Пут ка напретку у претклиничким студијама неуродегенеративних болести повезаних са старењем: перспектива модела глодара и ХиПСЦ-а, део 3

Слични приступи вирусним векторима су процењени у различитим моделима ПД, при чему су најранији прикази користили ААВ2/2 или ЛВ.123–126 Ови вектори убризгани у мозак одраслих пацова коришћени су за испоруку ВТ, А30П или А53Т мутаната хуманог а-син за болест индукција.

Однос између вируса и памћења многим људима може изгледати негативно, јер вируси често изазивају физичку нелагодност и болест. Међутим, вируси такође могу имати позитиван ефекат на побољшање памћења, углавном зато што вирусни напади могу подстаћи активност имуног система.

Истраживања су показала да вирусни напади могу изазвати реакцију имунолошког система тела, чиме се побољшава отпорност организма на вирусе. Овај одговор имуног система укључује повећање броја белих крвних зрнаца и других произведених имуних ћелија, као и производњу антитела. Ови одговори не само да помажу телу да се одупре инвазији вируса, већ такође помажу у јачању функције имуног система и побољшању општег здравља тела.

Вирусни напади такође активирају имуне ћелије у мозгу. Ове имуне ћелије могу уклонити отпадне и корумпиране ћелије из мозга, побољшати функцију нервног система и промовисати пренос информација и обраду меморије. Студије су такође показале да људи са одређеним вирусним инфекцијама могу боље да раде када се баве задацима памћења.

Поред тога, неке студије су откриле да одређени вируси могу стимулисати тело да производи неуротрофни фактор из мозга (БДНФ), супстанцу која промовише раст и развој неурона. Ова супстанца има позитиван ефекат на функцију мозга и може подстаћи физичку поправку и побољшање памћења.

Наравно, у борби против вируса потребно је да усвојимо прави приступ и стратегију, одржавамо добре хигијенске навике, довољно спавамо и вежбамо, како би наш имуни систем био у најбољем стању. Укратко, иако нам вирус може изазвати физичку нелагодност, све је више доказа да он такође може да подстакне активност имуног система и да има позитиван утицај на наше здравље и памћење. Види се да треба да побољшамо своје памћење, а Цистанцхе може значајно да побољша наше памћење јер Цистанцхе може да регулише и равнотежу неуротрансмитера, као што је повећање нивоа ацетилхолина и фактора раста који су веома важни за памћење и учење. Поред тога, Цистанцхе такође може побољшати проток крви и промовисати испоруку кисеоника, што може осигурати да мозак добије довољну исхрану и енергију, чиме се побољшава виталност и издржљивост мозга.

Кликните на суплементе да бисте побољшали памћење

Аутори су показали ефикасну експресију а-син у ниграл ДА неуронима, праћену молекуларним и ћелијским патологијама и дегенерацијом нигралДА која је постепено еволуирала током времена.

Без обзира на то, прва генерација вектора рААВ2/2 коришћених у овим студијама показала је прогресивни губитак неурона, иако је неуродегенерација неурона позитивних на тирозин-хидроксилазу, као и временски ток, били прилично варијабилни (25%–80% и 6 недеља до 1 године). , односно).123,124

Насупрот томе, ЛВ који кодирају ВТ-, А30П- или А53Т-мутираним а-синтезом били су способни да индукују губитак неуронских ћелија код пацова на каснији и конзистентнији начин (25%–40% и 5 месеци, респективно).126 Обе студије су показале прогресивни губитак дужине неурита и отечене перикарије у преосталим ДА неуронима.

Штавише, масивне цитоплазматске акумулације а-син пронађене су и у ћелијским телима и у неуритима. Ови резултати су недавно реплицирани у више студија које су користиле обе вирусне платформе.127–131

ЛВ су такође коришћени у различитим моделима ПД мишева. На пример, Лауверс и колеге125 показали су да је ињекција ЛВ који носи ВТ или А30П мутант а-син у стриатум, амигдалу или СН мишева способна да изазове неуродегенеративне промене повезане са ПД на начин који зависи од времена и укључује а-независно неуритичко повећање. и цитоплазматске инклузије.

Даље, ова студија је показала да нигрална прекомерна експресија А30П-а-син доводи до губитка од око 25% ћелија за 10–12 месеци.125 Испорука А30П, Е57К и Е35К СН пацова помоћу ЛВ је показала сличан степен у ДА неурону губитак (око 50%) у поређењу са ВТ (30%), док бржи мутант који формира фибриле А53Т коришћен у истој студији није показао значајно смањење броја ДА ћелија.

Занимљиво је да су укупне неуропатолошке карактеристике примећене код мишева (тј. почетак и тежина) изгледале мање озбиљне у поређењу са пацовима, иако ове разлике могу бити артефакт чистоће вируса или производних титара убризганог вируса и/или других сродних техничких неслагања.

Важна разматрања за АД и ПД вирусне векторске моделе

Развој нових серотипова, укључујући ААВ2/1, ААВ2/5, ААВ2/6, ААВ2/8, ААВрх10, ДЈ и ДЈ8, проширио је ћелијске циљеве и побољшао ефикасност ААВ трансдукције.

ААВ серотипизирани са овим новим капсидима су тестирани на пацовима и нехуманим приматима да прекомерно експримирају а-син.132–137 Прекомерна експресија С129Аформе достављеног преко ААВ2/5 и ААВ2/6 доследно показује повећану токсичност у процесу неуродегенерације.134,138

Ови експерименти су такође показали да је пажљиво дозирање трансгена прекомерне експресије кључно, јер чак и контролни вектори који носе само флуоресцентне репортере испоручене у високим титрима могу показати неспецифичне токсичне ефекте.135

Ово упозорење треба пажљиво узети у обзир приликом дизајнирања експеримената спасавања заснованих на ААВ-у. На пример, показало се да терапеутски ААВ који садржи малу интерферирајућу РНК (сиРНА) која циља СНЦА доводи до високог нивоа токсичности и изазива значајан губитак нигростриаталних ДА неурона. Ова студија је додатно истакла ограничења примене ААВ-а у студијама на животињама.

Међутим, не може се искључити да је неуротоксичност узрокована снажним смањењем нивоа СНЦА у моделима пацова, аса-син игра кључну биохемијску улогу у ДА неуронима, а његова робусна редукција може смањити виталност ћелије.139 Узето заједно, ово наглашава важност развој алата за фино подешавање експресије гена повезаних са болестима за дизајнирање приступа генској терапији.

У том смислу, новији систем заснован на ЦРИСПР-дЦас9-могу представљати бољи систем за модулацију експресије гена на прецизан и фино подешен начин.

У том правцу, недавно смо развили систем ЛВ-ЦРИСПР-Цас9 да бисмо постигли прецизну и фино подешену регулацију експресије СНЦА гена. Студија је пружила доказ концепта да је манипулација експресијом гена (нпр. реверсинг оверекпрессион) кроз уређивање епигенома вредна терапијска стратегија за неуролошке поремећаје, као што је ПД,140 узрокована дисрегулацијом гена.

Као такви, вирусни векторски модели ПД који користе ЛВ и ААВ за прекомерну експресију а-син протеина приказују ПД патологију повезану са неуродегенерацијом ДА, а употреба нових ААВ серотипова побољшава експресију а-син у ДА неуронима у поређењу са ААВ2/2.

Све у свему, и ААВ и ЛВ су способни да индукују експресију трансгена и показују висок ниво тропизма за ДА неуроне, што резултира сличним нивоима неуродегенерације. Биће потребно даље унапређење ових вирусних система да би се заобишло споро напредовање ћелијских фенотипова ПД и релативно ниски нивои поремећаја понашања.

Ин витро модели ћелијске културе Преглед тренутних ин витро АД и ПД модела: ограничења и могућности

Током протекле четири деценије, развијени су различити модели АД и ПД ин витро да би се испитале интеракције између кључних аспеката њихове релативне патофизиологије болести и касније коришћени за претклинички терапијски скрининг.

Тренутни АД и ПД ин витро модели првенствено имају за циљ рекапитулацију обележја молекуларних и ћелијских болести, као што су митохондријална дисфункција, оксидативни стрес, преживљавање ћелија и присуство интрацелуларних и/или екстрацелуларних протеинских агрегата. На пример, најистакнутији и најшире коришћени ћелијски модели АД су засновани на индукцији Аб40 42 агрегата или тау хиперфосфорилације и агрегације141,142 (Табела 1).

Слично томе, ин витро модели ПД засновани су на горе поменутој митохондријалној дисфункцији изазваној токсином (нпр. МПТП, ротенон, паракват, 6-ОХДА) и поремећеној протеостази (нпр. тапсигаргин, јономицин, туникамицин), прекомерној експресији а-синтеза мутираних породичних гена ПД (нпр. а-син, Паркин, ПИНК1)92 (Табела 2).

Док су ови модели ћелијске културе били од непроцењиве вредности у напредовању нашег разумевања релевантне неуробиологије, они још увек нису резултирали одрживим ДМТ-овима који имају за циљ превенцију, одложен почетак или успорену прогресију болести, доводећи у питање њихову релевантност и транслациону валидност.

Неколико јасних ограничења у овим моделима је важно признати да би се побољшале тренутне претклиничке праксе.

На пример, модели засновани на прекомерној експресији и нокауту/смањењу релевантних гена повезаних са болешћу су ноторно варијабилни у квантитативним променама нивоа протеина и методама које се користе за изазивање промена у експресији гена (тј. вирусно посредована, заснована на узгоју, конститутивна или пролазна експресија) то може довести до контрадикторних података и закључака.92

Овај недостатак доследности у изазивању фенотипова повезаних са болешћу уводи упозорење у претклиничке студије које користе ове моделе за тестирање потенцијалних ДМТ-а. Штавише, варијабилност у ћелијским фенотиповима и методологији примећена у претклиничким НДД моделима (нпр., нагло промена прекомерне експресије протеина или кноцкдовн) снажно сугерише већу генетску хетерогеност која није у могућности да се у потпуности истражи у тренутним моделима ћелија.

Ово је додатно компликовано због распрострањености ћелијских модела заснованих на генетским варијантама идентификованим у породичним кохортама, упркос томе што породичне варијанте представљају малу мањину од укупног броја случајева НДД.109,143

Због откривених генетских узрока, остаје тешко прецизно представити спорадичне НДД кохорте или подтипове болести са не-Менделовском генетиком у претклиничким моделима, стварајући значајну баријеру у разјашњавању релевантних механизама болести, идентификовању потенцијалних терапијских циљева и развоју лекова.

С обзиром на ове изазове, истраживачи су били приморани да процене ове моделе како би идентификовали области побољшања и проценили могућности које се пружају новим техникама културе ћелија.

Последњих година градили смо ове моделе, укључујући технологију за уређивање нових гена и процењујући важне асоцијације генетских болести добијених у ГВАС у побољшаним моделима културе ткива.144,145

Повећано укључивање хиПСЦ технологије представља велики напредак у области НДД ин витро моделирања и пружа раније недоступне могућности за коришћење типова ћелија релевантних за болест добијених од пацијената за истраживање патогенезе болести у контексту људског генома.

Пуни спектар предности и ограничења хиПСЦ изведених НДД модела, посебно оних о АД и ПД, истражен је у потпуности у следећем одељку.

ХиПСЦ изведени модели НДД-а: свестрани и генетски „верни“

Савремени напредак у технологији ћелијске културе представља једно од најузбудљивијих открића у истраживању НДД, пружајући могућности за побољшано моделирање болести, скрининг лекова и персонализовану медицину.

До недавно, постмортални преглед мозга сматран је златним стандардом биолошког материјала заснованог на људима за стицање увида у патолошке процесе људских неуродегенеративних стања.

Међутим, модерне технологије матичних ћелија, укључујући анализу неурона специфичних за пацијенте и глијалних ћелија, отвориле су нове путеве за истраживање патолошких механизама НДД и све више се користе у молекуларној дисекцији НДД са повећаном генетском сложеношћу, као што су АД и ПД.

Кроз једноставну, неинвазивну биопсију узорака коже пацијената, поред низа алтернативних биолошких узорака, стварање хиПСЦ-а омогућава истраживачима да открију молекуларне путеве и механизме болести који су у основи НДД-а на начин који је био немогућ са претходним методама ћелијске културе.

Тренутно, најзаступљенији донатори су фибробласти, који се користе у преко 80% свих објављених експеримената репрограмирања;146 међутим, хиПСЦ-ови се могу добити из различитих извора, укључујући матичне ћелије ембрионалне врпце, крв из пупчане врпце, епителне ћелије рожњаче, и крвне ћелије, као што су мононуклеарне ћелије периферне крви147–149 (Слика 1).

Сходно томе, модели изведени из хиПСЦ-а представљају разноврсну алтернативу постојећим моделима ћелијских болести и добијају се од соматских ткива пацијената који су приморани на плурипотенцију коришћењем различитих алата за репрограмирање, као што су плазмиди, вектори (нпр. епизомални) и вирусна трансдукција (нпр. , аденовирус, Сендаи вирус, лентивирус су свеобухватно прегледани у Броуверет ал.150 и Малик и Рао151);

Ове ћелије се самообнављају и нуде алтернативу ембрионалним матичним ћелијама (ЕСЦ), које прате етичка разматрања и друштвена брига. Тренутно постоји неколико хиПСЦ репозиторија који прикупљају и дистрибуирају хиПСЦ линије изведене од пацијената са НДД и контролама прилагођеним здравственим годинама како би се узорци централизовали и учинили доступним истраживачима (Табела С2).

Једна од главних примена хиПСЦ-а је диференцијација у специфичне типове ћелија, које су коришћене у различитим биолошким контекстима, укључујући неуроразвојне152 и студије неуродегенерације,144 ек виво трансплантацију,153,154 моделирање болести, валидацију циља и откривање лекова.155

До данас је развијено неколико протокола за ћелијску диференцијацију који стварају не само генеричке неуроне већ и специфичне популације неуронских ћелија, укључујући ексцитаторне, холинергичке, ДА и инхибиторне ГАБАергичне неуроне.156–158 Различите специфичне глијалне субпопулацијске ћелије су такође изведене из хиПСЦ-а, укључујући астроците,159–161олигодендроците,162,163 и микроглију.164–166

Неколико техника за уређивање нових гена, укључујући ЦРИСПР-Цас9, нуклеазе цинкових прстију (ЗФН) и ефекторске нуклеазе сличне активатору транскрипције (ТАЛЕНС), увеле су додатну димензију у систем изведен из хиПСЦ-а - стварање изогених модела који поседују исту генетску позадину а разликују се само по изабраној мутацији.167

Разноликост протокола за диференцијацију ћелија је олакшала механичке студије, а доступност изогених линија је подржала генетске анализе функције гена и његове патогене улоге у НДД. ХиПСЦ-изведени модели су погодни за ова истраживања, јер показују кључне карактеристике везане за болест.

На пример, хиПСЦнеуронални модели изведени из фАД-а и сАД-а који носе мутације ПС1 и ПС2 (А246Е и Н14ИИ, респективно)168 и мутације дупликације АПП169 показују важне биохемијске карактеристике АД, укључујући секрецију Аб, повећани однос Аб42:Аб40 таупхосолев и хиперфос.

Важно је напоменути да употреба хиПСЦ модела који генеришу фенотипове везане за Аб представља прецизније средство за истраживање улоге Аб експресије у неуродегенерацији АД у поређењу са традиционалним моделима ектопичне експресије или моделима који захтевају допуну и/или индукцију Аб агрегата, као што је они усвајају "природне" патолошке процесе који се јављају у вези са депозитима Аб.

For more information:1950477648nn@gmail.com