Терапијски ефекат цистанозида А на метаболизам костију мишева са јајницима

1. Увод

Остеопороза, системски скелетни „тихи убица“, постала је велика опасност по здравље која погађа преко 2000 милиона људи широм света последњих година. Карактерише га ниска густина коштане масе (БМД) и пропадање микро архитектуре, који произилазе из вишка ресорпције кости у односу на формирање кости и, коначно, резултирају фрактуром остеопорозе. Данас је идентификација агенаса који блокирају остеокластичну диференцијацију и ресорпцију уобичајена и успешна стратегија за развој терапеутских лекова за остеопорозу, а заиста постоје многи синтетички агенси, укључујући естрадиол валерат и алендронат натријум, који би моглиспречити и лечити остеопорозу. Међутим, лекови за болести су далеко од идеалних; неки од ових лекова могу повећати ризик од карцинома ендометријума и дојке и такође имају одређени степен нежељених ефеката, као што су хиперкалцемија, хиперкалциурија, итд., који ограничавају њихову клиничку примену. Због тога се више од једног миленијума, традиционални кинески лекови (ТЦМ), посебно јестиви ТЦМ са изолованим биоактивним једињењима и фракцијама, увелико користе безбедно и ефикасно у азијским земљама за превенцију и лечење различитих болести, укључујући остеопорозу.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ЛЕЧЕЊЕ И ПРЕВЕНЦИЈУ БОЛЕСТИ ОСТЕОПОРОЗЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Остеопороза се карактерише као појачана ресорпција костију услед повећане остеокластогенезе, а овај процес укључује предају хематопоетских моноцита у прекурсоре остеокласта, који се спајају да би формирали вишенуклеарне остеокласте који циљају на места костију која су подвргнута ремоделирању [4]. Активатор рецептора за нуклеарни фактор-κБ лиганд (РАНКЛ), кључни фактор који се лучи из остеобласта, стимулише диференцијацију моноцита у остеокласте [8,9]. Интеракција РАНКЛ-а са његовим рецептором РАНК доводи до каскаде интрацелуларних догађаја, укључујући НФ-κБ, ПИ3К/Акт и калцијум/калмодулин зависну киназу регрутовањем фактора везаног за ТНФ рецептор сигнала адаптера (ТРАФ6). Као резултат тога, неколико маркерских гена повезаних са остеокластима, укључујући ТРАП, катепсин К и ДПД, су регулисани нагоре, а процес ресорпције костију је убрзан.

Фенилетаноидне гликозиде карактеришу циметна киселина и хидроксил фенил етил делови који су везани за -глукопиранозу (апиоза, галактоза, рамноза, ксилоза, итд.) преко гликозидне везе, који су широко распрострањени у лековитим биљкама [10]. Цистанозид А (Цис А) је активанфенилетаноидни гликозиду Цистанцхе десертицола ИЦ Ма. Према подацима кинеске фармакопеје, Ц. десертицола се традиционално користила за лечење недостатка јина бубрега, мишићне слабости, лумбалне слабости итд., а фенилетаноидни гликозиди су главни биоактивни састојци ове биљке [11]. На основу теорије 'бубрега' ТЦМ-а, бубрег може управљати коштаним системом, што значи да развој и функције костију зависе од бубрежне есенције, а ова есенција бубрега може се трансформисати у коштану срж како би хранила кости, промовишу раст и поправку скелета и ојачају скелет [12]. Како Ц. десертицола може да ојача бубрег, претпоставили смо да Цис А може да спречи и лечи остеопорозу. Ова студија је стога осмишљена да потврди потенцијалЦис А у превенцији остеопорозекоришћењем модела мишева са овариектомијом, а утврђени су маркери формирања и ресорпције костију, као и сродни потенцијални механизми за процену антиостеопоротске биоактивности овог агенса.

2. Резултати и дискусија

2.1. Резултати

2.1.1. Ефекти Цис А на тестирање савијања костију у три тачке

Да бисмо анализирали да ли третман са Цис А чини кост јачом, подвргли смо бутне кости тесту савијања у три тачке. Као што је приказано на слици 1, максимално оптерећење при лому кости било је 21,5% и 22.0% веће код животиња третираних са 20 мг/кг и 80 мг/ кг Цис А, респективно, у поређењу са животињама у групи са овариектомијом (ОВКС) (п < 0.05). У међувремену, третман са Цис А такође је побољшао крутост костију; сви мишеви третирани Цис А показали су значајно повећану крутост са подацима од 121.0 ± 12,1 (п < 0,05), 124,1 ± 16,2 (п < 0,05) и 127,7 ± 9,6 (п < 0,01), респективно, у поређењу са 102,2 ± 10,7 ОВКС мишева. Резултати показују да је повећана чврстоћа костију код ОВКС мишева третираних Цис А последица повећане количине кости и побољшања квалитета костију.

2.1.2. Ефекти Цис А на микроархитектуру костију

Тродимензионална микроархитектура трабекуларне кости мишева мерена микро-ЦТ (слика 2 и табела 1) интуитивно показује да су мишеви у групи ОВКС показали значајно смањење трабекуларног подручја и трабекуларног броја у поређењу са лажном групом, што указује да је оваријектомија може изазвати значајно смањење густине коштане масе (БМД, -46%), садржаја минерала костију (БМЦ, -66%), садржаја минерала у ткиву (ТМЦ, -85%), запреминске фракције кости (БВФ, -82%), трабекуларни број (Тб. Н, −76%) и повећање трабекуларне сепарације (Тб. Сп, +80%) без икаквих модификација у укупној минералној густини ткива (ТМД) и дебљини трабекуле (Тб. Тх) након операција од 12 недеља. Међутим, ОВКС мишеви третирани Цис А резултирали су у зависности од дозе повећаном БМД (+43%~57%), БМЦ (+65%~73%), ТМЦ (+83%~ 90%), БВФ (+80%~88%), веће смањење Тб. Сп (-79%~88%) и даље појачан Тб. Н (+73%~82%) у поређењу са ОВКС групом. Чинило се да ТМД није под утицајем овариектомије, али је значајно повећан третманом естрадиол валератом (ЕВ).

2.1.3. Ефекти Цис А на маркере формирања и ресорпције костију

Ефекти Цис А на маркере ресорпције костију, укључујући ТРАП, ДПД, индекс формирања костију катепсин К АЛП и коштани Гла-протеин (БГП), приказани су на слици 3. После 12 недеља операције оваријектомије, активности ТРАП, ДПД , и катепсин К у ОВКС групи су значајно повећани, посебно ДПД, који се повећао за скоро 55,6%; ТРАП и катепсин К су побољшани за 43,5% и 38,1%, респективно, у поређењу са лажном групом. Цис А, примењен орално током 12 недеља, показао је значајан потенцијал у превенцији свих горе наведених маркера ресорпције костију, посебно високе дозе (80 мг/кг) које показују значајан ефекат на супресију активности ДПД-а за 45.0%, ТРАП за 49.0% и катепсин К за 44.0%, респективно (п < 0.01), у поређењу са ОВКС група (слика 3). Иако је у ОВКС групи показан тренд повећања АЛП и БГП активности, нису уочене статистички значајне промене. Међутим, примећено је значајно побољшање активности АЛП у групама које су третиране са ниским и високим нивоом Цис А у поређењу са лажном групом (п < 0,01).

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПРЕВЕНЦИЈУ БОЛЕСТИ ОСТЕОПОРОЗЕПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

2.1.4. Ефекти Цис А на нивое експресије протеина ТРАФ6, НФ-κБ ПИ3К, Акт, ОПГ и РАНКЛ

Вестерн блот анализа је открила да су у поређењу са лажном групом, нивои протеина ТРАФ6, НФ-κБ и РАНКЛ у ОВКС групи значајно повећани (п < 0.05), док су ОПГ, ПИ3К и Акт су значајно смањени (Слика 4). Цис А (20 мг/кг или 80 мг/кг) је значајно смањио експресију ТРАФ6 (п < 0,05), након чега је РАНКЛ експресија смањена и ОПГ повећан, што значи да је однос ОПГ/РАНКЛ повећан. Сходно томе, сигналне каскаде НФ-κБ су смањене, а ПИ3К/Акт су повећане уз помоћ Цис А третмана (п <0,05).

2.2. Дискусија

С обзиром на ограничења тренутних терапијских опција за болест остеопорозе, постоји потреба за алтернативама из хране или природних јестивих лековитих биљака. Као део наших сталних напора да откријемо ефикасне антиостеопоротске агенсе из ТКМ, пронашли смо низ екстраката, фракција и једињења која поседују ефекат антиостеопоротичких својстава [13,14]. Цистанцхе десертицола је важан класични ТЦМ, за који је утврђено да поседује повољан безбедносни профил [15] и широке лековите функције за лечење недостатка бубрега, итд. [16]. Према теорији ТКМ, ТКМ који поседују ефекат окрепљења бубрега су обичнокористи се за лечење остеопорозе; фенилетаноидни гликозиди су главни биоактивни састојци ове биљке, што имплицира дафенилетаноидни гликозидисадржане у Ц. десертицола могу имати антиостеопоротично својство. Доказано је да екстракт Ц. десертицола може значајно инхибирати смањење БМД-а и спречити пропадање трабекуларне микроархитектуре изазвано ОВКС [17]. У ин витро експерименту, такође је значајно повећао АЛП, коштани морфогенетски протеин-2 и мРНК остеопонтина, као и минерализацију костију култивисаних остеобласта [18]. Ехинакозид, главна биоактивна компонента у Ц. десертицола званично забележена у кинеској фармакопеји [11], показао је антиостеопоротичку активност са високом дозом од 30~270 мг/кг телесне тежине/дан [19], а даљи резултати ин витро су показали да је могао да подстакне регенерацију костију повећањем ОПГ/РАНКЛ односа у МЦ3Т3-Е1 субклону 14 ћелијама [20]. Цис А је био један од фенилетанол гликозида изолованих из Ц. десертицола, а неколико извештаја је открило да ово једињење поседује антиоксидативну активност [21] и антиинфламаторна својства [22,23]. Недавно објављен рад открио је да је Цис А показао заштитне активности и на ЦЦл4 и на хепатотоксичност изазвану алкохолом код мишева, а такође је показао заштитно својство на оштећење изазвано етанолом у примарно култивисаним хепатоцитима миша ин витро [24]. У нашој садашњој студији, резултати су показали да је Цис А поседовао антиостеопоротичку активност при ниској дози (20~80 мг/кг телесне тежине/дан) коришћењем модела мишева са овариектомијом, а ова биоактивност је испољена смањењем нивоа ТРАФ6, потискивањем експресија РАНКЛ и НФ-κБ и стимулисање ОПГ, ПИ3К и Акт, што значи да је терапеутски ефекат Цис А код ОВКС мишева био кроз механизам ТРАФ6-посредоване инактивације НФ-каппаБ и активације ПИ3К/Акт.

Добро је познато да овариектомија може да изазове остеопорозу са очигледним смањењем БМД, биомеханичке чврстоће, квалитета костију и микроархитектуре трабекуларне кости, а наведене промене су делом последица недостатка естрогена [25]. Сада, у садашњем експерименту ин виво, наша студија показује да је остеопороза изазвана овариектомијом резултирала значајним смањењем биомеханичке снаге и трабекуларних структурних параметара, укључујући БМД, БМЦ, ТМЦ и Тб. Н, и повећање Тб. Сп; и третман Цис А значајно је побољшао механичка својства кости укључујући максимално оптерећење и крутост, побољшао БМД и побољшао већину структурних параметара трабекуларне микроархитектуре кости у поређењу са мишевима у групи ОВКС, што указује да је Цис А био ефикасан у побољшању квалитета костију и трабекуларна микроархитектура код ОВКС мишева.

Поред укупне БМД, тест савијања у три тачке и мерење микроархитектуре трабекуларне кости могу директно дијагностиковати остеопорозу, маркере формирања кости, укључујући АЛП и БГП, и индекс ресорпције кости, укључујући ТРАП, ДПД и катепсин К, такође су коришћени за разјаснити сродне антиостеопоротске механизме Цис А. У нашој студији, активност АЛП код мишева групе ОВКС показала је незначајан тренд повећања, што је указивало на повећану стопу коштаног обрта [26,27] у постменопаузалној остеопорози; висока (80 мг/кг телесне тежине/дан) и ниска (20 мг/кг телесне тежине/дан) доза Цис А третмана је показала значајно побољшање активности АЛП у поређењу са лажном групом, док се чинило да активност БГП није била под утицајем овариектомија у свим третираним групама; ТРАП, ДПД и катепсин К су значајно повећани у ОВКС групи, а примена Цис А је значајно смањила сва три маркера ресорпције костију. Наведени подаци су указивали на то да Цис А поседује потенцијално антиостеопоротичку активност, а овај ефекат је испољен регулацијом коштаног метаболизма, укључујући и супресију ресорпције костију и повећање формирања костију.

Координација између остеобласта и остеокласта је критичан фактор у одржавању интегритета скелета. Остеокласти, који експримирају ТРАП, везују се за површину кости кроз формирање зона заптивке везаних за актин, унутар којих се ослобађају протеолитички ензими, као што је катепсин К, што доводи до формирања ресорпционих јама. Модулацију остеокластогенезе незрелим ћелијама остеобластне лозе посредују РАНКЛ и ОПГ [28]. ОПГ је мамац рецептор који инхибира РАНКЛ активацију остеокластогенезе, чиме се смањује ресорпција костију. РАНКЛ, који даје важан сигнал прогениторима остеокласта, је молекул везан за мембрану породице лиганда фактора туморске некрозе који промовише формирање остеокласта. Верује се да је однос експресије ОПГ/РАНКЛ кључни параметар остеокластогене активности, а сигналне каскаде које активира РАНКЛ укључују НФ-κБ и ПИ3К путеве [29]. Значај НФ-κБ пута за остеокластогенезу показује чињеница да је делеција НФ-κБ код мишева резултирала одсуством зрелих остеокласта [30]. ТРАФ6 се показао као обећавајућа мета за нове лекове против остеопорозе. Мишеви са недостатком ТРАФ6-и показују дефектну остеокластогенезу и тешку остеопетрозу су стога показали значај ТРАФ6 у метаболизму костију. Нови докази указују на критичну регулаторну функцију за ТРАФ6 у РАНКЛ/РАНК-посредованим сигналним каскадама [4,31]. Подаци тренутне студије су показали да је третман Цис А на ОВКС мишевима резултирао смањењем нивоа експресије протеина ТРАФ6, смањеним РАНКЛ и повећаним ОПГ експресијама, чиме је спречио РАНКЛ активацију низводног НФ-κБ и активирао ПИ3К/Акт сигналне путеве, што сугерише да Цис А инхибира диференцијацију остеокласта ТРАФ6-посредованом инактивацијом НФ-каппаБ и активацијом ПИ3К/Акт и повећава однос ОПГ/РАНКЛ, што потом инхибира остеокластогенезу и промовише формирање костију.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗААНТИОСТЕОПОРОЗНА АКТИВНОСТПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

3. Материјали и методе

3.1. Биљни материјали, припрема и одређивање

Стабљике Цистанцхе десертицолаИЦ Ма, које је идентификовао проф. Ксуе-иан Фу са Одељења за фармацију Медицинског универзитета Нингкиа, прикупљени су 2015. септембра у округу Ионгнинг, провинција Нингкиа, Кина. Узорак ваучера (#20150901) је сачуван у хербаријуму апотекарског одељења. Укупно 30,0 кг ваздушно осушених стабљика Ц. десертицола је екстраховано рефлуксом са 70% етанолом (180 Л, 3 × 2 х) 3 пута. Филтрати су комбиновани и подвргнути колони макропорозне смоле (АБ-8) са степенастим градијентом система растварача повећања етанола у води (0%, 20% и 60%, сваки 60 Л) да би се добиле три фракције, затим 60% фракције је даље пречишћено Сепхадек ЛХ-20 (Пхармациа Биотецх Цо., Упсала, Шведска) и полупрепаративном течном хроматографијом високих перформанси (Агилент 1100, Агилент Тецхнологиес, ​​Валдбронн, Немачка) да би се добила бледо жута цистанозид А 4,5 г (Цис А; принос је био 0,015%). Структура је разјашњена углавном анализом података НМР (Брукер Аванце, 400 МХз, Немачка) и МС спектра (Агилент 6540, Агилент Тецхнологиес), које су биле у складу са пријављеним подацима [19]. Његова чистоћа је одређена ХПЛЦ методом нормализације површине (слика 5). У експериментима на животињама, на основу нашег прелиминарног експеримента, доза Цис А је била 20–80 мг/кг/дан.

3.2. Хемикалије и растварачи

Коришћени су: комплет за екстракцију укупног протеина и комплети за квантизацију БЦА протеина (Кен Ген Биотецх. Цо. Лтд, Нањинг, Кина), примарна антитела на ТРАФ6, НФ-κБ, ПИ3К, Акт, РАНКЛ, ОПГ, -актин и тубулин ( Технологија ћелијске сигнализације, Беверли, МА, САД), секундарна антитела козјег анти-зечјег ИгГ коњугованог пероксидазом рена (ЗСГБ-БИО, Пекинг, Кина), естрадиол валерат (1 мг, Делпхарм Лилле САС, Париз, Француска), кост Гла -протеин и деоксипиридинолин унакрсно повезују ЕЛИСА комплете (Ксиниу Биологицал Енгинееринг Цо. Лтд., Шангај, Кина) и катепсин К ЕЛИСА комплет (Биовисион, Моунтаин Виев, Калифорнија, САД). Све остале коришћене хемикалије и биохемијски агенси су били АР реагенси аналитичког квалитета.

3.3. Експерименти на животињама

Шездесет женки Кунминг соја, старих 8 недеља са телесном тежином од 26.0 ± 1,62 г, купљено је са медицинског универзитета Нингкиа, а 10 мишева је држано у једном кавезу са стандардном лабораторијском исхраном и воду из славине у условима контролисаног ваздуха (24.0 ± 0,5 ◦Ц, 45%–50% влажности и 12 х/12 х светло-тамни циклуси осветљења). Након аклиматизације током 1 недеље, операција је урађена у асептичном стању, а сви мишеви су анестезирани хлорал хидратом (100 мг/кг, ип); мишеви који су били изложени операцији без уклањања јајника били су лажна група (н=10); остали су били подвргнути билатералној овариектомији као ОВКС групе (н=50). Горе наведени експерименти на животињама спроведени су у складу са водичем за негу и употребу лабораторијских животиња и одобрени су од стране Комитета за биоетику Медицинског универзитета Нингсија.

После још једног {{0}}недељног периода опоравка, горњих 50 ОВКС мишева је насумично и подједнако подељено у 5 група: орално третирани естрадиол валератом (1 мг/кг/дан) као позитивна контрола (ЕВ); са 20, 40 и 80 мг/кг/дан Цис А као групама ниске, умерене и високе дозе, респективно; са носачем (0,5% карбоксиметилцелулозе()-На) као моделном групом (ОВКС). Свим мишевима је орално давана једнака запремина од 1 мЛ/100 г носача телесне тежине, ЕВ или Цис А, што је почело друге недеље након операције и трајало је 12 недеља. Телесна тежина је мерена сваке две недеље, са дозом прилагођеном у складу са тим. После последње оралне примене, узорци крви су повучени из феморалне артерије анестезираних мишева, остављени да се згрушају и центрифугирани на 3000 × г током 10 минута да би се добио серум; десна фемора и тибија су сецирани. Сви узорци су чувани на -80 ◦Ц за даљу процену микроархитектуре костију и биохемијских параметара серума повезаних са остеопорозом.

3.4. Испитивање савијања у три тачке

Биомеханичка својства десне бутне кости миша одређена је коришћењем савијања у три тачке. Прикључак за савијање има ослонац у облику слова В за осигурање дисталног и проксималног краја бутне кости током тестирања. Бутна кост је постављена хоризонтално са предњом страном нагоре, а оптерећење је примењено надоле у ​​центру средње бутне кости. Размак између носача био је 8 мм. Кости су оптерећене константном стопом померања од 0.02 мм/с до отказивања коришћењем БОСЕ машине за тестирање (3220) (Босе Цорпоратион, Ендура ТЕЦ Системс Гроуп, Миннетонка, МН, САД). Добијене су криве померања оптерећења и коришћене за прорачун конструкцијских и материјалних својстава, укључујући максимално оптерећење, вршно оптерећење, модул еластичности, чврстоћу на савијање итд.

3.5. Анализа микро-компјутерском томографијом

Десне бутне кости свих мишева су очишћене од приањајућих меких ткива, а микроархитектура трабекуларне кости горње десне дисталне феморалне метафизике је одређена микро-ЦТ скенером (еКсплоре Лоцус СП, ГЕ Хеалтхцаре, Лондон, ОН, Канада) са изотропна резолуција постављена на 8 µм у све три просторне димензије. Подручје од интереса (РОИ) је одабрано коришћењем истих координата у плочи раста бутне кости. Морфометријски параметри костију, укључујући БМД, минерални садржај кости (БМЦ), садржај минерала у ткиву (ТМЦ), минералну густину ткива (ТМД), фракцију запремине кости (БВФ), трабекуларну сепарацију (Тб. Сп), трабекуларни број (Тб. Н ) и трабекуларне дебљине (Тб. Тх), процењене су анализом РОИ коришћењем софтвера за анализу костију АБА.

3.6. Анализа биохемијских параметара

Активност серумске алкалне фосфатазе (АЛП) мерена је на аутоматском анализатору (Циба-Цорнинг 550 Диагностицс, Цорп., Оберлин, ОХ, УСА)); нивои серумског ДПД, БГП и катепсина К су одређени одговарајућим комплетима реагенса, а кисела фосфатаза отпорна на тартрат (ТРАП) је анализирана према сродној литератури [32].

3.7. Вестерн блот анализа

Нивои експресије протеина ТРАФ6, НФ-κБ ПИ3К, Акт, ОПГ и РАНКЛ у различитим групама откривени су Вестерн блот анализом. Укратко, протеин је екстрахован из десне тибије мишева коришћењем пуфера за лизу који садржи 0.5 мМ фенилметилсулфонил флуорид, инхибиторе протеазе и фосфатазе. Лизати су центрифугирани 10 минута на 12,000×г да би се добили супернатанти за даљу анализу. Концентрација протеина лизата је мерена коришћењем квантификационог теста бицинхонинске киселине. Протеини (50–100 µг) су одвојени коришћењем 10% СДС-ПАГЕ, пребачени на поливинилиден дифлуоридну мембрану и инкубирани са моноклонским примарним антителима усмереним на ТРАФ6, НФ-κБ РАНКЛ, ПИ3К, Акт, ОПГ и -актин (1:500). Иста мембрана је скинута и поново испитана, са хемилуминисцентним сигналима које је детектовао софтвер Имаге Лаб. -актин или тубулин служио је као унутрашња контрола.

3.8. Статистичка анализа

Сви подаци добијени из експеримената на животињама анализирани су коришћењем једносмерне анализе варијансе са Денетовим тестом од стране СПСС-а (верзија 22.0, ИБМ СПСС Статистицс, ИБМ Цорп., Армонк, Њујорк, Њујорк, САД ) софтвер; вредност п < 0.05 се сматрала статистички значајном, а сви резултати су представљени као средња вредност ± СД.

4. Закључци

Укратко, Цис А,активни фенилетаноидни гликозидиизолован из Ц. десертицола, показао је значајну антиостеопоротску активност на ОВКС мишевима, а молекуларни механизам може бити повезан са ТРАФ6-посредованом инактивацијом НФ-каппаБ и ПИ3К/Акт активацијом, што је вероватно обећавајући агенс за лечење остеопорозе болести.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗААНТИОСТЕОПОРОЗНА АКТИВНОСТПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%