Улога генетског тестирања у дијагностичком току рада педијатријских пацијената са бубрежним обољењима: искуство једне институције

АпстрактанСврхаНаследне болести бубрега су међу водећим узроцима затајења бубрега код деце, што резултира повећаном смртношћу, високим трошковима здравствене заштите и потребом за трансплантацијом органа. Технологије секвенцирања следеће генерације могу помоћи у дијагностици ретких моногених стања, омогућавајући оптимизовано медицинско управљање и терапијске изборе.

Методе Клиничко секвенционирање егзома (ЦЕС) је спроведено на кохорти од 191 педијатријског пацијента из једне установе, праћено Сангеровим секвенцирањем да би се потврдиле идентификоване варијанте и за студије породичне сегрегације. Резултати Сви пацијенти су имали клиничку дијагнозу болести бубрега: главне категорије болести биле су болести гломерула (32,5%), цилиопатије (20,4%), ЦАКУТ (17,8%), нефролитијаза (11,5%) и тубуларна болест (10,5%). 7,3% пацијената имало је друга стања. Коначан генетски тест, заснован на ЦЕС и Сангер валидацији, добијен је код 37,1% пацијената. Највећа стопа детекције забележена је за цилиопатије (74,4%), затим нефролитијазу (45,5%) и тубуларне болести (45%), док је већина гломеруларних болести и ЦАКУТ-а остала недијагностикована. Закључци Резултати показују да генетско тестирање које се доследно користи у дијагностичком току рада деце са хроничном болешћу бубрега може (и) потврдити клиничку дијагнозу, (ии) пружити рану дијагнозу у случају наследних стања, (иии) и генетски узрок раније непрепознатих болести. болести и (ив) прилагођавање програма трансплантације.

Кључне речи Клиничко секвенцирање егзома, секвенцирање следеће генерације,Болести бубрега, Генетско тестирање, Педијатријска кохорта

КЛИКНИТЕ ОВДЕ ДА ДОБИЈЕТЕ ЦИСТАНЦХЕ ЗАПОСЛЕДЊИ СТАДИЈУМ БОЛЕСТИ БУБРЕГА

Увод

Педијатријске нефропатије обухватају веома различите ентитете болести у смислу клиничке презентације, еволуције и терапијских опција [1–4]. Приближно 30% деце са хроничном бубрежном болешћу (ЦКД) пати од моногеног стања, а проценат се повећава када се узме у обзир деца са завршном болешћу бубрега (ЕСРД) [5, 6]. Многа од ове деце остају недијагностикована у време трансплантације [4, 6, 7]. Постизање дијагнозе за ове пацијенте не само да имплицира крај дијагностичке одисеје, већ представља неколико предности за прогнозу, управљање и лечење

Пионирске студије су доследно показале да је примена техника секвенцирања следеће генерације (НГС) значајно побољшала дијагностички принос код пацијената са наследним обољењима бубрега (ИКД) [8]. У скорије време, широко распрострањена употреба НГС-а омогућила је доступну генетску дијагнозу у разумном времену и по приступачним ценама, постављајући питање да ли и када треба да буде интегрисана у рутински дијагностички радни ток [5].

Генетска дијагноза код деце је од највеће важности за различите аспекте. Први је да може бити релевантан у клиничком приступу болести, типичан пример је онај нефротских синдрома где идентификација структурних варијанти гена повезаних са подоцитима представља аргумент против имуносупресивних терапија које би се иначе рутински користиле током периода од неколико месеци [9]. Други је да може бити веома релевантан за породицу детета и за идентификацију других чланова који носе варијанту која се може пренети на будуће генерације. Када се код пробанда идентификује патогена варијанта, каскадно тестирање чланова породице и генетско саветовање код носилаца варијанти представљају стандардну праксу клиничке генетике [5]. Треће је да је познавање патогене варијанте од суштинског значаја у контексту трансплантације где донор може бити рођак. Заиста, кључно је искључити присуство исте варијанте(е) код даваоца органа, као и да се идентификују сви чланови породице којима је потенцијално потребна трансплантација. Четврто је да неке болести представљају висок ризик од релапса након трансплантације органа, као што је фокална сегментна гломерулосклероза [10] или се њихов исход може побољшати прилагођенијим избором трансплантације која ће се извршити, као у случају примарне хипероксалурија где комбинована трансплантација бубрега и јетре може да доведе до бољег исхода [11]. Коначно, јасна дијагноза болести може бити корисна за пацијента да учествује у клиничким испитивањима и да има користи од нових опција лечења [12, 13].

Крајем 2018. године, у сарадњи између педијатријских нефролога и генетичара, почели смо да спроводимо генетске тестове за моногена стања која потенцијално доводе до ЕСРД-а, а тиме и до трансплантације. Наша болница је највећа у северозападној Италији, са подручја од око 5 милиона људи. Одабрали смо врсту анализе „једна величина за све“, са секвенцирањем клиничког егзома, тј., отприлике 6700 гена који су повезани са моногеним стањима, фокусирајући анализу на генске панеле прилагођене клиничкој сумњи и стога ограничавајући случајне налазе и смањење времена за анализу секвенце.

Све у свему, применом овог цевовода, добили смо дијагностички принос у складу са објављеним подацима, са извесном хетерогеношћу међу различитим клиничким сумњама, као што се очекивало. Добијени резултати потврђују релевантност укључивања рутинског генетског тестирања и саветовања у дијагностички радни ток педијатријских пацијената захваћених нефропатијама. Заиста, идентификација узрочних варијанти је критична за њихово клиничко управљање, а потенцијално и за оптималну селекцију живих донора.

материјали и методе

Регрутовање пацијената

Студија је била заснована на дијагностичкој кохорти од 191 узастопног педијатријског пацијента (старости при запошљавању < 18 година), регрутованих од стране Јединице за педијатријску нефрологију, дијализу и трансплантацију у Дечјој болници Регина Маргхерита и упућених Служби за имуногенетику и биологију трансплантације. генетске анализе. Сви пацијенти укључени у студију дали су писмени информисани пристанак који су потписала оба родитеља, кад год је то могуће.

Припрема узорака, секвенцирање и биоинформатичке анализе

Екстракција нуклеинске киселине из периферне крви, анализа квалитета ДНК, припрема библиотеке и секвенцирање су обављени као што је претходно објављено [14]. Необрађени подаци добијени секвенцирањем су конвертовани у ФАСТК датотеке, а затим усклађени са Енрицхмент 3.1.0 или ДРАГЕН Енрицхмент алатима (Иллумина) и мапирани на ТруСигхт Оне Екпандед в2.{5}} манифест користећи Хомо Сапиенс УЦСЦ ГРЦх37 геном као референца за добијање појединачних нуклеотидних варијанти, варијанти броја копија (ЦНВ) и структурних варијанти датотека. За идентификацију броја копија, коришћена је основна линија направљена од података секвенцирања од 5 различитих пацијената, сви негативни на ЦНВ (према упоредним подацима о геномској хибридизацији). Овај приступ омогућава детекцију ЦНВ-а чак иу сексуалним хромозомима, пошто су референтну групу чиниле и женске и мушке особе, а пол субјекта који се анализирао је увек био прецизиран током фазе поравнања. Позивање варијанти и одређивање приоритета вршено је према дефинисаним критеријумима. Поравнање читања и покривеност ексонима гена од интереса су проверени и приказани помоћу програма Интегративе Геномицс Виевер ИГВ, који је бесплатно доступан на УЦ Сан Диего – Универзитет у Калифорнији и Броад Институте МИТ-а и Универзитета Харвард – Бостон (хттпс://софтваре.броадинституте. орг/софтвер/игв/). Варијанте које ће бити укључене у коначни генетски извештај су класификоване према критеријумима Америчког колеџа за медицинску генетику и геномику (АЦМГ).

Генерисање ин силицо листе генских болести

Гени које треба узети у обзир за идентификацију варијанти и одређивање приоритета дефинисани су на основу клиничких сумњи. Ин силицо листе гена су генерисане у складу са (и) подацима из различитих база података, повезујући генотип са фенотипом (ОМИМ, ПанелАпп Енгланд, ЦлинГен, Малацардс) и (ии) подацима из литературе. Доступне листе гена се ажурирају једном годишње на основу нових доказа повезаности гена и болести.

Сангер секвенцирање и амплификација сонде зависна од мултиплексне лигације (МЛПА)

Сангер секвенционирање и/или МЛПА анализе су спроведене да би се потврдиле варијанте идентификоване од стране НГС-а и за студије породичне сегрегације. Укратко, ДНК је екстрахован почевши од другог независног аликвота пробандове периферне крви и од родитеља. ДНК региони од интереса су амплификовани ПЦР-ом коришћењем специфичних експерименталних услова. Чистоћа и специфичност амплификованих региона проверене су помоћу 0.8 или 1,5% агарозног гела. Амплификовани ПЦР производи су затим секвенционирани по Сангеру коришћењем истих прајмера. За варијанте ПКД1, валидација је извршена коришћењем ПЦР дугог домета праћеног угнежђеним ПЦР-ом да би се избегао било какав закључак из псеудогена.

Резултати

Дефинисање критеријума за враћање резултата генетске анализе

We previously reported on the design and set-up of a "kidney" gene panel that comprises>400 гена укључених у различите облике бубрежних болести [14]. За ову студију, спровели смо анализу са подпанелима фокусираним на специфичну клиничку категорију сумње (нпр. ЦАКУТ, гломерулопатија, тубулопатија, итд.) и приоритетно одредили специфичну групу гена за анализу. Овај приступ је ограничио број анализираних гена, поједностављујући анализе и смањивши број случајних налаза. Тек када је на крају аналитичког поља са релевантним панелом(има) генетски резултат био негативан и (и) клинички фенотип није јасно назначен или (ии) када се преклапају различите категорије болести, генетска анализа је проширена на тзв. „пуна листа бубрега или киднеиоме“, супер-панел који садржи све гене укључене у подпанеле.

Као први корак, дефинисали смо скуп критеријума за интерпретацију НГС резултата. Након извођења клиничког секвенцирања егзома (ЦЕС) и усклађивања података, одређен је низ анализа за филтрирање у релевантним варијантама. Конкретно, на основу клиничке сумње, идентификоване варијанте су филтриране на основу ин силицо листа гена, специфичних за различите макро-категорије болести. Синонимне варијанте које не утичу на механизам спајања или интроничне варијанте које се не мапирају унутар региона спајања су искључене, узимајући у обзир само несинонимне, бесмислене, померање оквира и варијанте које утичу на спајање. Укључено је десет, само ретких варијанти (учесталост мања од 1% у популацији) и варијанти са учесталошћу алела код пацијента од најмање 0.2 и покривеношћу од најмање 20 читања. Преостале варијанте су означене и даље куриране на основу (и) начина наслеђивања, (ии) конзервације нуклеотида, (иии) утицаја протеина, искоришћавања различитих база података за проверу резултата и (ив) литературе, ако постоји. У овом тренутку, филтриране варијанте су наведене у такозваном „техничком извештају“. Технички извештај је тумачио медицински генетичар како би се произвео коначни генетски извештај за пацијента и његову/њену породицу. Током генетских консултација, предложене су студије породичне сегрегације да (и) потврде варијанте у пробанду и (ии) да укључе/искључе не-узрочне варијанте на основу њихове сегрегације у породици (Слика 1).

Усвајањем ових критеријума, успели смо да дефинишемо три различите категорије генетских извештаја. Прво, „закључни извештај“ који је укључивао патогене (Ц5) и вероватно патогене (Ц4) варијанте. Извештаји о варијантама непознатог значаја (Ц3) сматрани су коначним само ако су у потпуности компатибилни са клиничком сликом и ако су студије породичне сегрегације потврдиле њихову могућу улогу. Друго, „несигуран извештај“ који је укључивао варијанте Ц3 које је идентификовао ЦЕС, а које још нису или нису могле бити потврђене у контексту студија породичне сегрегације или варијанте Ц4/Ц5 које нису биле у потпуности у складу са клиничким фенотипом. Треће, „неуверљиви извештај“ који је укључивао (и) негативну ЦЕС анализу, што значи да НГС није идентификовао ниједну варијанту; (ии) појединачне варијанте у рецесивним генима; и (иии) Ц3 варијанте које нису у складу са клиничким фенотипом, идентификоване када је анализа проширена на свегени у вези са бубрежном болешћу(Фиг. 1).

Главне карактеристике регрутоване кохорте

Ова студија описује кохорту од 191 педијатријског пацијента (0–18 година) које је Јединица за педијатријску нефрологију узастопно упућивала на генетску анализу од новембра 2018. до маја 2022. године, са просечно 50 нових пацијената који се уписују сваке године. . Критеријуми за генетско тестирање били су (и) нефропатија повезана са позитивном породичном историјом болести бубрега или (ии) клиничка сумња на моногено стање или (иии) потреба да се искључи моногено стање (као у случају нефротских синдрома, где се разликује моногене у односу на немоногене болести је клинички значајна за прогнозу и лечење).

Кохорта је подељена на основу клиничке сумње, с обзиром на 6 различитих макро-категорија болести: урођене абнормалности бубрега и уринарног тракта (ЦАКУТ; н=34), цилиопатије (н=39), гломерулопатије (н=62), нефролитијаза (н=22), тауопатије (н=20) и друге болести које су укључивале и синдромске фенотипове (н=14). Осим ЦАКУТ-а и тубулопатија које су показале подједнаку дистрибуцију између жена и мушкараца, у свим осталим категоријама постојала је преваленција мушких испитаника (Сл. 2а). Када се посматра старосна доб регрутовања, није истакнута значајна различита дистрибуција међу различитим групама, са средњим узрастом у распону од 6,7 до 10 година у „Другим болестима“ и гломерулопатијама, респективно. Међутим, када се посматра средња старост, ЦАКУТ болести су показале најнижу вредност (4,6 година), у складу са урођеним фенотипом. Са становишта етничке припадности, независно од разматране макро-категорије болести, већина пацијената су били Европљани, затим Африканци, а само неколико пацијената су били Азијати, Латиноамериканци или укрштени (Слика 2б). Међу кохортом, само 8 пацијената је имало родитеље у сродству.

Слика 1 Цевовод анализе генетичких података и критеријуми за укључивање варијанти. Шематски приказ аналитичког цевовода усвојеног за идентификацију варијанти и одређивање приоритета, укључујући све критеријуме филтрирања и филтрирања. Добијене варијанте су укључене у коначни генетски извештај. Кад год је то било могуће, спроведене су студије валидације варијанти и породичне сегрегације. Генетски извештаји су класификовани као коначни, неизвесни или неубедљиви на основу наведених критеријума. На основу ове класификације израчуната је дијагностичка стопа нашег тока секвенцирања следеће генерације (НГС). 1 кг: база података 1000 генома; Алт фр: измењена фреквенција; Ц3: варијанта непознатог значаја; Ц4: вероватна патогена варијанта; Ц5: патогена варијанта; АР: аутозомно рецесиван

Коначно, када се узме у обзир породична анамнеза за болести бубрега, узимајући у обзир мушке и женске субјекте одвојено, хетерогеност у дистрибуцији између позитивних и негативних случајева била је евидентна с обзиром на различите категорије болести. Све у свему, већина регрутоване кохорте и независно од пола није била окарактерисана позитивном породичном анамнезом, као што је показано за ЦАКУТ, гломерулопатије, тауопатије и друге поремећаје бубрега. Међутим, код цилиопатија и нефролитијазе, значајан проценат случајева је имао позитивну породичну историју са различитом дистрибуцијом између жена и мушкараца (13 случајева од 22 за цилиопатије и 5 од 12 за нефролитијазу; слика 2ц).

Са клиничког становишта, кохорта је била прилично хетерогена са различитим примарним обољењима (слика 2д). Међу њима, најчешће клиничке сумње биле су полицистична болест бубрега (н=27), ЦАКУТ (н=25), нефротски синдром (н=19), фокална сегментална гломерулосклероза (ФСГС; н =14) и Алпортов синдром (н=13; слика 2д).

Услуга подршке Вецистанцхе-а - највећи извозник цистанцхеа у Кини:

Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com

Вхатсапп/тел:+86 15292862950

Купите за више детаља о спецификацијама:

хттпс://ввв.кјцистанцхе.цом/цистанцхе-схоп

КЛИКНИТЕ ОВДЕ ДА ДОБИЈЕТЕ ПРИРОДНИ ОРГАНСКИ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНЦХЕ СА 25% ЕХИНАКОЗИДА И 9% АКТЕОЗИДА ЗА ИНФЕКЦИЈУ БУБРЕГА