Сажетак:КоришћењеЦистанцхе ДесертицолаПасазитивљавање две биљке домаћина (халокилон аммодендрон и атриплек цанцесценс) као испитивање материјала, ова студија је одредила садржај полисахарида у Ц. десертицоли из различитих домаћина коришћењем методе фенол-сумпорне киселине. Транскрипт секвенцирање и анализа халоксилона-цистанзе иАтриплек-цистанско удружењаспроведене су коришћењем платформе за секвенцирање Иллумина НоваСек 6000. Истраживање се фокусирало на истрагу транскриптивне разлике у Ц. Десертицоли из различитих домаћина, кључни ензимски гени који су укључени у метаболизам полисахарида и потврђујући одабране гене путем КРТ-ПЦР верификације. Ова студија има за циљ да пружи теоријску основу за истраживање нових биљака домаћина и генетског побољшања Ц. Десертицола. Резултат је показао да је садржај полисахарида који се налази у атриплек-четвороножници-цдесертицола био је супериорнији у тој присутној у халокилону аммодендрон-ц. Десертицола. Компаративном анализом транскрилата, 14089 различито изражени гени (дег) су приказани из меснатим стабљика атриплек-цевчара-ц. Десертицола и Халокилон Аммодендрон-Ц. Десертицола. Резултати анализе КЕГГ обогаћивања открили су да су ови дег-ови најкасније обогаћени путевима везаним за метаболизам угљених хидрата, метаболизам галактозе, метаболизам аминокиселина и метаболизам масних киселина. Поред тога, добијено је укупно 26 дег-а са четири путева у вези са метаболизмом полисахарида, међу којима је ниво експресије гена фруктозидазе гена и -галактозидазе у халоксилону аммодендрон-ц. Десертицола је била значајно већа од оних у атриплек-цеви за четкицу-ц. Десертицола. Нивои експресије гена и манозе -1- фосфате гена у Атриплек-у, гене за изражавање удп-глукозе дехидрогеназе удп-глукозе. Десертицола је била значајно већа од оних у Халокилону Аммодендрон-Ц. Десертицола, што је можда кључни ензимски гени за регулисање разлике метаболизма полисахарида у Ц. Десертицоли.

Кључне речи Цистанцхе Десертицола; Транскриптски редослед; домаћини; Разлика метаболизма полисахарида

Цистанцхе Десертицола

 

ЦИСТАНЦХЕ ДЕСЕРТИЦОЛА ИЦ МА, првенствено дистрибуирано уГансу, Ксињианг, Нингкиа и унутрашња Монголија, да ли је недавно традиционална кинеска лековита биљка која је недавно укључена у"Лековити и храни хомологни"Каталог. Има различите здравствене користи, као што суТонирање бубрега ианг, храњења суштине и крви и промоција покрета црева, што се то широко примењујеМедицина, здравствена заштита и прехрамбена индустрија[1]. Због њехетеротрофична природа, Цистанцхе Десертицолапаразитира различите биљке домаћина, саХалокилон Аммодендрони ново уведениполу-зимзеленски грмАтриплек цанцесценс(Пурссх) Нутт.Бити њен примарни домаћини.

Полисахариди су кључне активне супстанце у процениЦистанцхе ДесертицолаКвалитет. Под различитим условима домаћина, ТхеАкумулација и метаболички саставодЦистанцеПолисахариди значајно варирају [2]. Медицинско истраживање је то показалоЦистанцеПолисахариди поседујуантиоксидант, неуропротективан, имунолошки регулисање и побољшање меморијефармаколошки ефекти, ефективно ублажавајућиАлзхеимерова болест, Паркинсонова болест и недостатак слезине на линији јетре[3]. Са унапређењем у модерномТехнике екстракције и технологије са више спектра анализе, ТхеСадржај, састав и структурне карактеристикеодЦистанцеПолисахариди се постепено разљути, шири своје апликације.

У смислуИстраживање молекуларне биологијеуЦистанцеврсте, истраживање транскриптаних секвенцирања углавном су се фокусирале на тоЦистанцхе ТубулосаиХалокилон-ЦистанцеСложени системи.На пример,Хоу ет ал.[4] извршеноТранскрипциона секвенцирање целог дужине и профилирање генаодЦистанцхе ТубулосакоришћењеПАЦБИО и БГИСЕК -500 РНА-СЕК технологије, идентификовање237.772 јединствени транскриптии кључни ензимски ензимски гени укључени уфенилетаноидно гликозидно биосинтеза. Слично томе,Фенг ет ал.[5] спроведенотранскриптске и метаболомичке анализехаусториа и суседне ткиваХалокилон корени иЦистанцеМеснасте стабљике, откривање улоге домаћина у накупљањуЦистанцеМетаболити. Њихова студија је нагласила да је тобиљка домаћина не само да утиче само на приносЦистанцеали и његов квалитет. Међутим, истраживање даљеЦистанцеПасазитизирање различитих биљака домаћина остаје ограничено.

Атриплек цанцесценс, a дубоко укорењено и високо постројење за отпорно на стрес, разликује се од традиционалногХалокилон домаћини потиче одПолусусето платоеа централне Сједињене Америчке Државе. Последњих година је уведено и промовисано каоНови домаћин заЦистанцхе ДесертицолакултивацијауСјеверозападни Кина. Кинг и др.[6] Анализирано и упоређивањеАкумулација полисахаридаЦистанцеПасазитизирање халоксилона и атриплек цанцесценсу истој производној области, налазећиЗначајне разлике у садржају полисахаридаизмеђу два услова домаћина.

Дакле, ова студија има за циљредослед меснате стабљикеЦистанцхе ДесертицолаПасазитизирање халоксилона и атриплек цанцесценс, АнализирајућиДиференцијални израз кључних ензимских гена укључених у биосинтезу полисахарида. Налази ће обезбедитиТеоретска основа за даља истраживањаЦистанцемеханизми биосинтеза полисахарида, обогаћује транскриптске студије на атриплек-Цистанцесистеми и промовишу иновације у висококвалитетномЦистанцеРесурси гермплазма.

 

Материјали и методе

1.1 експериментални материјали

Цистанцхе ДесертицолаУзорци ПасазитизујеХалокилон АммодендрониАтриплек цанцесценсприкупљени су одЦистанцебаза за култивацију уКсикуан Товн, Жупанија Јингтаи, провинција Гансу(ширина36 степени 5 'н, дужина103 степени 42 'Е). ОбојеХалоксилониАтриплек цанцесценскултивисани су у истом окружењу. Узорци су категорисани каоХалокилон-Цистанце(Узорак А)иАтриплек-Цистанце(Узорак х),са три реплике за сваку категорију (пет биљака по реплике). Узорковање је спроведено у20. априла, а узорци су идентификовани каоЦистанцхе ДесертицолаМесне сијалицеПрофесоре Гуо ИехонгодЦОЛЛЕГЕ ОПЕРУРЕ, ГАНСУ Пољопривредни универзитет.

ПратећиСмернице узорковања Шангаја ОЕ Биотецх Цо, Лтд., ТхеЦистанцеМеснасте стабљике испратиле су ултраПруће воде, а вишак влаге је уклоњен помоћу филтерског папира. Танке кришке су преузете изврх, средина и дносваке стабљике, темељно мешати и смештени у криогене бочице. Узорци су билибрзо смрзнут у течном азотуза2 сатапре него што је пребачен на а-80 Дипломирани замрзивачЗа складиштење [7].

1.2 Експерименталне методе

1.2.1 Успостављање стандардне кривуље и одређивање садржаја полисахарида

A 10 мгузоракД-глукозни стандардтачно је тежио и растворен у а100 мл Волуметријска тиквицаса дестилованом водом да припреми а100 уг · Млује раствор залиха. Калибрациона решења{0}}. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8 и 0,9 млзалиха решења је пребачена у10 мл чепљених тестних цеви, разблажен водом до1. 0 МЛ, а потом се помешала са1. 0 МЛ 6% фенол решењеи5 мл концентроване сумпорне киселине. Након вртложног вртлога, решења су загревана у кувању водене купељство за20 минута, затим је охлађен у леденој кабини за воду10 минута. A празна контролаприпремљен је коришћењем1. 0 МЛ дестиловане водеуместо раствора глукозе. Апсорбанција је мерена на482 нмкористећи аУВ-ВИС спектрофотометари аСтандардна криваје генерисан саконцентрација (к) као хоризонтална осовинаиапсорбанција (и) као вертикална осовина.

Након модификованог приступа одЛИ ЈИЕ и др. [8], 0. 2 г сушеногЦистанцепрашакје тачно тежио и смештен у а20 мл чепљене тестиране цеви. 10 мл 80% етанолаје додат, а смеша је подвргнутаУлтразвучна вађење на 80 степени (100 В, 40 кХз) 30 минута. Екстракт је филтриран док је вруће и поступак се понављао једном. После сушења остатка,10 мл дестиловане водеје додат, а ултразвучна вађење је поновљена два пута. Филтрати су комбиновани и разблажени20 млса дестилованом водом.1. 0 МЛ овог решењадаље је разблажен до10 млса дестилованом водом.

A 1. 0 мл аликвотаприпремљеногЦистанцеУзорак раствора је анализиран истом поступком као и стандард глукозе. Апсорбанција на482 нммерен је и садржај полисахаридаЦистанцеИзрачунато је из различитих биљака домаћина.

1.2.2 РНА екстракција, изградња библиотеке цДНА и секвенцирање

Укупна РНА је екстрахована изЦистанцхе ДесертицолаУзорци ПасазитизујеХалокилон АммодендрониАтриплек цанцесценскористећиТианген ДП441 РНА Кит (Кина), пратећиТризол Протокол реагенса. РНА чистоћа је процењена саНанодроп 2000 Спектрофотометар (Тхермо Сциентифиц, УСА), док су концентрација и интегритет РНА процењени помоћу анАгилент 2100 Биоанализер (Агилентне технологије, САД).

Транскриплне библиотеке су изграђене помоћуВАХТС УНИВЕРСАЛ В6 РНА-СЕК ПРЕПЋИ КИТ КИТ. После контроле квалитета саАгилент 2100 биоанализер, библиотеке су секвенциониране наИллумина НоваСек 6000 платформа, Генеринг150 БП Упарени прочитани.

1.3 Анализа података

1.3.1 Скупштина транскрила и функционална напомена

Сирови читаФастк форматпрерађени су коришћењемТримоматскида се уклониПлои-Н гласи и клањају се и неквалитетни, што резултирачисто читање. Адаптер секвенце и нискоквалитетни региони су уклоњени, а чисте читање су окупљене уконтигери(ИЗРАЧИЛИКА ТОГНОГ Ознака) користећиТринити Софтваре. Најдужи транскрипт из сваког кластера изабран је каоунигенскиЗа даљу анализу.

Функционална напомена Унигена је извршена упоређивањем од њих противНЦБИ невишна (НР) база података протеина, швајцарски-прот и еволуциона родослова гена: база података о ортологним групама (ЕггНог)коришћењеДијамантски софтвер (е-вредност <1е -5). Еукариотске ортологне групе (Ког) напоменаје извршено да идентификује хомологне гене. Поред тога, унигени су пресликаниКјото Енциклопедија гена и генома (КЕГГ) ПАТХВАИЗа напомену метаболичких пута.ГЕНИ ОНТОЛОГИЈА (ГО) Класификација и функционална напоменаспроведене су коришћењем пресликавања из базе података швајцарске прот.

1.3.2 Анализа експресије гена и идентификација различитих изражених универзатора (дег)

Нивои експресије гена квантификовани су користећиБовтие2да се усклади чисто читањем унигене. Вриједности израза израчуната су каоФрагменти по килобази транскрипта на милион пресликаних очитаних (ФПКМ)коришћењеЕкпресс Софтваре. Извршена је анализа диференцијалне изразе коришћењемДесек2 софтвер, саНегативни тестови биномалне дистрибуције (НБ)користи се за испитивање значаја. Различити изражени гени (дег) су дефинисани као они са њимаК-вредност <0. 05ипреклопна промена (ФЦ)> 2.

1.3.3 КРТ-ПЦР Валидација различито експримираних гена

Кључни ензимски гени укључени уПолисахаридна биосинтезасаЗначајан диференцијални изразизабрани су заКвантитативни ПЦР (КРТ-ПЦР) валидатион. РНА узорци су проверени и вредности су мерене вредности пре реверзне транскрипције. Синтеза цДНА је извршена помоћуТрансСцрипт Алл-ин-Оне Синтесис ЦДНА синтеза Супермик за КПЦР комплет. Синтетизована цДНА је разблажена10-, а КРТ-ПЦР је обављен коришћењем аФлуоресцентни КПЦР системпод различитим бициклистичким условима.АЦТБ (бета-актин) коришћен је као интерни референтни гени релативни ниво експресије гена израчунати су коришћењем2⁻ΔЦТ метода.

 

Табела 1 Правилније секвенце

ГЕНИ ИД	Име гена	Напред према напред (5 "-3 ')	Обрнути прајмер (5 '-3')
Тројство _ ДН 21412_ Ц 0_ Г 1_ и {4}}	ГМПП	Гатагтггцтацаацатцактт	Ццтццтцттцгтцгтаггаттц
Тројство _ ДН 30174_ Ц 0_ Г 1_ и {4}}	Укрцавање	Тататгггаццатггааццааа	ГАЦЦАТАГГЦЦГТГАТЦГАТЦ
Тројство _ ДН 25715_ Ц 0_ Г 2_ и {4}}	Угдх	АААГАТЦТТЦЦАГТТЦГТААГЦ	АЦЦААТТЦГГТТГАТГЦТАЦЦ
Тројство _ ДН 28766_ Ц 1_ Г 1_ и {4}}	лацз	Гтцтццттгттаттцгтгаггат	Гтцгатггтггтгаагцагат
Тројство _ ДН 24102_ Ц 0_ Г 6_ и {4}}	саца	Ттацгаггатагтгаггтгцта	ААТГГААГАТГАГГАГГТТГА
Тројство _ ДН 21508_ Ц 1_ Г 2_ и {4}}	лацз	Ггцацагтцааггагтацгатг	Цацтггцатцгацгаггаааг
-	Глумити	Цаатггатгатгататцгццгцгт	Цацтггцатцгацгаггаааг

 

 

1.4 Анализа података

Хијерархијска анализа кластерирањаРазличити изражени гени (дег)је обављен коришћењемR (v3.2.0)Да бисте визуализовали обрасце гена експресије у групама и узорцима. Идите (Гене Онтологи) Анализа обогаћивања иКЕГГ (КИОТО Енцицлопедија гена и генома) Анализа обогаћивања путаспроведене су коришћењемR, на основухипергеометријска дистрибуција. Значајно обогаћени функционални услови приказани су користећиБарске графиконе, мехуриће за мехуриће и обогаћене кружне парцеле.

2 резултата и анализе

2.1 Резултати утврђивања садржаја полисахарида

Линеарна регресијска једначина добијена из мерења апсорбанције била је:

и {0}}}. 0 154к-0.1636 (Р 2=0. 9963) и=0. 0154к - 0. 1663) и 2=0.

са линеарном опсегом20-90 уг · млу. Прецизност, поновљивост, стабилност и брзина опоравка узорка{0}}. 38%, 0. 86%, 0,53% и 99,67%, респективно.

МереноСадржај полисахаридауЦистанцхе ДесертицолаУзорци из различитих биљака домаћина били су:

Халокилон-Цистанце: 6.51%

Атриплек-Цистанце: 11.83%

2.2 Транскриптивне секвенцирање и скупштина података

Транскрипт секвенцирањешест узоракагенерисано укупно41.77 г чистих података. Важећи подаци по узорку крећу се од6,89 г до 7,04 г, саК30 основни проценти између 95,38% и 95,91%и анПросечни садржај ГЦ-а од 45,13%.

Укупно61.423 Унигенессу састављени, укупне дужине65,962,858 БПи анПросечна дужина од 1,073,91 бп.

2.3 Функционална напомена гена

Укупно61.423 Унигенессу добијени од секвенцирањаЦистанцхе ДесертицолаУзорци паразитиришући две различите биљке домаћина. Резултати напомена су следећи:

30,689 Унигенес (49,96%)били су напоменути уНР (невишна) база података протеина.

18.698 унигена (30,44%)били су напоменути уШвајцарска база података.

3,998 УНИГЕНЕС (6,51%)били су напоменути уБаза података КЕГГ.

17.188 унигене (27,98%)били су напоменути уКог (еукариотске ортолошке групе) база података.

25.280 Унигене (41.16%)били су напоменути уЕггног (еволуционаран родогости гена: база података о право надгледаним ортологним групама).

16.210 унигене (26,39%)били су напоменути уИдите базу (ген онтологи) база података.

16.153 Унигене (26.30%)били су напоменути уБаза података ПФАМ (Протеина породице).

Међу њима,21.650 унигенабили су дужи од1 КБ.

Анализа хомологије на основуНР база податакаоткривено да су прве три најближе повезане врсте биле:

Пауловниа Фортунеи (30,23%)

Пхеироспермум јапоницум (14,15%)

Цхеноподиум Куиноа (7,1%)

 

 

Табела 2 Информације о напоменаЦистанцхе ДесертицолаФункција гена

База података	Број гена напомена	Пропорција (%)
Брз	30,689	49.96
Швајцарски прот	18,698	30.44
Кегг	3,998	6.51
Ког	17,188	27.98
јаљен	25,280	41.16
Ићи	16,210	26.39

 

 

2.4 Иди и КЕГГ Функционална напомена и класификација

ТхеИдите базу (ген онтологи) база податакакоришћен је за даље напомене да су унигене идентификовани уНР база података, што резултира укупно16.210 Унигенес. Ови сенигени су категорисани уТри главне функционалне групе:

Биолошки процес (БП)

Молекуларна функција (МФ)

Целлуларна компонента (ЦЦ)

УБиолошки процес (БП) Категорија, најобичнији унигенски кластери су били:

"Целларни процес" (11.023 Унигенес)

"Метаболички процес" (9,117 Унигенес)

За тоКЕЛТУЛАРНА ЦОМПОНЕНТ (ЦЦ) Категорија, 17 подкатегоријаидентификовани су, са сваком подкатегорију која садржи најмање30 унигенес. Највећи кластери су били:

"Ћелија" (13.947 Унигенес)

"Ћелијски део" (13.918 Унигенес)

УКатегорија молекуларне функције (МФ), најонијегираније функционалне групе су биле:

"Везивање" (10.039 Унигенес)

"Каталитичка активност" (8.490 Унигенес)

Сл.2 Идите функционалну напомену и класификацију Унигена

 

КЕГГ Функционална напомена и класификација

За времеТранскриптски редослед, укупно3.998 унигенебили су напоменути уБаза података КЕГГ (КИОТО Енцицлопедија гена и генома). Ове Унигене су се класификованеШест основних категорија, са њиховим одговарајућим бројевима и пропорцијама на следећи начин:

Целуларни процеси: 326 Унигенес (8.15%)

Обрада информација о животној средини: 299 Унигенес (7.47%)

Обрада генетске информације: 1.771 унигене (44.30%)

Људске болести: 14 унигенес (0.35%)

Метаболизам: 1.465 унигене (36.64%)

Органисмени системи: 123 Унигенес (3.07%)

Ових шест основних категорија је даље подељено у20 средњих нивоа класификације. Међу њима,Обрада генетске информацијеимао највећи удео, праћенМетаболизам. УнутарМетаболизамКатегорија, најобичније путеве су биле:

Метаболизам угљених хидрата

Метаболизам масне киселине

Флавоноидни метаболизам

Сл.3 КЕГГ МЕТАБОЛИЦ ПАТХВАИ АНКАТОНИЦЕ ОФ УНИГЕНЕС

 

2.5 Диференцијални израз гена и анализа обогаћивањаЦистанцхе ДесертицолаИз различитих домаћина

Подаци о секвенцирању транскрилата филтрирани су помоћуПодразумевани критеријуми за избор диференцијалних експресија, што резултира идентификацијом14,089 различито изражени гени (дег):

6.576 гена је уграђено

7.513 гена је смањено

A парцела вулканаје генерисан да би се визуализовала укупна дистрибуција дег.

УТоп 30 ГО обогаћивање Функционалне класификацијеОд дег, примећено је да:

У поређењу саБиолошки процес (БП)иЦеллуларна компонента (ЦЦ)Категорије,Молекуларна функција (МФ)изложили су значајнији обогаћивање дег.

Најпознатије је обогаћено дигсове су биле повезане саметаболизам нуклеинске киселине, метаболизам протеина и кључни ензими у метаболизму галактозе.

Поред тога, дег је био значајно обогаћенИди услови повезани са метаболизмом полисахарида, укључујући:

Метаболички процес скроба

Гликоген биосинтетички процес

Процес сахарозе

Активност глукозидазе

Активност УДП-Л-Рхамносе Синтасе

Активност хидролазе полисахарида

Сл.4 Волкански мапа различито изражених гена

 

Анализа обогаћивања КЕГГ-а за паметЦистанцхе ДесертицолаИз различитих домаћина

Да додатно истражујуРазличити изражени гени (дег)уЦистанцхе Десертицолаиз различитих биљака домаћина,Анализа обогаћивања путем КЕГГ-аје изведено. Анализа је открила да:

Дег је пресликано на 117 метаболичких путева.

ТхеТоп 20 путаприказанзначајно обогаћивање од дег, са нај обојенијих путева, укључујући:

Метаболизам масне киселине

-Линоленски метаболизам киселине

Галактоза метаболизам

Разградња лизина

Даљња анализа обогаћивањаТоп 20 метаболичких категорија са најмањим К-вредностиманазначено да су се дег значајно обогаћене:

Органисмени системи

Метаболизам

Обрада генетске информације

Међу тим категоријама,"Метаболизам"имао је највећи број обогаћених дег-а и показао најзначајнији обогаћивање. Поред тога, у обогаћеним метаболичким путемудео Уграђених и смањених уреда је био скоро једнак.

Ови налази сугерирају тоМетаболички пут играју пресудну улогуУ различитом експресију генаЦистанцхе Десертицолаиз различитих биљака домаћина, посебно уЛипидни, угљени хидрат и метаболизам аминокиселина.