормализације. Ефекти серије су уклоњени помоћу ЦомБат-а (Биоцондуцтор) у експерименту са пацовима. Диференцијално експримирани гени су одређени помоћу │лог2 ФЦ│ већег или једнаког 0,5 и К вредности < 0,05.="" онтологија="" гена="" и="" анализе="" канонског="" пута="" су="" спроведене="" коришћењем="" басеспаце="" цоррелатион="" енгине-а="" (иллумина,="" сан="" диего,="" ца).="" подаци="" о="" микромрежу="" су="" депоновани="" у="" национални="" центар="" за="" биотехнолошке="" информације="" омнибус="" о="" експресији="" гена="" као="" серије="" гсе131221="" (пацов)="" и="" гсе139317="">

Анализа обогаћивања скупа гена

ГСЕА је рачунарска метода која одређује да ли а приори дефинисани скуп гена показује статистички значајне, подударне разлике између 2 биолошка стања. ГСЕА је обављен коришћењем ГСЕА в.3.0 (Броад Институте, Цамбридге, МА). Путеви са стопом лажног откривања < 0.25="" сматрани="" су="">

Анализа метаболома

Метаболоме мерења је извршио Хуман Метаболоме Тецхнологиес Инц. (Тсуруока, Јапан). Концентрације метаболита су израчунате нормализацијом површине пика сваког метаболита у односу на површину унутрашњег стандарда и коришћењем стандардних кривих, које су добијене из 3-калибрација тачака. Погледајте и додатне методе.

Анализа обогаћивања скупа метаболита

Анализа метаболомских података је спроведена коришћењем интегрисане веб платформе МетабоАналист 4.0. Урађен је ПЛС-ДА и израчунати су повезани ВИП резултати. Метаболити са ПЛС-ДА ВИП резултатом већим или једнаким 1 коришћени су за МСЕА.

Квантификација гломеруларних подручја код бубрежних патологија

Насумично смо узели 3 патолошке слике са слике бојења периодичном киселином-Сцхифф сваког узорка и измерили сваку гломеруларну област користећи Фиџи (дистрибуција ИмагеЈ; Национални институти за здравље, Бетхесда, МД).

КУБИЧКИ-бубрег

Свеобухватно 3-димензионално снимање гломерула у бубрежном ткиву је изведено коришћењем ЦУБИЦ-а према нашим претходним радовима. Укратко, фиксни бубрези миша су уроњени у ЦУБИЦ-Л ради делипидације, а затим подвргнути имунофлуоресцентном бојењу. Коначно, индекс преламања је усклађен са постављањем узорака у ЦУБИЦ-Р плус. Свеобухватне 3Д-димензионалне слике из провидних бубрега добијене су флуоресцентном микроскопијом направљеном по мери (МВКС10-ЛС; Олимпус, Токио, Јапан). Примарно антитело коришћено за бојење је антитело против подоцина (зечје поликлонско, 1:100, П0372; Сигма-Алдрицх). Секундарно антитело било је магарећи анти-зечји ИгГ коњугован са Алека Флоур 555- (1:100, А-31572; Инвитроген, Тхермо Фисхер Сциентифиц).

Статистичка анализа

За вишеструка поређења, примењена је {{0}}анализа варијансе праћена пост хоц Тукеи тестовима вишеструких поређења, ако је потребно. Све статистичке анализе су обављене помоћу софтвера ГрапхПад Присм 7 (ГрапхПад Софтваре, Сан Диего, ЦА). П < 0,05="" се="" сматра="" статистички="" значајним.="" подаци="" су="" представљени="" као="" средња="">

ОТКРИВАЊЕ

МН је примио хонораре, саветодавне хонораре или финансирање истраживања од КиоваХакко-Кирин, Акебиа, Астеллас, Цхугаи, ГлакоСмитхКлине, Јапан Тобаццо Инц. (ЈТ), Тории, Танабе-Митсубисхи, Даиицхи-Санкио, Такеда, Оноринг, Баиер Ин, Боехеим , и Алекион. ТТ је добио грант за истраживање од ЈТ. Енародустат (ЈТЗ-951) је обезбедио ЈТ, Токио, Јапан. ЕАС и ХРУ су заједнички проналазачи патената у власништву РИКЕН-а. Део ове студије је урађен у сарадњи са Олимпус Цорпоратион и љубазним софтвером који подржава Битплане. Други аутор је изјавио да нема супротстављених интереса.

ЗАХВАЛНИЦЕ

Захвални смо др Схухеи Иао и др Схињи Танака на вредним дискусијама. Такође захваљујемо др Цуиосхи Иноуе, др Сатору Фукуда и госпођи Кахору Амитани на њиховој техничкој подршци. Овај рад је делимично спроведен уз подршку Изотопског научног центра, Универзитета у Токију. Овај рад је подржао научни сарадник Јапанског друштва за промоцију науке (ЈСПС) (ЈСПС КАКЕНХИ грант 19Ј11928 за СХ), Грант-ин-Аид за научна истраживања (Б) (ЈСПС КАКЕНХИ грант 18Х02824 за МН ), Грант-ин-Аид за научна истраживања (Ц) (ЈСПС КАКЕНХИ грант 17К09688 за ТТ) и Грант-ин-Аид за научна истраживања о иновативним областима (КАКЕНХИ грант 26111003 за МН).