Програм бубрежне фиброгенезе контролишу микроРНА које регулишу оксидативни метаболизам

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Верника Мигуела,*, Рикардо Рамос, Лаура Гарсија-Бермејоб, Дијего Родригез-Пујолк, д

Сантјаго Ламеса,**

Програм физиолошких и патолошких процеса, Центро де Биологиа Молецулар "Северо Оцхоа" (ЦСИЦ-УАМ), 28049, Мадрид, Шпанија

б Геномски објекат, Паркуе Циентифицо де Мадрид, Мадрид, Шпанија

ц Одељење за патологију, Универзитетска болница "Рамн и Цајал", ИРИЦИС, Мадрид, Шпанија

д Одељење за медицину и медицинске специјалности, Фондација за истраживање Универзитетске болнице "Принципе де Астуриас", ИРИЦИС, Универсидад де Алцала´, Алцала´ де Хенарес, Мадрид, Шпанија

Кључне речи: микроРНА, фиброза бубрега, оксидација масних киселина, екстрацелуларни матрикс, ЦПТ1А, митохондрије

цистанцхе бодибилдинг је веома добар за функцију бубрега

A B S T R A C T

Прекомерна акумулација екстрацелуларног матрикса (ЕЦМ) је обележје фиброзних болести. У бубрезима, то је последњи уобичајени пут преовлађујућих болести, што доводи до хроничне бубрежне инсуфицијенције. Док цитокини као што је ТГФ- играју основну улогу у трансформацији миофибробласта, недавни рад је показао да су дисфункција митохондрија и дефектна оксидација масних киселина (ФАО), који угрожавају главни извор енергије за бубрежне тубуларне епителне ћелије, предложени као фундаментални доприноси. развоју и напредовању фиброзе бубрега. Пријављено је да микроРНА (миРНА), које регулишу експресију гена пост-транскрипционо, контролишу бубрежну фиброгенезу. Да бисмо идентификовали миРНА укључене у метаболички поремећај бубрежне фиброзе, извршили смо преглед низа миРНА у мишјем моделу једностране опструкције уретера (УУО). МиР-150-5п и миР-495-3п су одабрани због њихове везе са људском патологијом, њихове улоге у метаболизму митохондрија и њиховог циљања на ензим који преноси масне киселине ЦПТ1А. Пронашли смо 2- и 4-преструку регулацију миР-150-5п и миР-495-5п, респективно, у моделима УУО и нефропатије изазване фолном киселином (ФАН) , док је ТГФ- 1 појачао њихову експресију у ћелијској линији хуманих бубрежних епителних ћелија ХКЦ-8. Ове миРНА су синергизовале са ТГФ-ом у погледу његовог профиброзног ефекта тако што су појачале маркере повезане са фиброзом Ацта2, Цол{16}} и Фн1. Биоенергетске студије су показале смањење стопе потрошње кисеоника (ОЦР) у вези са ФАО у ХКЦ-8 ћелијама у присуству обе миРНК. Конзистентно, нивои експресије њихових циљних гена повезаних са митохондријама ЦПТ1А, ПГЦ1 и митохондријалног транскрипционог фактора А (ТФАМ), смањени су за половину у ћелијама епитела бубрега изложених овим миРНА. Насупрот томе, нисмо открили промене у митохондријалној маси и трансмембранском потенцијалу (ΔЗм) или производњи ањона радикала митохондријалног супероксида. Наши подаци потврђују да миР-150 и миР- 495 могу допринети фиброгенези бубрега погоршавајући метаболички поремећај који је критично укључен у тубуларне епителне ћелије, што на крају доводи до фиброзе.

1. Представљање

Хронична болест бубрега (ЦКД) је клиничко стање у коме се одржава смањена бубрежна функција. Генерално се сматра да је неповратан и прогресиван. Представља важан јавноздравствени проблем који може да утиче на 12–14 процената опште популације [1]. Може бити присутан код око 30-40 процената пацијената са високо распрострањеним патологијама као што су дијабетес мелитус и хипертензија, где доприноси диктирању еволуције и прогнозе. Без обзира на етиологију болести, прогресија ЦКД доводи до тубулно-интерстицијалне и гломеруларне фиброзе [2]. Тубуло-интерстицијална фиброза укључује ширење простора између тубуларне базалне мембране и перитубуларних капилара путем депозиције матриксних протеина (ЕЦМ) (претежно колагена типа И и ИИИ и фибронектина) у вези са инфламаторним ћелијама, губитком тубуларних ћелија и акумулацијом миофибробласта. [3].

Трансформирајући фактор раста- (ТГФ-) се сматра кључним свеприсутним профибротичним цитокином и главним регулатором диференцијације миофибробласта у фибрози [4]. Недавне студије су показале да глобални дефект у оксидацији масних киселина (ФАО), који доводи до компромиса у главном извору енергије за тубуларне епителне ћелије, игра важну улогу у развоју фиброзе бубрега [5,6]. ТГФ- потискује ФАО на начин зависан од СМАД3-и ПГЦ1А, чиме утиче на транскрипционе регулаторе преузимања и оксидације масних киселина, укључујући ЦПТ1А [5]. Промене у ФАО коначно доводе до интрацелуларне акумулације липида и исцрпљивања АТП-а, што доводи до фиброзе [5,7]. Према томе, стратегије усмерене на обнављање метаболичког поремећаја који делују у ЦКД могу пружити терапијске опције [8].

МикроРНА (миРНА) су се појавиле као критични регулатори експресије гена кроз њихово деловање на посттранскрипциону регулацију. У бубрезима се показало да миР имају кључну улогу у нефрогенези, хомеостази и болести [9]. МиРНА су такође способне да регулишу фибротичне процесе и назване су „фиброза“ [10]. Поред тога, због недостатка ефикасне терапије за спречавање или враћање бубрежне фиброгенезе [11], манипулација експресијом миРНК ин виво испоруком миРНА мимичара или инхибитора је предложена као обећавајућа терапијска стратегија за ЦКД [12]. Поред тога, циркулишуће миРНА могу представљати дијагностичке, па чак и прогностичке биомаркере [13].

Контрола фиброзе бубрега посредована миРНА углавном се дешава кроз регулацију ТГФ- 1 сигнализације на начин који зависи од ћелије и контекста, користећи Смад пут као једну од главних мета [14]. У претходном раду идентификовали смо неколико миРНА које утичу на фиброзу бубрега регулацијом специфичних метаболичких путева [15,16]. Прекомерна експресија миР-9-5п спречава дедиференцијацију тубуларне епителне бубрежне ћелије и репрограмира метаболички поремећај повезан са фиброзом [16], док губитак функције миР-33, било генетски или фармаколошки, доводи до повећања ФАО и превенција акумулације липида у тубуларним епителним ћелијама. Ово је повезано са повећаним снабдевањем енергијом, побољшаном биоенергетиком митохондрија и превенцијом експерименталне бубрежне фиброзе [15]. Дакле, миРНА које регулишу ћелијску биоенергетику су такође способне да регулишу фиброгенезу бубрега. У овој студији користили смо стратегију засновану на низу миРНА у моделу хроничне повреде бубрега унилатералне опструкције уретера (УУО) да бисмо идентификовали миРНА укључене у бубрежни фибротични фенотип кроз модификацију метаболичких путева. Одабиром неколико гена повезаних са митохондријалним функцијама (ЦПТ1А, ТФАМ, ПГЦ1А), идентификовали смо и миР-150 и миР-495 као миРНА способне да смање стопу потрошње кисеоника (ОЦР) повезану са ФАО и промовишу ТГФ{ {21}}индукована фиброгена трансформација у ћелијској линији хуманих тубуларних епителних ћелија ХКЦ-8. Наши налази наглашавају важност миРНА као митохондријалних метаболичких регулатора укључених у фиброгенезу бубрега.

2. Материјал и методе

Ћелијске линије и услови културе. Хумане бубрежне проксималне тубуларне епителне ћелије (ХКЦ-8) су узгајане у ДМЕМ/Ф12 (Дулбеццо-ов модификовани орлов медијум 1:1 (в/в)) (Цорнинг, Њујорк, Њујорк) са додатком 15 мМ ХЕПЕС-а, 5 процената (вол/вол) фетални говеђи серум (ФБС)

(ХиЦлоне Лабораториес, Логан, УТ), 1к инсулин-трансферин-селен (ИТС) (Гибцо, Роцквилле, МД), 0.5 уг/мл хидрокортизон (Сигма, Ст. Лоуис, МО), 50 јединица/ мЛ пеницилина и 50 уг/мЛ стрептомицина (Гибцо, Роцквилле, МД) на 37◦ Ц и 5 процената ЦО2. Ову ћелијску линију је љубазно обезбедила лабораторија др. Сусзтак (Пхиладелпхиа, Пеннсилваниа, УСА). Третмани са хуманим рекомбинантним 10 нг/мл ТГФ- 1 (Р&Д Системс, Миннеаполис, МН) изведени су након гладовања ХКЦ-8 ћелија без серума током 12 х.

Поступак трансфекције. Ћелије су засејане у посуде за културу од 60 мм да би се дошло до конфлуенције од 70 процената. Они су трансфектовани са 40 нМ мирВана™ миРНА која опонаша миР-150, миР-495 или мирВана™ миРНА имитира негативну контролу (компанија Амбион, САД) коришћењем липофектамина 2000 (Инвитроген, Царлсбад, ЦА) . Ћелије су инкубиране са липофектамин-пре-миРНА 37 ◦ Ц током 6 х. Након тога, 5 мл свежег медијума који садржи 10 процената ФБС је додато у посуде за културу, а ћелије су држане у култури 6 х док се не користе за следеће експерименте. У случају комбинације са третманом ТГФ- 1, примењен је на ћелије након прекомерне експресије миРНА у складу са претходним одељком.

Имуноблот. Ћелије су испране у ПБС, хомогенизоване и лизиране у 100 μЛ РИПА пуфера за лизу који садржи 150 мМ НаЦл, 0,1 проценат СДС, 1 проценат натријум деоксихолата, 1 проценат НП-40 и 25 мМ Трис– ХЦл пХ 7,6, у присуству протеазе (Цомплете, Роцхе Диагностицс, Маннхеим, Немачка) и инхибитора фосфатазе (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО) и сакупљена стругањем. Четвртина комада сваког узорка бубрега (добијеног након дисекције на пола и по дужини и попречно) је хомогенизована у 300 ул РИПА пуфера са перлама од нерђајућег челика од 5 мм (Киаген, Валенсија, Калифорнија) коришћењем ТиссуеЛисер ЛТ (Киаген, Валенсија, Калифорнија) који вибрира на 50 Хз током 15 минута на 4 ◦ Ц. Узорци су бистрени центрифугирањем на 10,000 г током 15 минута на 4 ◦ Ц. Пелет је затим одбачен, а супернатант је чуван као протеински лизат. Концентрације протеина су одређене помоћу БЦА Протеин Ассаи Кит (Тхермо Сциентифиц, Роцкфорд, ИЛ) и мерене су у Гломак®-Мулти Детецтион Систем (Промега, Мадисон, ВИ). Једнаке количине протеина (10–50 уг) из укупног екстракта су одвојене на 8–10 процената СДС-полиакриламидних гелова и пребачене на нитроцелулозне упијајуће мембране (ГЕ Хеалтхцаре, Цхицаго, ИЛ) на 12 В током 20 минута у полусувом Транс-Блот Турбо систем (Био-Рад, Херцулес, Цалифорниа).

Мембране су блокиране инкубацијом током 1 х са 5 процената немасног млека у ПБС-у који садржи 0.5 процената Твеен-20 и блотиране преко ноћи специфичним антителима: ЦПТ1А (Аб128568, Абцам; 1:1{ {26}}; 4 ◦ Ц преко ноћи), -СМА (сц-32251, Санта Цруз Биотецхнологи; 1:1000; 4 ◦ Ц преко ноћи), ГАПДХ (МАБ374, Миллипоре; 1:15000; 1 х, собна температура); ). Након инкубације са секундарним антителима ИРДие 800 козе против зеца и ИРДие 600 козе против миша (1:15,000, ЛИ-ЦОР Биосциенцес, Линцолн, НЕ), мембране су снимљене у три примерка помоћу Одиссеи инфрацрвеног система за снимање (ЛИ-ЦОР Биосциенцес, Линколн, НЕ). Дензитометрија траке је изведена коришћењем софтвера ИмагеЈ 1.48 (хттп://рсб.инфо.них.гов/иј) и релативна експресија протеина је одређена нормализацијом на ГАПДХ. Промене набора су нормализоване на вредности контролног стања.

Екстракција РНК. Укупна РНК је екстрахована из ХКЦ-8 ћелија или бубрега миша коришћењем миРНеаси Мини Кит (Киаген, Валенциа, ЦА) према упутствима произвођача. Количина и квалитет РНК су одређени на 260 нм спектрофотометром Нанодроп-1000 (Тхермо Сциентифиц, Роцкфорд, ИЛ).

Анализа експресије мРНК. Реверзна транскрипција (РТ) је спроведена са 500 нг укупне РНК коришћењем иСцрипт™ цДНА Синтхесис кита (Био-Рад, Херцулес, ЦА). кРТ–ПЦР је изведен са иК™СИБР Греен Супермик-ом (Био-Рад, Херцулес, ЦА), користећи 96-велл Био-Рад ЦФКС96 РТ–ПЦР систем са Ц1000 Тхермал Цицлер (Био-Рад, Херцулес, ЦА) према упутствима произвођача. Вредност Цт је добијена из сваке криве амплификације коришћењем софтвера за анализу ЦФКС96 који је обезбедио произвођач. Релативна експресија мРНК одређена је методом 2 − ΔΔЦт [17]. 18С ген је коришћен у сврху нормализације. The primer sequences used for mRNA quantification were: CPT1A (FW: TGCTTTACAGGCGCAAACTG, RV: TGGAATCGTGGA TCCCAAA), ACTA (FW: TTCAATGTCCCAGCCATGTA, RV: GAAGGAA- TAGCCACGCTCAG), COL1A1 (FW: CGGACGACCTGGTGAGAGA, RV: CATTGTGTCCCCTAATGCCTT), FN1 (FW: GTGTTGGGAATGGTCGT ГГГГААТГ, РВ: ЦЦААТГЦЦАЦГГЦЦАТАГЦАГТАГЦ), ПГЦ1А (ФВ: ТГЦЦЦТГГАТТГТТГАЦАТГА, РВ: ТТТГТЦАГГЦТГГГГГГТАГГ), ТФ АМ (ФВ: ЦАТЦТГТЦТТГГЦААГТТГТЦЦ, РВ: ЦАТЦТЦТГТЦТТГГЦААГТТГТЦЦ, РВ: ЦЦАТЦТЦАЦТГЦАГТЦЦА: ЦЦАТЦТЦАЦТГЦАГТЦЦА, ЦЦАТЦТЦТГЦАГТЦЦА, ЦЦАТЦТГТЦГАЦТЦ, ЦЦАТЦТГТЦГАЦТЦ). Промене набора су нормализоване на вредности контролног стања.

Квантификација експресије миРНА. Квантификација експресије миРНА је изведена коришћењем миРЦУРИ Лоцкед Нуцлеиц Ацид (ЛНА) миРЦУРИ ЛНА РТ комплета (Екикон, Феедбацк, Данска). Након РТ, цДНК шаблон је амплификован коришћењем микроРНА-специфичних ЛНА прајмера за зрели миР150-5п или миР-495-3п (Екикон, Феедбацк, Данска). кРТ–ПЦР је изведен у 96-бунар Био-Рад ЦФКС96 ПЦР систему у реалном времену са Ц1000 Тхермал Цицлер користећи иК™ СИБР Греен Супермик (Био-Рад, Херцулес, ЦА) према упутствима произвођача . Вредност Цт за трипликатне јажице добијена је из сваке криве амплификације коришћењем софтвера ЦФКС Манагер Био-Рад (Био-Рад, Херцулес, ЦА). Цт вредности су нормализоване на ендогену контролну 5С рРНА. Нивои миРНА у плазми су нормализовани на миР-103а-5п. Релативна експресија миРНА је одређена методом 2 − ΔΔЦт [17]. Промене набора су нормализоване на вредности контролног стања.

Мишји модели фиброзе бубрега. Мишеви су смештени у објекту за животиње без специфичних патогена (СПФ) у ЦБМСО у складу са прописима ЕУ за све процедуре. Са животињама се поступало у складу са Водичем за негу и употребу лабораторијских животиња садржаним у Директиви 2010/63/ЕУ Европског парламента. Одобрење су дали локални одбор за етичку ревизију Центро де Биологиа Молецулар "Северо Оцхоа" у Мадриду, Етички комитет у ЦСИЦ-у и Регулаторна јединица за експерименталне поступке на животињама Цомунидад де Мадрид.

Унилатерална опструкција уретера (УУО): Операција УУО је изведена као што је претходно описано [18]. Укратко, мишеви су анестезирани изофлураном (3–5 процената за индукцију и 1–3 процента за одржавање) и подељени у две експерименталне групе: УУО групу и групу лажне операције. У УУО групи, мишеви су обријани на левој страни стомака, скалпелом је направљен вертикални рез кроз кожу и кожа је увучена. Други рез је направљен кроз перитонеум да би се открио бубрег. Леви уретер је два пута подвезан хируршком свилом 15 мм испод бубрежне карлице, а уретер је затим пресечен између две лигатуре. Затим је подвезани бубрег нежно стављен назад у исправан анатомски положај и додат је стерилни физиолошки раствор да би се надокнадио губитак течности. Резови су зашивени, а мишеви су одвојени у кавезима. Лажна операција је изведена на сличан начин, али без лигације уретера. Бупренорфин је коришћен као аналгетик. Прва доза је примењена 30 мин пре операције, а затим сваких 12 х током 72 х, у дози од 0,05 мг/кг субкутано. У овом моделу, бубрежни проток крви и брзина гломеруларне филтрације постају значајно смањени у року од 24 х, а интерстицијална упала (врхунац на 2-3 дана), тубуларна дилатација, тубуларна атрофија и фиброза су евидентни након 7 дана. Опструирани бубрег достиже максималну дисфункцију око 2 недеље након захвата. Мишеви су жртвовани предозирањем ЦО2, а контролни и опструирани узорци бубрега и крви су сакупљени након перфузије са ПБС-ом 3, 5, 7, 10 и 15 дана након УУО.

Нефропатија изазвана фолном киселином (ФАН): У овом моделу, фиброза бубрега је индукована интраперитонеалном (ип) ињекцијом са 250 мг фолне киселине (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО) по кг телесне тежине растворене у 0.3 М натријум бикарбонат (носилац) као што је претходно описано [19]. Контролне животиње су добиле 0,3 мл носача (ип). Мишеви су жртвовани предозирањем ЦО2, а узорци бубрега и крви су сакупљени након перфузије са ПБС после 15 дана примене ФА.

микроРНА профилисање. Да би се идентификовале специфичне миРНА које регулишу фибротични исход, прилагођени миРЦУРИ ЛНА микроРНА низ (Екикон, Феедбацк, Данска) је изабран као платформа за профилисање микроРНА. Ова платформа се састојала од укупно 175 јединствених тестова специфичних за мишје миРНК присутне у Сангер миРБасе в22.1 (хттп://мицрорн а.сангер.ац. УК). За сваку микроРНА, преовлађујући ланац је одабран за анализу. Селекција МиР-а је заснована на предвиђеним циљним генима који се односе на бубрежну фиброзу, митохондријски метаболизам, редокс процесе и циркадијални ритам. Ова анализа је урађена помоћу биоинформатичких алата за предвиђање циља миРНА засновано на секвенци, микрокосмос [20] (ввв.Еби.ац. УК/Енригхт-СРВ/мицроцосм), Таргетсцан 4.1 [21] (ввв.таргетсцан.орг /верт{ {9}}/) Пицтар И [22] (ввв.пицтар.мдц-берлин.де), миРВалк [23] (ввв.мирвалк.умм.уни-хеиделберг.де/) и миРанда [24] (ввв.миц рорна.орг/мицрорна/). После екстракције РНК из 7-дневних УУО узорака бубрега, фракција миРНА присутна у 20 нг укупне РНК је подвргнута реверзној транскрипцији коришћењем миРЦУРИ ЛНА РТ комплета (Екикон, Феедбацк, Данска) према упутствима произвођача. Добијени цДНК су анализирани помоћу миРЦУРИ миРНА ПЦР панела у Роцхе ЛигхтЦицлер 480 ПЦР систему у реалном времену користећи миРЦУРИ ЛНА СИБР Греен ПЦР Мастер Мик (Екикон, Феедбацк, Данска). Сваки узорак је анализиран у дупликату. Ова процедура је обављена у Геномичкој установи Фундацион Паркуе Циентифицо де Мадрид (Мадрид, Шпанија). Софтвер ЛЦ480 је коришћен за добијање вредности Цк (Цк) за сваку миРНА. Делта Цт (ΔЦт) вредност је израчуната нормализацијом вредности Цт на снРНАУ6 ендогеног домаћинства. Топлотна мапа је генерисана са ПЦР подацима у реалном времену представљеним као ΔЦт. Хијерархијско груписање је изграђено према вредностима ΔЦт. Делта Цт (ΔΔЦт) вредност је израчуната одузимањем ΔЦт референтне групе узорака (контролног бубрега) од ΔЦт сваког опструираног узорка бубрега. Релативна квантификација (РК) или фолд-цханге сваке миРНА је генерисана коришћењем 2 − ΔΔЦт методе [17]. Диференцијално изражене миРНА су идентификоване параметарским Лимма тестом. Да би се тестирање више хипотеза узело у обзир, П-вредности су прилагођене (прилагођене) коришћењем Бењамини-Хохбергове корекције стопе лажног открића (ФДР) [25]. Резултати су приказани на графикону вулкана.

анализа миРНА у крвној плазми пацијената са ЦКД. Нивои одабраних миРНА су анализирани у узорцима плазме из кохорте од 100 пацијената са ЦКД, што је детаљно описано у наставку. Периферна венска крв је сакупљена у ЕДТА спрејом обложеним вакутаинерима (БД, Франклин Лакес, Њ). Да би се добила плазма, крв је центрифугирана на 400 г током 20 минута, супернатант је пребачен у нову епрувету и центрифугиран на 800 г током 20 минута. Плазма је сакупљена и ускладиштена замрзнута у аликвотима на -80 ◦ Ц. МиРНА плазме је екстрахована из крви коришћењем комплета за изолацију миРЦУРИТМ РНК—Биофлуидс и УниСп2 Спике-ин РНК (Екикон, Ведбаецк, Данска). Анализе нивоа миР-150 у овим узорцима су обављене као што је описано у одељку за квантификацију поступка експресије миРНА. Мерење брзине потрошње кисеоника. Брзина потрошње кисеоника повезана са оксидацијом масних киселина (ОЦР) (везана за оксидативну фосфорилацију) и брзина екстрацелуларне ацидификације (ЕЦАР) (повезана са производњом лактата и гликолизом) проучаване су коришћењем метаболичког анализатора Сеахорсе Биосциенце према упутствима произвођача [26]. ХКЦ-8 ћелије су засејане у п60 плочу и трансфекција микроРНК је изведена као што је горе описано када су достигле конфлуцију од 70 процената 48 х касније, ХКЦ-8 ћелије су третиране са 10 нг/мл ТГФ{{ 18}} током 48 х. Затим су ћелије засејане са 2 × 104 ћелије по бунарчићу у микроплочи Сеахорсе Биосциенце КСФе24 ћелијске културе (Сеахорсе Биосциенце, Нортх Биллерица, МА). Након адхеренције ћелија, медијум за раст је замењен медијумом ограниченим на супстрат, Дулбеццо-овим модификованим орловим медијумом (ДМЕМ) са додатком 0,5 мМ глукозе и 1 мМ глутамата. Један сат пре мерења теста, ћелије су инкубиране са Кребс-Хенселеит пуфером (КХБ) медијумом за испитивање са додатком 0,2 процента карнитина на 37 ◦ Ц без ЦО2. Петнаест минута пре теста, инхибитор ЦПТ1 Етомоксир (Ето) (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО) 400 μМ је додат у одговарајуће бунарчиће, а ћелије су инкубиране на 37 ◦ Ц без ЦО2. Коначно, непосредно пре теста, додат је БСА или 200 μМ палмитат-БСА ФАО супстрат (Агилент Тецхнологи, Санта Цлара, Калифорнија, САД). Одмах, КСФ Целл Мито Стресс Тест је изведен у анализатору енергије Сеахорсе КСФе24 додавањем узастопно неколико модулатора митохондријалне функције. Прво је коришћен инхибитор АТП синтазе олигомицин (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО) (1 μМ) након базалног мерења. Ово смањује проток електрона кроз ЕТЦ, што доводи до смањења митохондријалног дисања. Затим је додат агенс за раздвајање цијанид 4- (трифлуорометокси) фенилхидразон (ФЦЦП) (СигмаАлдрицх, Ст. Лоуис, МО) (3 μМ), који урушава градијент протона и ремети потенцијал митохондријалне мембране. Као резултат тога, проток електрона кроз ЕТЦ није инхибиран, а потрошња кисеоника комплексом ИВ достиже свој максимум. Трећа и последња ињекција је мешавина инхибитора комплекса ИИИ и И антимицин/ротенон (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО) (1 μМ). Ова комбинација искључује митохондријално дисање и омогућава израчунавање немитохондријалног дисања изазваног процесима изван митохондрија. Супстрати/инхибитори су припремљени у истом медијуму у коме је спроведен експеримент и аутоматски су убризгани из отвора за реагенс у назначено време. Мерења су регистрована за временске периоде од 3-мин (у укупном периоду од 2 х) и вредности су нормализоване за укупан садржај протеина. Протеин је екстрахован из бунара са 0,1 процентним раствором НП-40-ПБС-а и квантификован помоћу БЦА протеинског теста (Тхермо Сциентифиц, Роцкфорд, ИЛ). За сваку експерименталну групу коришћена су четири бунара. Мито Стрес тест КСФп ћелије морског коњића је коришћен за одређивање кључних параметара митохондријалне функције: базално митохондријско дисање, АТП-везано дисање, цурење протона (не-- АТП-повезана потрошња кисеоника), максимално дисање, немитохондријско дисање и резервни респираторни капацитет, као што је претходно описано [27].

Луциферазни тест. Да би се окарактерисала миРНА-150 и миРНА-495 места кандидата за везивање у хуманом ЦПТ1А 3′-УТР, тест луциферазе који садржи ЦПТ1А 3′-УТР (СвитцхГеар Геномицс, Царлсбад, ЦА, Продуцт ИД С814347). Мутације усмерене на локацију у семенским регионима предвиђених миР-150 и миР-495 локација у оквиру 3′ - УТР су генерисане коришћењем комплета за мутагенезу усмерену на више локација (Стратагене, Ла Јолла, ЦА) према према протоколу произвођача. The primer sequences used were for miR-495 PM1 (FW:GCATCATCCAAGCAGGGTAAACTTTTGTTCTAGAAAAA- GAAAAATGTGTTATTCATTGGTGTCCC, RV: GGGACACCAACTTGAA- TAACACATTTTTCTTTTTCTAGAA- CAAAAGTTTACCCTGCTTGGATGATGC) and PM3 (FW: TGTCTTAACGCAGCCATGGTTTGAATCTA- GAATCTTGGGCTGACCGGTGC, RV: GCACCGGTCAGCCCAAGATTCTA- GATTCAAACCATGGCTGCGTTAAGACA) and for miR{{24} } ПМ2 (ФВ: ЦТЦАТГЦГТГТААТЦЦЦАГЦАЦТТЦТАГАГГЦЦААГГЦГГГЦГГ, РВ: ЦЦГЦЦЦГЦЦТТГГЦЦТЦТАГААГТГЦТГГГАТТАЦАЦГЦАТГАГ), Све конструкције су секвенциониране пре употребе да би се потврдило да су правилне структуре. ХКЦ-8 ћелије су засејане у плочу са ап24-бунарићима и привремено су котрансфектоване са 200 нг пЛигхтСвитцх_ЦПТ1А_3′-УТР (неоштећене или мутиране конструкције) и 4 нг пГЛ3-Промотор (луцифераза свиценице под контролом СВ40 промотера) (Промега Цорпоратион, Мадисон, ВИ, САД) репортерски плазмиди и 40 нМ било које мирВана™ миРНА која опонаша миР-150, миР -495 или мирВана™ миРНА имитирају негативну контролу (компанија Амбион, САД) користећи липофецтамине 2000 (Инвитроген, Царлсбад, ЦА) када су достигли конфлуенце од 70 процената као што је горе описано. За сваку експерименталну групу коришћена су четири бунара. Луциферазни тестови су изведени 24 х касније користећи Дуал-Луциферасе репортер систем (Промега, Мадисон, ВИ). Сигнали луциферазе ваниле и свијеће су детектовани коришћењем Гломак мулти детекционог система (Промега Цорпоратион, Мадисон, ВИ, САД). Активност луциферазе ренила је нормализована активношћу луциферазе свитњака.

Потенцијал митохондријалне мембране (ММП). Промене у ММП су одређене као разлике у флуоресценцији тетраметилродамин метил естра (ТМРМ) (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, УСА). Акумулира се у негативно наелектрисаним поларизованим митохондријама и флуоресцира у наранџастој боји. Када се потенцијал митохондријалне мембране сруши у апоптотичким или метаболички стресним ћелијама, ТМРМ реагенс се распршује по ћелијском цитосолу и нивои флуоресценције драматично опадају. ХКЦ-8 ћелије су култивисане и трансфектоване као што је описано у одељцима о ћелијској култури и поступку трансфекције. Затим је медијум за раст замењен Хенковим балансираним раствором соли (ХБСС) без фенола са 10 мМ Хепеса. Третмани олигомицином (5 μМ) и ФЦЦП (4 μМ) у трајању од 5 минута коришћени су као услови позитивне и негативне контроле. Затим су ћелије обојене са 250 нМ ТМРМ током 30 минута на 37 ◦ Ц. Ћелије су сакупљене трипсином, центрифугиране (3000 рпм, 5 мин) и пелета је ресуспендована у 200 μЛ ХБСС са 1 процентом Говеђи серумски албумин (БСА) и 5 ​​мМ етилендиаминтетрасирћетна киселина (ЕДТА). Интензитет флуоресценције је мерен проточном цитометријом коришћењем таласне дужине емисије од 570 нм за ТМРМ (ФЛ2) [28] у систему БД ФацсЦантоТМ ИИ (БД Биосциенце, Сан Јос, ЦА) и анализиран помоћу софтвера ФловЈо 10.2 (ФловЈо, ЛЛЦ, Асх , ИЛИ). За свако експериментално стање, најмање 20.000 синглета је анализирано у три примерка.

Производња ањона радикала митохондријалног супероксида. Процена производње ањона супероксид радикала је извршена коришћењем Мито-СОКС™ Ред митохондријалног супероксидног радикал ањона индикатора (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, УСА), високо селективне флуорогене боје за митохондријални супероксид радикал ањона у живим ћелијама, према произвођачевој упутства. ХКЦ-8 ћелије су култивисане и трансфектоване као што је описано у одељцима о култури ћелија и поступку трансфекције. Затим је медијум за раст замењен Хенковим балансираним раствором соли (ХБСС) без фенола са 10 мМ Хепеса. Третман антимицином А (150 μМ) и карбонил цијанидом м-хлорофенилхидразоном (ЦЦЦП) (50 μМ) у трајању од 5 минута коришћени су као позитивни и негативни контролни услови. Затим су ћелије обојене са 5 μМ МитоСОКС™ Ред током 30 минута на 37 ◦ Ц. Ћелије су сакупљене како је описано у одељку о потенцијалу митохондријалне мембране. Интензитет флуоресценције је мерен проточном цитометријом коришћењем таласне дужине емисије од 580 нм за МитоСОКС™ Ред (ФЛ2) у систему БД ФацсЦантоТМ ИИ (БД Биосциенце, Сан Јос, ЦА) и анализиран помоћу софтвера ФловЈо 10.2 (ФловЈо, ЛЛЦ, Асхланд ИЛИ). За сваки експериментални услов, најмање 20,000 синглета је анализирано у три примерка.

Обележавање митохондрија. Процена садржаја митохондрија је извршена коришћењем МитоТрацкер™ греен ФМ (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, УСА), који пасивно дифундује кроз плазма мембрану и акумулира се у активним митохондријама без обзира на потенцијал митохондријалне мембране, према упутствима произвођача. ХКЦ-8 ћелије су култивисане и трансфектоване као што је описано у одељцима о култури ћелија и поступку трансфекције. Затим је медијум за раст замењен Хенковим балансираним раствором соли (ХБСС) без фенола са 10 мМ Хепеса. Ћелије су обојене са 150 нМ са МитоТрацкер™ зеленим ФМ током 30 минута на 37 ◦ Ц. За анализу проточне цитометрије, ћелије су сакупљене као што је описано у одељку о потенцијалу митохондријалне мембране. Интензитет флуоресценције је мерен коришћењем таласне дужине емисије од 516 нм за са МитоТрацкер™ зелени ФМ (ФЛ1) у систему БД ФацсЦантоТМ ИИ (БД Биосциенце, Сан Јос, ЦА) и анализиран помоћу софтвера ФловЈо 10.2 (ФловЈо, ЛЛЦ , Асхланд, ОР). За сваки експериментални услов, најмање 20,000 синглета је анализирано у три примерка. За флуоресцентно снимање, језгра су такође обојена са ДАПИ (Сигма, Ст. Лоуис, МО) током 5 минута на собној температури. Живе ћелије су визуелизоване инвертованим Зеисс ЛСМ 710 конфокалним микроскопом са посматраном ћелијом, објективом 63Кс/1,2 воде Ц-Апохромат Цорр УВ-ВИС-ИР М27 и анализиране помоћу софтвера Зеисс Зен2010Б сп1 (Зеисс, Оберкоцхен, Немачка) .

Одређивање броја копија митохондрија. Геномска ДНК је екстрахована из ХКЦ-8 ћелија коришћењем ДНеаси Блоод & Тиссуе комплета (Киаген, Валенциа, ЦА) према упутствима произвођача. Бројност митохондрија је одређена помоћу комплета за анализу броја копија људске митохондријалне ДНК (Детроит Р&Д, Детроит, МИ). Релативни број копија мтДНК представљен је као однос мтДНК према нуклеарној ДНК.

Узорци пацијената са ЦКД код људи. Кохорта од 100 пацијената са ЦКД (фаза 3–4) из болнице Принципе де Астуриас је одабрана за анализу нивоа миРНА у плазми. Укључује две различите подгрупе класификоване према еволуцији њихове бубрежне функције на основу ГФР МДРД индикатора [29] током периода од 24 месеца: 50 пацијената је имало мање од 10 проценатабубрегапогоршање функције док су остали доживели смањење функције бубрега од најмање 40 процената или су започелибубрежнисупституциона терапија (дијализа). Такође смо квантификовали степен фиброзе убубрегабиопсије из различите групе од 26 пацијената са дисфункцијом графтабубрегатрансплантација из болнице Рамн и Цајал. Све биопсије су процењене према Банфф 2007 критеријумима [30].

Статистичка анализа. Подаци су анализирани коришћењем непараметарских тестова осим тамо где је назначено. Разлика између две независне групе испитивана је Манн-Вхитнеи тестом, док је више од две групе упоређено Крускалл-Валлис тестом. П-вредност од 0.05 или мање се сматра статистички значајном (*/#: П < 0.05,="" **/##:="" п="">< 0.01,="" ***/###:="" п="">< 0,001).="" подаци="" су="" анализирани="" коришћењем="" грапхпад="" присм="" 6.0="" (грапхпад="" софтваре,="" ла="" јолла,="" ца).="" подаци="" су="" приказани="" као="" средња="" вредност="" ±="" стандардна="" грешка="" средње="" вредности="">

3. Резултати

Подаци о експресији миРНА у УУО-индукованој фиброзибубрези. Да дешифрујемо допринос миРНА метаболичкој регулацијибубрежнифиброгенезе, 7-дневни УУО модел је изведен на ВТ мишевима. РНК је изолована из контролне и фибрознебубрегаузорци и профил експресије миРНА је анализиран у прилагођеном низу микроРНА. Одабир миРНА је заснован на њиховом потенцијалном циљању кључних ензима укључених у метаболизам митохондрија, редокс процесе и циркадијални ритам након анализе „ин силицо“ (више детаља у одељку Методе). Топлотна мапа је открила јасно различите обрасце експресије у неким миРНА када се упореде фиброзне и контролнебубрегаузорци (слика 1А). Анализа вулканског дијаграма показала је да су 73 од 175 миРНА биле различито експримиране, 17 навише и 56 наниже, у узорцима фиброзних бубрега у поређењу са контролним (слика 1Б, додатна табела 1). Међу њима су одабране специфичне миРНА које могу регулисати фиброзни исход у бубрезима путем метаболичких путева. У ту сврху, ин силицо анализа 3′УТР (нетранслатед регион) специфичних гена укључених у метаболичке и митохондријалне функције, ЦПТ1А, ТФАМ, ПГЦ1А је извршена са три независна алата за предвиђање (Таргетсцан, миРВалк и миРанда). Критеријуми селекције су такође укључивали ниво бубрежне експресије, новину циљева, степен знања о метаболичком путу и ​​биолошки значај. Веза са људском патологијом, нивоом експресије у бубрежном ткиву, њиховом улогом у метаболизму митохондрија и њиховим потенцијалним циљањем ензима за пребацивање масних киселина ЦПТ1А подстакли су нас да се фокусирамо на три миРНА, миР-150-5п, миР-495-3п и миР-33-5п, као кандидати способни да регулишу метаболичке промене повезане са бубрежном фиброгенезом (слика 1Ц). Треба напоменути да ЦПТ1А 3′-УТР садржи једно семенско место за миР-150 и два семена за миР-495. Приметили смо да су миР-150 и миР-495 смањили активност репортерског теста луциферазе који садржи ЦПТ1А 3′-УТР за ~15 процената и 25 процената, респективно. Ова смањена регулација је потпуно укинута у случају тачкастих мутација (ПМс) у 3′-УТР ЦПТ1А за миР-150 везујуће место (ПМ2) и делимично одсутна у оба миР-495 места везивања (ПМ1 и ПМ3) (додатна слика 1А и Б). Ови подаци указују на директну интеракцију ЦПТ1А са миР-150 и миР-495. МиР-33-5п је био предмет посебне студије [15]. МиР-150-5п и миР-495-3п су повећани у фибротичним узорцима бубрега у поређењу са контролним, са променом пута од 3,69 (П-вредност: 0.012 ) и 1,95 (П-вредност: 0,012), респективно.

МиР-150 и миР-495 побољшавају ТГФ-профибротски одговор код људибубрежнитубуларне епителне ћелије. Извршена је квантитативна реверзна транскрипција – ланчана реакција полимеразе (кРТ–ПЦР) да би се потврдила промена експресије миР-150-5п и миР-495-3п која је идентификована профилисањем експресије миРНА у УУОбубрегаузорци (сл. 2А и Б). Поред тога, кРТ-ПЦР-ом је анализирана кинетика експресије миР-150-5п и миР- 495-3п у бубрезима 3, 5, 7, 10 и 15 дана након УУО процедуре. Експресија ових миРНА је значајно повећана 2- пута 5 дана након УУО и остала је повишена 15 дана након УУО (Слике 2Ц и Д). Ниво експресије ових миРНА је такође процењен у моделу нефропатије фолне киселине (ФАН). Пронашли смо 4- и 2-преструку регулацију миР-495-3п и миР-150-5п, респективно, у фиброзномбубрегаузорци из модела ФАН (слика 2Е). ТГФ- 1, један од главних регулатора фиброгенезе, такође је индуковао експресију миР-150 и миР-495 у ХКЦ-8 ћелијама више него 2-више и {{ 6}}, респективно, после 48 х, подржавајући потенцијалну улогу ових миРНА у догађајима повезаним са ТГФ сигнализацијом (Слике 3А и Б). Да би се проценило да ли су миР-150 и миР-495 укључени у профибротску трансформацију тубуларних епителних ћелија помоћу ТГФ- 1, људска ћелијска линија ХКЦ-8 је трансфектована миР -150-5п или миР-495-3п и третирани ТГФ- 1 различито време. Повећање нивоа миР-150-5п и миР-495-3п значајно је побољшало ТГФ- 1-индуковану експресију мРНА на нивоу маркера Ацта2, Цол1 1 и Фн1 повезаних са фиброзом ( Слика 3Ц и Д). Слично, прекомерна експресија миР-150-5п или миР-495-3п снажно је смањила ЦПТ1А и повећала обиље протеина -СМА (Слике 3Е и Ф). Ови подаци сугеришу да ове миРНА могу учествовати у патогенезибубрежнифиброзе промовисањем дедиференцијације епитела тубуларних ћелија зависне од ТГФ- 1-, као и компромитовањем експресије критичног ензима укљученог у ФАО.

МиР-150 и миР-495 индукују митохондријалне биоенергетске промене и смањују експресију гена укључених у кључну функцију митохондрија. Да бисмо стекли увид у метаболичке последице изазване применом миР-150-5п или миР-495-3п, проучавали смо биоенергетски профил човекабубрежнитубуларне епителне ћелије.

Слика 1. Подаци о експресији миРНА у фибрози изазваној УУО. (А) Топлотна мапа која показује релативну експресију миРНА контралатералне и опструкиранебубрезиод Ц57/БЛ6-Ј мишева подвргнутих УУО процедури током 7 дана (н=6). Трака скале се креће од зелене до црвене (високе до ниске експресије), а бројеви представљају вредности ΔЦт. На левој страни су назначене миРНА одабране за проучавање. (Б) Анализа дијаграма вулкана УУО-модулираних миРНА. Лог10 релативна квантификација (РК) и негативна (−) лог10 прилагођена (прилагођена) П-вредности су исцртане на к- и и-оси, респективно. Свака миРНА је представљена тачком. 73 од 175 миРНА су показале измењену експресију у фибротичним узорцима (прилагођена П-вредност већа или једнака 0,05). Одабране миРНА за даљу анализу су истакнуте. (Ц) миР-150-5п и миР-495-3п су одабрани на основу њихове моћи за ин силицо циљање гена ЦПТ1А, ТФАМ и ПГЦ1А. За сваку одабрану микроРНК, назначена су очувана циљна места семена у 3'УТР ових гена, њихова промена набора и значај (прилагођена П-вредност).

Слика 2. Нивои експресије миР-150-5п и миР-495-5п инбубрезиод модела УУО и ФАН. (А, Б) кРТ-ПЦР анализа експресије миР-150-5п (А) и миР-495- 3п (Б) убубрезиод мишева 7 дана након УУО у узорцима који су претходно анализирани помоћу микроРНА низа. (Ц–Е) кРТ-ПЦР анализа експресије миР-150-5п и миР-495-3п након ФАН модела (Ц) и 3, 5, 7, 10 и 15 дана након УУО за миР-150-5п (Д) и миР{{10}}п (Е). Ступасти графикони представљају средњу вредност нивоа експресије промене набора ± сем од 6 (А, Б, Е) и 3 (Ц и Д) мишева по групи. *П < 0.05,="" **п="">< 0.01,="" ***п="">< 0,001="" у="" поређењу="" са="" њиховим="" одговарајућим="" контролним="" условима;="" #п="">< 0,05,="" ##п="">< 0,01="" у="" поређењу="" са="">бубрезиод мишева са истим експерименталним третманом.

ТГФ- 1 је коришћен као модел цитокина укључен у промене повезане са профиброзом. Да би се утврдио биоенергетски статус ових ћелија, ФАО повезана стопа потрошње кисеоника (ОЦР) и екстрацелуларна стопа ацидификације (ЕЦАР) ХКЦ-8 ћелија су мерене током секвенцијалног третмана једињењима која модулирају митохондријалну активност у присуству палмитата. , користећи Сеахорсе КСФ24 Ектрацелулар Флук Анализер (више детаља у одељку Методе). После 48 сати са ТГФ- 1, ХКЦ-8 ћелије у присуству миР-150-5п показале су конзистентан пад базалног, ОЦР у комбинацији са стварањем АТП-а, АТП-везано дисање и максимално дисање, што односи се на ФЦЦП-осетљив ОЦР (слика 4А). Оштећење у ОКСПХОС-у се огледа у смањењу садржаја АТП-а у ХКЦ-8 ћелијама које прекомерно експримирају миР-150-5п (слика 4Ц). Нисмо приметили да ове миРНА изазивају варијације у ЕЦАР-у (подаци нису приказани). У складу са овим, нивои експресије мРНК њихових митохондријалних

сродни циљни гени ЦПТ1А, ПГЦ1 и митохондријални транскрипциони фактор А (ТФАМ), смањени су за половину у ћелијама третираним миР-150 мимиком у поређењу са ћелијама које опонашају миРНА НЦ-третиране (слика 4Е). Студије које су користиле исти експериментални приступ са миР-495-3п су дале сличне резултате (сл. 4Б, Д, Ф). Међутим, митохондријална маса, одређена бројем копија мтДНК и бојењем митохондрија са МитоТрацкерТМ зеленим ФМ, није значајно модулисана миРНА-150 и миРНА- 495 како у базалним условима тако и под третманом ТГФ. У основи је примећен тренд смањења овог параметра (додатна слика 2А, Б, Ц). Све у свему, ови подаци подржавају да миР-150 и миР-495 промовишу а

про-фибротично деловање у тубуларним епителним ћелијама кроз оштећење митохондријалне функције.

МиР-150 и миР-495 не мењају митохондријални трансмембрански потенцијал (Δм) и митохондријални супероксидни радикал

Слика 3. МиР-150 и миР-495 појачавају ТГФ- 1-зависни профибротични одговор код људибубрежнитубуларне епителне ћелије. (А, Б) РТ–ПЦР анализа експресије миР{{0}}п (А) и миР-495-3п (Б) у ХКЦ-8 ћелијама третираним са 1{{24 }} нг/мл ТГФ- 1 за наведена времена. (Ц, Д) нивои мРНК алфа-актина глатких мишића (-СМА), алфа 1 типа-1 колагена (Цол1 1), фибронектина (ФН) из ћелија трансфицираних миР-НЦ и мимичним миР -150-5п (Ц) или миР-495-3п (Д) су одређени кРТ-ПЦР коришћењем Сибр греен. Ћелије су третиране ТГФ- 1 (10 нг/мл) након прекомерне експресије миРНА где је назначено (видети такође одељак о методама). (Е, Ф) Имуноблотови који приказују нивое протеина ЦПТ1А и -СМА у ћелијама трансфектованим са миР-НЦ и имитирају миР-150-5п (Е) или миР{{20}}п (Ф) за назначене временске тачке. ГАПДХ је коришћен у сврху нормализације. Ступасти графикони (десни панели) представљају средњу вредност израза промене набора ± сем из 3 независна експеримента. *П < {{30}}.05,="" **п="">< 0,01,="" ***п="">< 0,001="" у="" поређењу="" са="" њиховим="" одговарајућим="" контролним="" условима;="" #п="">< 0,05,="" ##п="">< 0,01,="" ###п="">< 0,001="" у="" поређењу="" са="" ћелијама="" третираним="" мир-нц="" са="" истим="" експерименталним="">

Слика 4. МиР-150 и миР-495 појачавају ТГФ 1-индуковану ФАО репресију у ХКЦ-8 ћелијама. (А, Б) Стопа потрошње кисеоника (ОЦР) ћелија ХКЦ-8 трансфицираних са

40 нМ миР-НЦ и имитирају миР-150-5п (А) или миР-495-3п (Б) и изложени 10 нг/мл ТГФ{{5} } након прекомерне експресије миРНА (погледајте такође одељак о методама). Ступасти графикони (десни панели) показују стопе ОЦР-а повезане са базалним, протонским цурењем, АТП-везаним, максималним и резервним капацитетима и немитохондријалним респираторним статусима. Подаци су представљени након нормализације количином протеина. (Ц, Е) Нивои АТП-а у ХКЦ-8 ћелијама трансфектованим са миР-НЦ и опонашају миР-150-5п (Ц) или миР-495-3п (Е). (Д, Ф) нивои мРНА ЦПТ1А, ПГЦ1А и ТФАМ у ХКЦ-8 ћелијама трансфектованим са миР-НЦ и мимиком миР-150-5п (Д) или миР-495-3п (Ф) су одређено кРТ-ПЦР коришћењем Сибр греен. Ступасти графикони показују средњу вредност ± сем за 4 независна експеримента. *П < 0.05,="" **п="">< 0.01,="" ***п="">< 0,001="" у="" поређењу="" са="" њиховим="" одговарајућим="" контролним="" условима;="" #п="">< 0,05,="" ##п="">< 0,01,="" ###п="">< 0,001="" у="" поређењу="" са="" ћелијама="" третираним="" мир-нц="" са="" истим="" експерименталним="">

производња ањона. Потенцијал митохондријске мембране (ΔΨм) генерисан протонским пумпама (комплекси И, ИИИ и ИВ) је суштинска компонента у процесу складиштења енергије током оксидативне фосфорилације. Повећани ΔАм може довести до митохондријалног редокс пертурбације, док његово смањење узрокује смањење производње АТП-а, угрожавајући виталност ћелије [254]. Ањон супероксидних радикала (О2•−) је слободни радикал који се може генерисати у митохондријама као последица цурења електрона до којег може доћи у неколико корака ЕТЦ. Генерисање О2•− унутар митохондријалног матрикса такође критично зависи од НАДХ/НАД плус и ЦоКХ2/ЦоК односа и локалне концентрације О2 [255]. Његова прекомерна производња може довести до губитка митохондријалне редокс хомеостазе кроз различите механизме, стање које је повезано са многим патолошким стањима укључујући АКИ и ЦКД [201]. ΔЗм је испитиван ТМРМ бојом и продукција ањона радикала супероксида са МитоСОКС бојом. Прво смо потврдили ове тестове третирањем ћелија са ФЦЦП и ЦЦЦП као негативним контролама, за ТМРМ и МитоСОКС респективно, и олигомицином и Антимицином А као позитивним контролама, за ТМРМ и МитоСОКС респективно, у хуманој ћелијској линији ХКЦ{{7} }. У случају ТМРМ теста, третман олигомицином је индуковао 3-путоструко повећање средње вредности флуоресценције ТМРМ у поређењу са контролном бојом, док је третман са ФЦЦП резултирао 9- пута смањењем. Антимицин А и ЦЦЦП су произвели 35-путоструко повећање и 2-струко смањење, респективно, у МитоСОКС тесту (додатна слика 3А и Б). Да би се утврдило да ли су миР-150 и миР-495 ефекти на метаболизам митохондрија изазвали промене у овим параметрима, ХКЦ{15}} ћелије су трансфектоване миР-150-5п или миР{{17} }п мимиц или одговарајући миР-НЦ. Нису пронађене статистички значајне разлике у квантификацији флуоресценције ТМРМ или МитоСОКС сонди између услова третмана са одабраним миРс и миР-НЦ (додатна слика 3Ц).

Нивои МиР-150 и миР-495 нису под утицајем у узорцима плазме и бубрега пацијената са ЦКД. Процењивали смо експресију одабраних миРНА у биопсијама плазме и бубрега пацијената са ЦКД. Анализа биопсија бубрега од 26 пацијената (Хоспитал Рамн и Цајал) није показала корелацију између степена фиброзе и нивоа миР-150-5п и миР-495-3п (додатна слика 4А и Б) . Циркулишући нивои миР-150-5п у плазми, миРНА са највећом експресијом бубрега од ова два, такође су одређени у кохорти од 100 пацијената са ЦКД (Хоспитал Принципе де Астуриас). Због ограничења доступности узорака, нисмо били у могућности да одредимо серумске вредности миР- 495-3п у овој кохорти. Ови пацијенти су претходно били подељени у две подгрупе на основу еволуције њихове бубрежне функције током периода од 24 месеца, тако да је 50 пацијената имало мање од 10 процената погоршања функције бубрега, док су остали доживели најмање 40 процената смањења бубрежне функције. функција. кРТ-ПЦР квантификација нивоа миР-150-5п у плазми није показала јасан тренд ка диференцијалној експресији у две подгрупе пацијената (додатна слика 4Ц).

4. Дискусија

Откриће миРНК као кључних регулатора патофизиолошких процеса подстакло је истраживање о њиховој употреби као терапеутских агенаса у скоро свим клиничким условима, укључујући болест бубрега [31]. Бубрежна фиброза је веома распрострањен исход хроничне болести бубрега (ЦКД) са независношћу од етиологије, а њено присуство је јасан предиктор еволуције. Стога је значајан напор уложен у идентификацију миРНК повезаних са фиброзом бубрега [32,33]. У овој студији смо се фокусирали на све важнију улогу метаболичког поремећаја убубрежниоштећењаи идентификовали смо две миРНК, миР-150 и миР-495, који су раније били непознати актери на сцени. Штавише, открили смо да имају дубок ефекат на ћелијску биоенергетику тако што се синергишу са ТГФ-ом и модификују кључне метаболичке путеве у вези са маснимкиселина оксидације.

Повреда епитела коегзистира са дефектом мастикиселинаоксидације, главни извор енергије за тубуларне епителне ћелије [5]. То доводи до њихове дедиференцијације која изазива оштећење тубуларне функције, изазива заустављање ћелијског циклуса и промовише ослобађање критичних профибротичких цитокина који могу допринети активацији интерстицијалних миофибробласта [5,34]. МиР-150 и миР-495 експресија је повећана код мишафибрознибубрезиа уљудски бубрегаепителне ћелије (ХКЦ-8) након третмана са ТГФ-, што сугерише њихово учешће у профиброзном одговору. Од интереса, ин силицо анализа геномских региона који кодирају миР-150 и миР-495 дозвољава идентификацију места везивања за факторе транскрипције који се односе на ТГФ-сигнализацију и друге путеве укључене у оштећење УУО (претраге у генецардс.орг за миР-150 и миР-495). И миР-150 и миР-495 су смањили ниво експресије својих циљних гена ЦПТ1А, ПГЦ1 и ТФАМ, што се огледало у смањеном базалном, АТП-везаном и максималном садржају ОЦР и АТП након третмана са миР-150 и миР-495. Овај ефекат је био праћен појачаним ТГФ-профибротичним одговором у ХКЦ-8 ћелијама. Открили смо да је ТГФ смањио митохондријалну масу и митохондријалну ДНК. Након третмана са миРНА-150 и миРНА-495, примећен је тренд смањења митохондријалног садржаја у базалним условима, иако није достигао значај. Ово указује на механизам независан од улоге ПГЦ1 или ТФАМ и највероватније повезан са метаболичким ефектом повезаним са смањењем регулације ЦПТ1А као главне варијабле на коју утиче присуство миРНА. Промене у митохондријској биоенергетици су критичне код болести бубрега [35]. Имајући у виду, недавно смо показали да је ЦПТ1А критичан ензим за очување здравог тубуларног одељка, пошто његова прекомерна експресија штити од фиброзе бубрега [6]. Међутим, ПГЦ1

и ТФАМ гени су такође блиско повезани са функцијом митохондрија и биогенезом [36]. Поремећена експресија ових гена је повезана са ЦКД, док њено очување доприноси интегритету бубрега као што је приказано у неколико модела оштећења. Дакле, Хан ет ал. открили су да тубуларни добитак функције ПГЦ1 штити мишеве од фиброзе бубрега изазване Нотцхом и преокреће митохондријалну дисфункцију повезану са овим моделом [37]. Слично, поновна експресија Тфам у ћелијама тубула спречила је Нотцх-индуковано метаболичко и профибротичко репрограмирање [38]. Стога је могуће замислити да смањена експресија мРНК ових митохондријалних гена, изазвана миР-150 и миР-495, такође доприноси оштећеном епителном фенотипу.

Пад који смо приметили у ОЦР-у повезан са оштећењем епителних ћелија је у складу са претходним извештајима, укључујући наше студије са миР-33 и миР-9 [15,16]. Док Канг ет ал. такође је известио да је оксидација глукозе била нижа у моделима фиброзе бубрега код људи и миша [5], наши подаци показују да смањење ОЦР посредовано микроРНА не изазива пер се варијације у ЕЦАР-у, што сугерише да гликолитичко гашење у фиброзним условима највероватније зависи на фиброзне стимулусе, а не на поремећену оксидативну фосфорилацију. Неколико миРНА је идентификовано као главни модификатори митохондријалне функције, укључујући архетипску профибротичну миРНА, миР-21 [39]. Потискивање ППАР-експресије миР-21 је призвано као механизам којим ова миРНА испољава своје профибротичко дејство. Поред инхибиције ФАО, циљни гени за миР-21 указују на то да ова миРНА утишава широк спектар митохондријалних процеса. Други примери укључују мир-9 [16], миР-33 [15] и миР-30е [40,41]. Међутим, према нашим сазнањима, постоји неколико извештаја који се баве регулацијом микроРНА гена ЦПТ1А, ПГЦ1 и ТФАМ у контексту фиброзе бубрега. Занимљиво је да микроРНА-214 која промовише епителну-мезенхимску транзицију (ЕМТ) током реналне фиброзе, директно циља ТФАМ у ћелијама рака дебелог црева [42]. Ова репресија је такође пријављена за миР-590-3п [43]. Породица миР-29, један од најбоље окарактерисаних регулатора производње ЕЦМ у фибрози органа, директно циља на ПГЦ1, чувајући срчану хомеостазу. Дакле, патолошко утишавање миР-29 доводи до повећања регулације ПГЦ1, стварајући дубоке промене у митохондријалној биогенези које доприносе срчаним обољењима [44]. Иако наши подаци јасно говоре у прилог улози миР-150 и миР-495 у фибрози бубрега, била би неопходна даља истраживања ин виво да би се потврдила ова тврдња.

Да бисмо проценили интегритет митохондријалног ланца транспорта електрона (ЕТЦ), фокусирали смо се на две карактеристике: ΔАм и производњу ањона радикала супероксида. Приметили смо да миР-150 и миР-495 нису променили ове параметре. Стабилан ΔКм је неопходан за виталност ћелије и његова величина варира међу типовима ћелија [45]. Његово одржавање је стриктно фино подешено јер повећање ΔѰм може довести до поремећаја у редокс стању, док његово смањење узрокује смањење производње АТП-а и може покренути апоптозу. У нашој студији, промене у ΔАм су квантификоване катјонском флуоресцентном бојом ТМРМ, док је производња ањона радикала митохондријалног супероксида мерена флуорогеном бојом МитоСОКС Ред. Примена ових средстава у условима који утичу на функцију бубрега није упадљива у литератури. Ипак, с обзиром на одсуство промена у нашој студији, нисмо се бавили детаљнијим другим стратегијама за процену редокс хормезе, па стога не можемо искључити да ове миРНА могу променити нуклеофилни тон или функцију неколико компоненти ЕТЦ.

У клиничком окружењу, миР-150 је предложен као профибротична миРНА код лупус нефритиса модулацијом ТГФ-сигнализације [46,47], док је миР-495 био повезан са заштитном улогом код дијабетичара фиброза [48]. Да бисмо сазнали њихову потенцијалну укљученост у ЦКД, проценили смо њихове серумске и паренхимске нивое у две различите групе пацијената. Нивои миРНА у серуму су предложени као потенцијални биомаркери за прогресију ЦКД [49,50]. Дакле, нивои миР-21 у циркулацији у серуму и обиље миР-29ц у уринарним егзозомима корелирају са фиброзом бубрега, што указује на њихову потенцијалну улогу биомаркера [51, 52]. Међутим, нивои миР-150 и миР-495 нису се разликовали ни у узорцима плазме ни у узорцима бубрега пацијената са ЦКД. Различити обрасци експресије микроРНА међу врстама и типовима ћелија могу да објасне ово одсуство разлике у нивоима миР-150 и миР-495 у фибротичном ткиву [53]. Док би у неким случајевима пријављени нивои микроРНК у плазми могли да одражавају оне у ткиву бубрега, треба узети у обзир и друге механизме који се односе на лучење миРНК у циркулаторни систем или противтежу овог лучења од стране других органа [13,54].

Све у свему, наши резултати подржавају промоцију миР-150 и миР-495бубрежниепителнећелијадедиференцијација највероватније кроз депривацију енергије, која се преноси потискивањем гена повезаних са митохондријалним функцијама ЦПТ1А, ПГЦ1 и ТФАМ. Они такође дају основу за наставак своје улоге ин виво, као и њихову потенцијалну корисност као дијагностички или прогностички биомаркери.

Прилози аутора

СЛ осмислио и усмерио истраживање. ВМ је дизајнирао, извео и анализирао већину експеримената. РР је помогао у анализи микроРНА низа. ДРП и ЛГБ су спровели студије у две различите кохорте пацијената са ЦКД. Сви аутори су помогли у дискусији о резултатима, а СЛ и ВМ су написали рукопис.

Изјава о конкурентном интересу

Аутори немају сукоба интереса.

Признања

Овај рад је подржан грантовима шпанског Министарства науке САФ2015-66107-Р и ПИД2019-104233РБ-И00 (СЛ), ПИ17/ 01513 (ДРП) које суфинансирају европски Фонд за регионални развој, Институто де Салуд Царлос ИИИ РЕДинРЕН РД12/0021/0009 и РД16/ 0009/0016 (СЛ и ДРП), ФИС ПИ17/00625 (ДРП), Цомунидад де Мадрид "НОВЕЛРЕН" Б2017/БМД3751), (СЛ и ДРП) бесповратна помоћ Шпанског друштва за нефрологију (Фундацин Сенефро 2017) за СЛ и ФундационРенал"Ииго Алварез де Толедо" (СЛ) сви из Шпаније. ЦБМСО добија институционалну подршку од Фондације „Рамн Арецес“. ВМ је подржала преддокторска стипендија ФПИ програма (БЕС- 2013-065986) шпанског Министарства науке.