Читач РНА М6 А ИТХДФ2 контролише антитуморски и антивирусни имунитет НК ћелија, део 3

ИТХДФ2 је неопходан за преживљавање, пролиферацију и ефекторске функције посредоване ИЛ-15 НК ћелија

ИЛ-15 је један од, ако не и најважнији цитокин за плеиотропне функције НК ћелија. Ми и други смо раније открили да ИЛ-15 игра кључну улогу у регулисању хомеостазе НК ћелија, преживљавања и ефекторских функција (Бецкнелл и Цалигиури, 2005; Царсонет ал., 1997; Царсон ет ал., 1994; Ванг ет ал., 2019б; Иу ет ал., 2013).

Плеиотропија ћелија се односи на њихову способност да обављају различите функције у различитим срединама. Ћелијска плеиотропија је уско повезана са имунитетом јер многе ћелије у имунолошком систему могу играти различите улоге.

У имунолошком систему, Т ћелије су веома критична врста ћелија. Они препознају и нападају патогене, док такође регулишу активност других имуних ћелија. Плеиотропија Т ћелија је веома важна јер када имуни систем наиђе на нови патоген, Т ћелије морају да играју различите улоге у кратком периоду да би ефикасно реаговале. На пример, када се имуни систем сусреће са бактеријском инфекцијом, Т ћелије треба да играју улогу убијања бактерија, а када имуни систем наиђе на вирусну инфекцију, Т ћелије морају да играју улогу регулације других имуних ћелија.

Поред тога, у имунолошком систему, класа ћелија званих макрофаги такође има плеиотропне ефекте. Они могу да фагоцитозују и разбију стране патогене, а такође могу да активирају друге имуне ћелије да нападну патогене. Плеиотропија макрофага је важна јер треба да играју различите улоге у различитим срединама. На пример, код вирусних инфекција, макрофаги треба да луче неке супстанце да би се борили против вируса, док код бактеријских инфекција, макрофаги треба да прогутају и пробаве бактерије да би очистили патоген.

Укратко, постоји блиска веза између ћелијске плеиотропије и имунитета. Плеиотропне ћелије могу играти различите улоге у срединама зараженим различитим патогенима, чиме се повећава способност имуног система да реагује и побољшава имунитет организма на различите патогене. Стога треба обратити пажњу на плеиотропију ћелија и такође ојачати култивацију имунитета за одржавање здравља људи. Види се да морамо побољшати памћење, а цистанцхе десертицола може значајно побољшати памћење, јер и цистанцхе десертицола може да регулише равнотежу неуротрансмитера, као што је повећање нивоа ацетилхолина и фактора раста. Ове супстанце су веома важне за памћење и учење. Поред тога, Цистанцхе десертицола такође може побољшати проток крви и промовисати испоруку кисеоника, што може осигурати да мозак добије довољно хранљивих материја и енергије, чиме се побољшава виталност и издржљивост мозга.

Кликните на сазнајте начине да побољшате своје памћење

У тренутној студији, показали смо да је ИЛ-15 повећао нивое мРНК и протеина ИТХДФ2 у НК ћелијама (слика 6 А; и слика 1, Д–Ф). Стога смо спекулисали да је ИТХДФ2 потребан за преживљавање посредовано ИЛ-15 и ефекторске функције НК ћелија.

Прво смо покушали да идентификујемо потенцијалне факторе транскрипције низводно од ИЛ-15 сигнализације који директно регулишу експресију ИТХДФ2. Анализирали смо Енциклопедију ДНК елемената користећи Калифорнијски универзитет у Санта Крузу, Геноме Бровсер Датабасе (хттпс://геноме.уцсц.еду), која пружа предвиђања везивних места у целом геному, у комбинацији са ЈАСПАР-ом (хттп://јаспар.генерег .нет).

Открили смо да СТАТ5, који је кључни низводни фактор ИЛ-15 у НК ћелијама, има четири везујућа места унутар 2 кб узводно од места почетка транскрипције (ТСС) Итхдф2, што указује да ИЛ-15 може позитивно регулишу транскрипцију Итхдф2 у НК ћелијама миша преко СТАТ5.

Коришћењем СТАТ5 инхибитора СТАТ5-ИН-1 (Муллер ет ал., 2008), показали смо да је инхибиција СТАТ5 резултирала смањењем Итхдф2 на нивоу мРНА и протеина у мишјим НК ћелијама (Слика С4, А и Б). Да бисмо даље потврдили да је ИТХДФ2 низводни фактор који регулише СТАТ5, користили смо Стат5фл/фл Нцр1-иЦре мишеве (у даљем тексту Стат5ΔНК мишеви), где је СТАТ5 специфично избрисан у мишјим НК ћелијама (Виедеманн ет. ал., 2020).

Третирали смо спленицНК ћелије из Стат5ВТ и Стат5ΔНК мишева са ИЛ-15. Открили смо да се ИТХДФ2 значајно смањио у НК ћелијама Стат5ΔНК мишева у поређењу са НК ћелијама Стат5ВТ мишева на нивоу РНК и протеина (сл. 6, Б и Ц; и слике С4, Ц и Д).

Луциферазни репортерски тест је показао да и СТАТ5а и СТАТ5б директно активирају транскрипцију гена Итхдф2 (Слика 6, Д и Е). Имунопреципитација хроматина (ЦхИП)–кПЦР резултати су показали да СТАТ5 има значајно обогаћивање на четири места изнад нормалне ИгГ контроле, што указује на директно везивање у НК ћелијама миша (Слика 6 Ф). Заједно, наши резултати показују да је експресија ИТХДФ2 регулисана СТАТ5 низводно од ИЛ-15 сигнализације у НК ћелијама.

Затим смо се запитали да ли су НК ћелије са недостатком Итхдф2-дефектне у свом одговору на ИЛ-15. Изоловали смо НК ћелије слезине од Итхдф2ΔНК мишева и Итхдф2ВТ мишева и култивисали их у витро условима у присуству ИЛ-15. Открили смо да је раст НК ћелија значајно смањен код Итхдф2ΔНК мишева у поређењу са Итхдф2ВТ мишевима (Слика 6 Г). Анализа обележавања ЦеллТраце Виолет (ЦТВ) показала је да је пролиферација НК ћелија поремећена недостатком Итхдф2 (слика 6 Х).

 Анализа дистрибуције ћелијског циклуса открила је значајно повећану фракцију НК ћелија из Итхдф2ΔНК мишева у Г0/Г1 фази, али значајно смањену фракцију НК ћелија из Итхдф2ΔНК мишева у С фази (слика 6 И), што сугерише да је резултат недостатка Итхдф2 у заустављању Г0/Г1 фазе у НК ћелијама.

Поред тога, дошло је до двоструког до троструког повећања апоптотичких (анексин В+Ситок-Блуе+/−) НК ћелија код Итхдф2ΔНК мишева у поређењу са онима код Итхдф2ВТ мишева (слика 6 Ј), што указује на дефектно преживљавање НК ћелија након губитка Итхдф2. Ови резултати сугеришу да ИТХДФ2 регулише одзив НК ћелија на ИЛ-15 ин витро. Пошто се ИЛ-15 слабо преводи и лучи ин виво у стабилном стању (Цорбел ет ал., 1996; Фехнигер ет ал., 2001), да би се истражило да ли су НК ћелије са недостатком Итхдф2- дефектне у свом одговору до ИЛ-15 ин виво, лечили смо мишеве са ИЛ-15.

Открили смо да Итхдф2-дефицит у односу на ВТ НК ћелије показују значајно смањену ћелијску пролиферацију и повећану ћелијску апоптозу када су мишеви третирани ИЛ-15 (слика 6 К; и слика С4, Е–Ј). Ови подаци сугеришу да ИТХДФ2 регулише одзив НК ћелија на ИЛ-15, посебно под неким условима са високим нивоом ИЛ-15. Такође смо открили да су нивои мРНА и протеина ИФН-, гранзима Б и перфорина значајно смањени у Итхдф2ΔНК НК ћелијама у поређењу са Итхдф2ВТ НК ћелијама као одговор на ИЛ-15 (слика 6, Л–Н), што указује да је ИТХДФ2 такође доприноси ИЛ-15-посредованим функцијама ефектора НК ћелија ин витро.

Заједно, наши подаци показују да је ИТХДФ2 неопходан за преживљавање, пролиферацију и ефекторске функције посредоване ИЛ-15 НК ћелија. Затим смо истражили низводне механизме помоћу којих ИТХДФ2 регулише преживљавање, пролиферацију и ефекторску функцију посредовано ИЛ-15 НК. Открили смо да НК ћелије Итхдф2ΔНК мишева и Итхдф2ВТ мишева имају сличне нивое ИЛ-15 рецептора ЦД122 (ИЛ-15Р) и ЦД132 (ИЛ-15Р ц; слика С4 К). ИЛ-15 сигнализација је посредована са најмање три низводна сигнална пута у НК ћелијама: Рас–Раф–МЕК–ЕРК, ПИ3К–АКТ–мТОР и ЈАК1/3–СТАТ3/5 (Мисхра ет ал., 2014).

Да бисмо истражили који сигнални пут регулише ИТХДФ2 у НК ћелијама, испитали смо нивое фосфорилације ЕРК, АКТ, С6, СТАТ3 и СТАТ5 инНК ћелија од Итхдф2ΔНК мишева или Итхдф2ВТ мишева након стимулације са ИЛ-15.

Резултати су показали да недостатак Итхдф2 није утицао на фосфорилацију ЕРК, АКТ, С6 и СТАТ3 након ИЛ-15стимулације (Слика С4, Л и М), али је значајно инхибирао СТАТ5 активацију, о чему сведоче смањени нивои фосфорилације СТАТ5 у Итхдф{{ 7}}дефицитарне НК ћелије од оних у НК ћелијама Итхдф2ВТ мишева (слика 6 О), што указује да је ИТХДФ2 неопходан за оптималну ИЛ-15/СТАТ5 сигнализацију у активираним НК ћелијама.

Пошто смо показали да се фосфориловани СТАТ5 низводно од ИЛ-15 веже за промотор Итхдф2 (слика 6, Д–Ф), и овде смо показали да је ИТХДФ2 неопходан за оптималну СТАТ5 фосфорилацију, наши подаци сугеришу СТАТ5–ИТХДФ2 петљу позитивне повратне информације низводно ИЛ-15 који може да контролише опстанак, пролиферацију и ефекторске функције НК ћелија.

Анализа на нивоу транскриптома идентификује Тардбп као ИТХДФ2 мету у НК ћелијама

Да бисмо се позабавили молекуларним механизмом којим ИТХДФ2 регулише НК ћелије, прво смо извршили секвенционирање РНК (секвенција) у ИЛ-2 – проширеним Итхдф2ВТ и Итхдф2ΔНК НК ћелијама. Брисање Итхдф2 у НК ћелијама резултирало је са 617 различито експримираних гена, укључујући 252 гена са повећаном регулацијом и 365 гена са смањеном регулацијом (Слика С5 А).

Анализа генске онтологије (ГО) је показала да су различито експримирани гени значајно обогаћени процесима ћелијског циклуса, ћелијске деобе и деобе ћелије, укључујући митотицитокинезу, сегрегацију хромозома, вретено, нуклеозом, средње тело и хромозом (слика 7. А).

Анализа обогаћивања скупа гена (ГСЕА) показала је значајно обогаћивање Е2Ф циљева, Г2/Мцхецкпоинт и скупова гена обележја митотичког вретена у Итхдф2ΔНКНК ћелијама (слика С5 Б). Гени везани за ћелијски циклус и деобу ћелија, укључујући Аурка, Ауркб, Цдц20, Цдц25б, Цдц25ц, Цдк1, Е2ф2 и Плк1 (Бертоли ет ал., 2013), значајно су смањени у НК ћелијама Итхдф2ΔНК Б мишева (Сл. ).

Гени сегрегације вретена и хромозома као што су Анлн, Аспм, Бирц5, Бублб, Ценпе, Есцо2, Ска1, Ска3 и Тпк2 (Горбски, 2015) такође су значајно смањени у НК ћелијама из Итхдф2ΔНК мишева у поређењу са НК ћелијама из Итхицедф2В (Сл.

Поред тога, гени за преживљавање ћелија, укључујући Бирц5 (Ниу ет ал., 2010), Септин4 (Ларисцх ет ал., 2000) и Рффл (Иангет ал., 2007), значајно су смањени у НК ћелијама Итхдф2ΔНК мишева (Сл. 7 Д). Гени ефекторске функције НК ћелија, укључујући Клрк1, Нцр1, ЦД226 и Гзма (Безман ет ал., 2012), такође су значајно смањени у НК ћелијама Итхдф2ΔНК мишева (Слика 7 Д).

Ови подаци подржавају нашу карактерисану улогу ИТХДФ2 у регулисању пролиферације НК ћелија, преживљавања и ефекторских функција. Затим смо извели м6А-сек у ИЛ-2-проширеним НК ћелијама Итхдф2ВТ и Итхдф2ΔНК мишева. Анализа главних компоненти је показала да су три биолошке реплике сваког генотипа груписане заједно (подаци нису приказани), што указује на добру поновљивост узорака м6А-сек.

Анализа хипергеометријске оптимизације обогаћивања мотива (ХОМЕР) идентификовала је м6А консензус мотив (ГГАЦ), што указује на успешно обогаћивање м6А-модификованих транскрипата (слика 7 Е). Модификације м6А су биле претежно лоциране у транскриптима који кодирају протеине, а пикови су обогаћени у 59 непреведених региона (УТР) и 39УТР, посебно око стартног и стоп кодона (слика 7 Ф и слика С5 Ц).

Анализа ГО обогаћивања гена са врховима м6А открила је да је већина транскрипата обележених м6А у НК ћелијама обогаћена путевима укљученим у ћелијски циклус и ћелијску пролиферацију (слика С5 Д).

For more information:1950477648nn@gmail.com