Побољшање протеомике можданог ткива одозго надоле са ФАИМС-ом, део 3

Једно непосредно и очигледно запажање је да што је већи проценат распрострањености, већа је вероватноћа идентификације са ТДП. Другим речима, ТДП углавном идентификује протеине у великој количини.

Како старимо, многи људи сматрају да им је памћење опадало. Ово је уобичајена појава, посебно након што смо искусили дуготрајни ментални стрес, недостатак сна и неуравнотежену исхрану.

Али да ли сте знали да је један од начина да нам помогнете да побољшамо памћење да повећамо унос протеина у великом обиљу? Протеин високог изобиља је богат аминокиселинама, које могу синтетизовати молекул који се зове неуротрансмитер у мозгу и такође подстаћи раст и активност неурона. Неурони су најосновније јединице у мозгу и кључ су за наше способности учења и памћења. Према томе, протеини велике количине могу побољшати наше памћење побољшавајући функцију неурона.

Истраживање је такође показало везу између протеина и памћења. На пример, једна студија је открила да у поређењу са исхраном са високим садржајем протеина, исхрана са ниским садржајем протеина доводи до опадања функције мозга, укључујући пажњу и памћење.

Дакле, ако желите да побољшате своје памћење, можете и да додате неку храну богату протеинима у своју исхрану, као што су пилетина, риба, говедина, јаја, тофу, итд. Наравно, треба да обратите пажњу и на баланс и разноврсност ваше исхране, и не можете јести само једну врсту хране.

Укратко, протеини велике количине могу помоћи у побољшању нашег памћења. Ако желите да имате боље памћење, можете почети са исхраном и покушати да једете што више хране богате протеинима! То показује да треба да побољшамо своје памћење, а Цистанцхе може значајно да побољша памћење јер може да регулише и равнотежу неуротрансмитера, као што је повећање нивоа ацетилхолина и фактора раста, који су веома важни за памћење и учење. Поред тога, Цистанцхе такође може побољшати проток крви и промовисати испоруку кисеоника, што може осигурати да мозак добије довољну исхрану и енергију, чиме се побољшава виталност и издржљивост мозга.

Кликните на суплементе да бисте побољшали памћење

Отприлике половина гена идентификованих из скупова података одозго надоле (са или без ФАИМС-а) налазила се у горњих 20% канти за обиље за анализу одоздо према горе (слика 6А). Насупрот томе, 71 ген се могао наћи само у скуповима података одозго надоле ("НА" корпа) (слика 6А).

Чини се да ови гени представљају релативно кратке протеине (<150 AA) and contained numerous basic Lys/Arg residues which, presumably, precluded their ability to be detected by bottom-up analysis. 

На пример, укључени у корпу само одозго надоле били су хистонски протеини као што су Х3Ц1, Х4Ц1, Х1–4 и Х2БЦ12. Као што смо и очекивали, открили смо да ФАИМС може да побољша идентификацију у нижим процентима у односу на „Без ФАИМС-а“, повећавајући дубину видљивог протеома.

Одређивањем односа ФАИМС и „Но ФАИМС“ у свим перцентилима, приметан пораст идентификације испод 40. перцентила је очигледан унутар ЦВ-а у опсегу од −40 до −50 (Слика 6Б).

Међутим, када се узме у обзир апсолутни број гена, главни допринос предности ФАИМС-а је кроз проширење спектра идентификације у свим процентима обиља.

Однос између ФАИМС ЦВ и преноса протеоформа

Код ФАИМС-а, такође смо приметили тренд између ФАИМС ЦВ и молекулске тежине протеоформе (Слика 7). На −50 ЦВ, средња маса протеоформе је ∼5 кДа и расте на ∼15 кДа на −20ЦВ.

На основу ових дистрибуција масе (слика 7), чини се да су ЦВ мањи од -50 В добро прикладни за протеомске експерименте одозго на доле или од средине према доле, док ЦВ већи од -50 В можда имају користи од пептидомских или одоздо нагоре експерименте.

Уочени тренд молекуларне тежине вероватно се протеже преко -20 ЦВ; међутим, ограничили смо нашу претрагу на -20 ЦВ на основу опадања у протеоформама и идентификацијама гена што је довело до смањења приноса у покривености секвенце протеома по циклусу.

Треба напоменути да је претходни рад који је користио ФАИМС открио да је +40 ЦВ идеалан напон за преношење тешког ланца НИСТ мАб (∼51кДа) и -20 ЦВ био најбољи за одговарајући лаки ланац (∼23 кДа), подржавајући идеју да се тренд који посматрамо протеже на позитивне ФАИМС ЦВ-ове.45

Занимљиво, иако су многи спектри који идентификују једну протеоформу били ограничени на проналажење у опсегу од 10 В (3599 од 5165), било је седам протеоформа уочених у читавом ЦВ опсегу од -50 до -20. Претпоставља се да се то може приписати њиховој великој заступљености у узорку, посебно у случају убиквитина (УББ), базичног протеина мијелина и протеина који везује ацилЦоА.

Међутим, такође је вероватно да различита стања наелектрисања ових протеоформа усвајају неколико конформација гасне фазе у зависности од њихове протонске изомеризације, утичући на њихову мобилност.42

Ових седам протеоформи нам је омогућило да истражимо како се омотач стања наелектрисања различито преноси кроз модулацију ЦВ. Као прокси за дистрибуцију стања напуњености у сваком ЦВ-у, користили смо средње стање напуњености на основу подударања протеоформног спектра (ПрСМ) идентификованих у сваком ЦВ-у и пратили како се ова вредност променила као функција ЦВ-а почевши од -50 ЦВ.

МС1 скенирања на слици С3 показују како средње стање напуњености ПрСМ прати расподелу стања напуњености УББ-а. Од ових седам протеоформа, четири су пратиле инверзни однос, са средњим посматраним стањем наелектрисања које се повећавало како се ЦВ смањивао (Слика 8).

Вреди напоменути да је овај тренд генерално примећен код пептида и малих протеина.56,62–64 Изненађујуће, три протеоформе су показале супротан однос где је смањење ЦВ смањило уочена медијана стања наелектрисања (Слика 8).

Површно испитивање средње масе прекурсора између ове две групе сугерише да је већа вероватноћа да ће већи прекурсори фаворизовати стања већег наелектрисања пошто се ЦВ смањује.

Да бисмо даље потврдили ове односе, проширили смо ову анализу да бисмо укључили протеоформе које су идентификоване у скромнијем, али и даље широком опсегу ЦВ од 20–30 (н=256 протеоформа). Овде, протеоформе чије се средње наелектрисање померило више од једног наелектрисања преко цео ЦВ опсег је подељен у две различите групе у зависности од смера тог померања.

Они који су променили мање од једног пуњења сматрани су "неутралним" у погледу промене ЦВ-а. Слично претходним резултатима, већа је вероватноћа да ће већи прекурсори бити повезани са инверзним односом између посматраних стања наелектрисања и ЦВ (Табела С2).

Са смањењем ЦВ-а, чинило се да већина протеоформи преноси у стањима нижег напуњености (н=177) у поређењу са онима који су фаворизовали више стања напуњености (н=39). Остали (н=40) су сматрани "неутралним" у погледу промена у ЦВ-у.

Протеоформи спојени унутар неутралне групе показали су просечну масу прекурсора између инверзних и директних група, још једном сугеришући да је маса протеоформе суштински повезана са овим понашањем.

Други параметри засновани на примарним секвенцама, као што су састав базичне/киселине аминокиселине и алифатски индекс, нису били значајно повезани (Табела С2).

Иако су протеини који се уводе у гасну фазу вероватно денатурисани, фактори који су типично повезани са природним протеинима, као што су диполни момент или попречни пресек судара, могу имати бољу предиктивну вредност према овом феномену.64–66 Наши резултати показују како се ЦВ може користити за филтрирање протеина различитих масе, и како се омотач стања наелектрисања протеина може различито преносити и кроз ФАИМС.

Корисност фрагмената протеина у ТДП експериментима

Изненађујуће, значајан број протеоформа које смо идентификовали били су фрагменти већих протеина. Открили смо да само 25% јединствених идентификованих протеоформа покрива више од половине секвенце протеина из које су изведени.

Ових 25% је имало просечну масу од 11,4 кДа у поређењу са преосталих 75% који су имали просечну масу од 5,7 кДа. Неколико фактора може допринети овом запажању, од којих су неки независни од ФАИМС-а.

На пример, сами ови фрагменти могу бити продукти протеолитичког цепања произведени у нормалним хомеостатским условима као део ћелијског „деградома“,67 или упркос различитим предузетим мерама предострожности, уведеним током постморталног интервала и руковања узорком.

Ткиво централног нервног система је богат извор сигналних пептида познатих као "неуропептиди" који се обично добијају и од много већих протеина прекурсора.68

Унакрсним референцама наших идентификација протеоформа са успостављеном базом података неуропептида (НеуроПедиа),69 успели смо да идентификујемо неколико таквих неуропептида укључујући вазостатин-1, секретонеурин, холецистокинин-58 деснонопептид и неуропептид и и многе неканонске варијанте секвенце изведени из познатих гена који производе неуропептиде.

Осим биолошких фактора, одређени параметри инструмента такође могу утицати на посматрање фрагмената протеина. На пример, ниски напони „фрагментације“ у извору (између 10 и 20 В) се обично могу користити за уклањање адуката и десолватних јона протеина, док виши напони могу производи дисоцијацију изазвану извором.

Међутим, осетљивост амидних веза на дисоцијацију може увелико варирати, а како се величина протеина повећава, повећава се и вероватноћа да он садржи лабилне амидне везе као што је Ксаа-Про.70–73 Будући да се б- и и-јони могу ненамерно произвести кроз ово механизму, чак и при ниским напонима извора, одлучили смо да избегнемо примену напона извора како бисмо смањили шансу за увођење фрагментираних јона у инструмент.

Такође је могуће да су протеини подложни догађајима фрагментације док пролазе кроз електрична поља створена у ФАИМС-у. Међутим, не би се очекивало да ови фрагменти имају исту покретљивост као и родитељски јон, уз упозорење да то вероватно зависи и од величине фрагмента у односу на јон прекурсора.

На крају, вреди истаћи неколико фактора који могу бити пристрасни у погледу посматрања мањих протеоформа (<∼15 kDa). First and foremost is the signal spreading that occurs as the size of a proteoform increases.74 

Ово ширење сигнала се у великој мери може приписати омотачу стања наелектрисања и изотопској дистрибуцији сваког стања наелектрисања. Специфична за нашу експерименталну поставку била је употреба филтера величине 3К МВЦО као завршног корака филтрације у нашој припреми узорка, који је у овом случају изабран да осигура да се мањи амилоидни бета протеоформи могу ефикасно ухватити ако су присутни.

Општи инструментални фактори такође могу да створе пристрасност малих протеоформа, укључујући подешавање квадрупола, електродинамичко хватање и сударе са заосталим молекулима гаса у ћелији Орбитрап који доводе до бржег распада транзијента за веће молекуле.75 Без обзира на ове пристрасности или егзакторигин фрагмената, они и даље могу пружити увид у протеом.

Ови фрагменти су посебно корисни у контексту неуродегенеративних болести где су поремећаји у протеостази обично повезани са патологијом.76,77

Заиста, често се открије да су фрагменти тау неуротоксични и да играју улогу у прогресији тауопатија као што је АД.23–26 Генерално, фрагменти које посматрамо су много већи од триптичних пептида, ау неколико случајева где постоји много фрагмената за одређени протеин , примећујемо значајну покривеност секвенци.

Ово је илустровано испитивањем фрагмената који обезбеђују покривеност за ∼50 кДа тубулиналфа-1Б ланац (ТУБА1Б) и ∼70 кДа синапсин-1 (СИН1), као што је приказано на слици 9А, Б, оба велика протеини које би иначе било тешко уочити у свом облику пуне дужине у ТДП сложеног узорка.

Идентификација протеоформа од значаја за неуродегенеративну болест

Коришћење ФАИМС-а са нашом анализом одозго надоле омогућило је идентификацију неколико јединствених Свисс-Прот варијанти спајања и ТрЕМБЛ уноса, са 267 јединствених варијанти спајања и 96 ТрЕМБЛ уноса (Табела С3).

Приметно је да примећујемо више ПрСМ-ова који недвосмислено идентификују алтернативну ОРФ изоформу (А{{0}}А0Д9СФ30) за молекул адхезије неуронских ћелија1 (НЦАМ1). Такође смо приметили протеоформе изведене из гена који имају познате улоге у неколико неуродегенеративних болести, посебно -синуклеин и ПАРК7.

У оба ова случаја, доминантне протеоформе садрже секвенцу пуне дужине. Занимљиво је да већина ПрСМ-ова -синуклеина, синуклеина и (у мањој мери) -синуклеина ПрСМ садржи непознато померање масе од ∼177 Да у близини Ц-терминуса (синуклеинспектрум пуне дужине са непознатом модификацијом, као што је приказано на слици С4А) .

Ова промена масе је раније примећена у претраживањима отворене базе података и генерално се налази на Асп или Глуресидус-у.78 Потенцијално објашњење које се блиско поклапа са просечном и моноизотопском масом модификације састоји се од једног кисеоника са три атома гвожђа, као и губитка седам атома водоника ( на основу приступа Унимоду #1971).

Поређење изотопских пикова јона фрагмента аи242+ из -синуклеина (слика С4Б) са симулираним спектром који садржи горепоменуте елементе за које се верује да припадају непознатој модификацији (слика С4Ц) показује сличност између две изотопске дистрибуције, са многим изотопским пиковима који се поравнавају унутар 2 ппм један од другог.

Такође треба истаћи да су крајњи леви изотопски врхови јединствени за природне изотопе гвожђа, а одсуство ових пикова је лако очигледно када се спектар симулира без три атома гвожђа (слика С4Д), што снажно сугерише да је ова непозната модификација врло вероватно састављена од предложених елемената.

Претходне студије су такође описале висок афинитет -синуклеина за различите металне јоне, а регион за који примећујемо да садржи ову модификацију преклапа се са остацима за које се зна да су укључени у везивање – посебно мотивом 119ДПДНЕА124 (Слика С5).79–81

Наши подаци такође сугеришу да Ц-терминални региони -синуклеина и -синуклеина имају сличне улоге у везивању метала јер су вишеструки спектри са истим непознатим померањем масе упарени са сличним секвенцама унутар ових протеина.

Што се тиче митохондријалног протеина ПАРК7, приметили смо померање масе ∼116.0 Да на његовом једином активном остатку Цис, Ц106 (слика С6). Једно потенцијално објашњење са сличном сукцинилацијом делта масе, модификацијом која се приписује митохондријском стресу и формира се због Мицхаеловог додавања фумарата на Цис тиол групу.82

For more information:1950477648nn@gmail.com