Ефекат кинеске биљне медицине Цистанцхе на рани ембрион-фетални развој
Mar 08, 2022
Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com
Ли Иуфанг 1, Ксу Кинвеи 2, Зханг Ли 2, Зханг Венцханг 2, Фенг Схутанг 3*
[Апстрактан]Користи свињуембрионаод вантелесне оплодње за истраживање и поређење. Ефекат додавањакинескилексастојциЦистанцхеа Астрагал до развојарани ембриониу медијуму НЦСУ{{0}} је доказано. Експеримент је доказао да: (1) Однос запремине од 0,10 проценатаЦистанцхеи 0.10 процената Астрагалус је додат у бујон културе, иЦистанцхеДодатна група Стопа бластоциста (15,76 процената) била је значајно већа од оне у празној групи (9,26 процената) (П<0.05). the="" blastocyst="" rate="" of="" the="" astragalus-added="" group="" (10.09%)="" and="" the="" blank="" group="" (9.26%)="" were="" not="" significantly="" different="" (p="">0.05), што указује на тоЦистанцхедесертицоламоже значајно промовисатирани ембрионразвој. (2) Када је концентрација (В/В) одЦистанцхеје {{0}}.05 процената и 0,10 процената, стопа бластоциста (17,02 процената и 16,75 процената) је значајно већа од празне групе (0) (П<0.01) and="" 0.15%="" group="" (8.94%)=""><0.05). (3)="" adding="" 0.10%="" traditional="">кинескилекЦистанцхеу медијуму културе у 2-ћелијском стадијуму, стопа развоја бластоциста (13,81 проценат ) била је значајно већа од оне у фази 4- ћелије (7,53 процената ) (П<0.05), and="" compared="" with="" the="" addition="" of="">Цистанцхеbefore cleavage (13.67%) ) Is slightly higher, but the difference is not obvious (P>0.05).
Због разлика у развојном окружењу ин виво и ин витро, тхеембрионаће бити оштећени слободним радикалима током ин витро културе раних свињаембриона, узрокујући поремећаје ћелијског метаболизма, или оштећење ДНК, РНК и протеина [1]. У циљу даљег побољшања стопе развоја вантелесне оплодње смрзнутом спермом, овај експеримент је истраживао додавање одређене концентрацијеЦистанцхеи Астрагалус за побољшањеембрионразвојно окружење ин витро.
1. Материјал и методе
1. 1 Услови културе:
Ин витро сазревање свињских јајних ћелија, ин витро оплодња и ин витро култура раних ембриона су спроведени у инкубатору са 5 процената ЦО2 и максималном засићеном влажношћу од 39 степени.
1.2 Реагенси и подлога за културу:
Базална течност за сазревање ооцита је НЦСУ{{0}}, течност за испирање јајних ћелија је ПВА-ТЛ-ХЕПЕС течност, течност за ђубрење је Трис пуфер (мТБМ) који садржи 0.1 проценат БСА, и течност за испирање сперме је Дубеццо са 0.1 проценат БСА. Слани раствор са фосфатним пуфером (ДПБС), течност за одмрзавање сперме је БТС, кумулусна течност је 1 мг/мЛ хијалуронидазе ПБС, течност за операцију ооцита је ХЕПЕС пуферована НЦСУ-23, а течност основне културе раних ембриона је допуњена са 0 .4 процената БСА НЦСУ-23, додајте (В/В) 0.05 процената ~0.15 процената Цистанцхе по потреби, користите БТС за одмрзавање сперме. Пре употребе, претходно загрејте и уравнотежите више од 4 сата у инкубатору који садржи 5 процената ЦО2 ваздуха и максималну засићену влажност од 39 степени [2].
1.3 Метода кључања кинеске медицине Цистанцхе:
Цистанцхе раствор: Узмите 5 г и ставите у чашу од 1{{5}0 мл, додајте ултра чисту воду и потопите у ултра чисту воду, кувајте на јакој ватри и држите да кључа 20 минута, а затим сакупите супа; поновите горњи поступак, сакупите 3 пута за редом, константна запремина до 100 мЛ, филтер 0,22 μм резервни. Раствор астрагалуса: Узмите 5 г и ставите у чашу од 100 мл, додајте ултрачисту воду и потопите, прокувајте на јакој ватри и држите да кључа 20 минута, а затим сакупите лековиту супу; поновите горњи поступак, сакупите 3 пута за редом, подесите запремину на 100 мЛ, филтер 0,22 μм резервни.
Кинеска медицинаБиљни:Цистанцхе
1.4 Ин витро сазревање јајних ћелија свиња:
Јајници крмача су сакупљени из кланице хране у Пекингу Пенгцхенг, смештени у 0.9 процената нормалног физиолошког раствора који садржи антибиотике на око 38 степени, транспортовани назад у лабораторију у року од 4 сата и испрани нормалним физиолошким раствором три пута. Користите шприц од 10 мЛ са 12-иглом за мерење да бисте издвојили ооците са фоликулима пречника 2-6 мм на површини јајника. Оперите 3~4 пута у раствору ТЛ-ХЕПЕС и 3~4 пута у НЦСУ-23 који је био уравнотежен у инкубатору за угљен-диоксид више од 4 сата. Пренесите 20~30 ооцита као групу у 100 μЛ, додајте 10 процената ПФФ, 10 ИУ/мЛ ХЦГ, 10 ИУ/мЛ ПМСГ, 10 нг/мЛ ЕГФ НЦСУ-23 капљица и културу око 22 сата, Промените медијум до НЦСУ-23 капљица са 10 процената ПФФ, 10 нг/мЛ ЕГФ и наставите са култивисањем 44~46 х[3].
1.5 Капацитација сперме и вантелесна оплодња:
Припремите раствор мТБМ без кофеина и БСА и еквилибришите га 48 сати у инкубатору са 5 процената ЦО2 и максималном засићеном влажношћу од 39 степени, подешавајући пХ вредност у опсегу од 7,2~7,8; додајте кофеин и БСА 44 сата пре употребе и наставите са равнотежом. Семе је тестирано на квалитет и 10 мЛ је центрифугирано на 900 о/мин током 3 минута, 10 мЛ раствора ДПБС који садржи 0,1 процента БСА је додато за суспензију и центрифугирано на 900 р/мин за 3 мин [3]; након што је 1 мЛ раствора ТБМ суспендован, нагнут је за 60 степени. Третман сакупљања енергије узводно се спроводи у инкубатору са 5 процената ЦО2 ваздуха и максималном засићеном влажношћу од 39 степени током 1 х[3~5]. Комплекс ћелија ооцита-кумулус који сазрева до 44~46 ставља се у раствор за испирање ооцита који садржи 0,1 проценат хијалуронидазе, а кумулусне ћелије се уклањају пипетирањем, а затим се јајне ћелије излажу. Оперите 3 пута у избалансираном ТБМ, и на крају ставите сваки 10-15 комад у групу од 50 μЛ ТБМ и сачекајте сперму [6, 7]. Убризгајте 50 μЛ узводне сперме из капацитације у капљицу ооцита које садрже ТБМ и извршите оплодњу 6 х у инкубатору са 5 процената ЦО2 и максималном засићеном влажношћу од 39 степени.
1.6 Рани развој и откривање оплођених јаја:
После 6 сати од оплодње, јајне ћелије су третиране НЦСУ-23 пуфером са оперативном течношћу ХЕПЕС или НЦСУ- 23 са 0.4 процента БСА у течности културе ембриона. 23 Исперите 3 пута, промените медијум у балансирану капљицу 0.4 процента БСА НЦСУ-23 и инкубирајте дуже од 8 дана. Проверите стопу поделе хипотетичких оплођених јаја другог дана, проверите стопу моруле ( плус стопа бластоциста) 6. дана и проверите стопу бластоциста 8. дана [8]. Сви су прегледани и снимљени испод огледала.
1.7 Експериментални дизајн:
1.7.1 Утицај састојака традиционалне кинеске медицине Цистанцхе на рани развој ембриона.
Вузхисхан свиња[8] Након капацитације, вантелесне оплодње, оплодња је завршена, а након што дође до цепања, ембриони се размењују док се не додају на 0.1 проценат (В/В). Цистанцхе, 0.1 проценат астрагалуса и НЦСУ-23 (0.4 процената БСА) без важних састојака (празна група) су култивисани да би се посматрао развој оплођених јаја и раних ембриона , и проценити ефекте две компоненте традиционалне кинеске медицине на утицај раног ин витро развоја ембриона.
1.7.2 Утицај концентрације Цистанцхеа на рани развој ембриона.
Семе свиње Вузхисхан је капацитирано и подлеже вантелесној оплодњи. Након што се оплодња заврши, течност се мења у {{0}} проценат (празна група), 0.05 процената, 0.1 проценат и 0,1 одсто, респективно. У 15% Цистанцхе НЦСУ-23 (0,4% БСА), посматрајте развој оплођених јајних ћелија и процените утицај различитих концентрација компоненте кинеске медицине Цистанцхе на рани ин витро развој ембриона.
1.7.3 Утицај периода додавања Цистанцхеа на рани развој ембриона.
Семе свиње Вузхисхан је капацитирано и подлеже вантелесној оплодњи. Након завршетка оплодње, оплођено јаје се дели на {{0}}ћелијску фазу, а оплођено јаје се дели на 4-ћелијску фазу, течност се размењује и додаје одвојено. 0.1 проценат Цистанцхе НЦСУ-23 (0,4 процената БСА), посматрајте развој оплођених јајних ћелија и процените ефекат додавања цистанша на рани ин витро развој ембриона у различитим фазама.
1.8 Статистичка анализа:
Користите СПСС13.0 тест хи-квадрат (χ2) и једносмерну анализу варијансе.
2. Резултат у анализи
2. 1 Утицај састојака традиционалне кинеске медицине на рани развој ембриона
As shown in Table 1, in the Cistanche and Astragalus group, the morula rate was not significantly different from that of the blank group (P>0.05). Стопа бластоциста у две групе била је већа од оне у слепој групи, а стопа бластоциста у групи Цистанцхе била је другачија од оне у слепој групи. Значајно (П<0.05). it="" is="" believed="" that="" cistanche="" has="" a="" better="" effect="" on="" promoting="" early="" embryonic="">
2.2 Утицај концентрације састојка кинеске медицине Цистанцхе на рани ембрионални развој
Као што је приказано у табели 2, додавање Цистанцхеа у запреминској концентрацији од 0.05 процената до 0,10 процената у течности културе ембриона има бољи промотивни ефекат на ВЗСП замрзнуту сперматозоидну течност ин витро оплодње ембриона , а стопа развоја бластоциста значајно се разликује од оне у слепој групи (П<0.05); the="" blastocyst="" development="" rate="" of="" 0.15%="" cistanche="" deserticola="" was="" 0,="" which="" was="" significantly="" different="" from="" other="" groups=""><0.01). it="" means="" that="" if="" the="" concentration="" of="" cistanche="" is="" too="" high,="" it="" may="" cause="">
2.3 Ефекат додавања периода састојка кинеске медицине Цистанцхе на рани ембрионални развој
As shown in Table 3, after testing and analysis, the addition of Cistanche at a volume concentration of 0.10% at the 2-cell stage has a better-promoting effect on the WZSP frozen sperm liquid in vitro fertilization-embryo, and there is no significant difference from the addition before the cleavage (P>0.05). Међутим, постојала је значајна разлика у поређењу са додавањем 4 ћелије (П<0.05); it="" indicated="" that="" the="" addition="" of="" cistanche="" at="" a="" volume="" concentration="" of="" 0.10%="" in="" the="" 2="" cell="" stage="" was="" most="" suitable="" for="" early="" embryo="">
3. Дискусија
У поређењу са нормалним развојемембрионаин виво, развојно окружење ИВФ оплођеноембрионазначајно се разликује. Током процеса одембрионраста и деобе, ствара се велика количина бр, слободних радикала и неких токсичних материја, што је неповољно за раст ембриона. Ембриони који се нормално развијају у телу могу елиминисати ове неповољне факторе кроз метаболизам унутрашње средине; ови неповољни фактори ће се увек акумулирати у окружењу раста ембриона вантелесне оплодње. ТрадиционалникинескилексастојакЦистанцхеможе имати функцију смањења концентрације и елиминисања одређених слободних радикала, како би се даље побољшао развој вантелесне оплодње замрзнутим семеном. Експеримент је истраживао додавање одређене концентрацијеЦистанцхеи Астрагал. Резултати су потврдили да Астрагалус није имао ефекта на побољшање окружења културе ин витро. Одговарајућа концентрација одЦистанцхеима одређени промотивни ефекат нарани ембрионразвоја, али када је концентрација наЦистанцхепрелази одређену концентрацију, такође делује инхибиторно наембрионразвој.
Даље смо истражили различите ефектеЦистанцхе, традиционалникинескилеккомпонента, у различитим фазама, а експеримент је открио да јерани ембриониимају већу стопу развоја у каснијој фази кадацистанцхесе додаје у фази ћелије 2-. Могући разлог је због спољашњег окружења рецептора. Азот оксид (НО) је сигнални молекул и цитотоксични фактор са широким спектром биолошких активности. Ефекат НО нарани ембрионразвој треба пратити уназад дорани ембрионфаза развоја, која може бити узрокована једним од узрока 2-ћелијског блока (2-целлблоцк) у култури ембриона сисара, а ин витро блок свиња се јавља у 4-ћелијској фази [ 9]. Додатак традиционалногкинескилексастојци могу у одређеној мери елиминисати слободни радикал НО и ублажити неповољне фактореембрионраст [10].
Цистанцхе
Референце
[1] Компорт М. Три модела ћелијске инфузије изазване слободним радикалима[Ј]. Цхем Биол Интерацт, 1989, 72( 1/2) :1- 56.
[2] Пан Денгке. Студија о факторима који утичу на развој клонираних соматских ћелија свињаембриона[Д]. Пекинг: Кинески пољопривредни универзитет, 2005.
[3] Зханг Јунхаи. Истраживање производње клонираних свињаембрионакоришћењем технологије нуклеарног трансфера соматских ћелија [Д]. Пекинг: Кинески пољопривредни универзитет, 2005.
[4] Лу Схенгсхенг, Зханг Ианлинг, Схи Десхун, ет ал. Ефекти додавања говеђег серума и свињске фоликуларне течности током сазревања на нуклеарно сазревање јајних ћелија свиња ирани ембрионразвој након вантелесне оплодње [Ј]. Хеилонгјианг сточарство и ветеринарска медицина, 2002, (8):1- 3.
