Дисрегулација РНК преносивих елемената у мутантним КРАС(Г12Ц) 3Д сфероидима рака плућа
Oct 27, 2023
АПСТРАКТАН
Мутантни КРАС регулише експресију РНК преносивих елемената (ТЕ) и интерфероном стимулисаног гена (ИСГ), али остаје нејасно да ли различите мутације у КРАС утичу на различите ТЕ РНК у целом геному. Анализирали смо транскриптоме 3Д сфероида рака плућа код људи који садрже КРАС (Г12Ц) мутације да бисмо одредили пејзаж ТЕ РНК регулисаних мутантним КРАС (Г12Ц). Открили смо да је КРАС (Г12Ц) сигнализација потребна за експресију ТЕ РНК добијених из ЛИНЕ и ЛТР које се разликују од ТЕ РНК за које је раније показано да су регулисане мутантним КРАС (Г12Д) или КРАС (Г12В). Штавише, КРАС (Г12Ц) инхибиција специфично регулише ТЕ РНК изведене из СИНЕ из најмлађе Алу подфамилије АлуИ. Наши резултати откривају да је дисрегулација ТЕ РНК у ћелијама рака плућа изазвана КРАС-ом зависна од мутације, док такође наглашавају подскуп младих ТЕ РНК добијених од Алу-а који се координирано активирају са генима урођеног имунитета након инхибиције КРАС(Г12Ц).
Предности цистанцхе тубулоса-Антитумор
УВОД
РНК транспозибилног елемента (ТЕ) су стално дисрегулисане у контексту рака 1. У мутантним КРАС ћелијама рака плућа, КРАБ цинк-прсти (КЗНФ) гени су у великој мери смањени, што доводи до аберантне регулације ТЕ РНК добијених из ЛИНЕ, СИНЕ и ЛТР елементи 2,3. Поред ТЕ РНК, дуге некодирајуће РНК (лнцРНА) су такође координирано регулисане са РАС сигналним генима 4, а њихови обрасци експресије су на сличан начин промењени код многих карцинома 5-8. За ТЕ РНК, њихова појачана регулација код рака изазива стање вирусне мимикрије, што доводи до унутрашње активације гена урођеног имунитета као што су гени стимулисани интерфероном (ИСГ) 3,9,10. Конкретно, Алу породица СИНЕ је доминантан извор имуногених ТЕ РНК 11, које су индуковане епигенетским променама изазваним инхибиторима ДНК метилтрансферазе (ДНМТи) или мутантном КРАС-посредованом инхибицијом КЗНФ 3,9,10.
Да бисмо истражили како уобичајена мутација у КРАС утиче на пејзаж ТЕ РНК у ћелијама рака плућа, окарактерисали смо транскриптоме 3Д сфероида рака плућа који садрже КРАС(Г12Ц) мутације у присуству или одсуству мутантног КРАС(Г12Ц) инхибитора 12. Показали смо да је КРАС(Г12Ц) сигнализација потребна за експресију ЛИНЕ и ЛТР изведених ТЕ РНК, док инхибиција КРАС(Г12Ц) специфично регулише и ТЕ РНК изведене из СИНЕ и подскуп гена повезаних са интерфероном (ИФН). Наши налази откривају сложену интеракцију између мутантне КРАС сигнализације и ТЕ дисрегулације у ћелијама рака плућа, где се дефинисани скуп младих АлуИ елемената повећава на начин који зависи од мутације.
Предности цистанцхе тубулоса-Антитумор
РЕЗУЛТАТИ
КРАС(Г12Ц) инхибиција мења кодирајући и некодирајући транскриптом
Да бисмо утврдили како онкогена КРАС (Г12Ц) сигнализација регулише кодирајући и некодирајући транскриптом, извршили смо секвенцирање РНК (РНА-сек) на 3Д мутантним КРАС (Г12Ц) сфероидима рака плућа. За РНА-сек, користили смо протокол пуне дужине са 5' јединственим молекуларним идентификаторима (УМИ) да бисмо омогућили прецизно бројање РНК уз ублажавање пристрасности ПЦР амплификације 13 (Слика 1А). Упоредили смо транскриптоме сфероида рака плућа Х358 третираних КРАС(Г12Ц) инхибитором АРС-1620 (АРС) са контролним сфероидима (третираним ДМСО) (слика С1А) и видели да третман АРС значајно смањује нивое фосфорилисаног ЕРК (п-ЕРК) (Слика С1Б), што указује да третман АРС инхибира низводно КРАС (Г12Ц) сигнализацију. Потискивање КРАС(Г12Ц) сигнализације третманом АРС такође је доказано смањењем величине сфероида и виталности ћелије (Слике С1Ц и С1Д).
На нивоу РНК, проценили смо релативну количину различитих биотипова и ТЕ суперфамилија у 3Д сфероидима рака плућа третираним са АРС или ДМСО, што је открило динамичке промене у саставу ТЕ РНК након инхибиције КРАС (Г12Ц) (слика 1Б). Док смо открили само 32% гена који кодирају протеине означене ГЕНЦОДЕ-ом и 15% гена лнцРНА, 92-96% ТЕ суперфамилија (92% ЛТР, 95% СИНЕ, 96% ЛИНЕ) је било представљено у нашим УМИ означеним РНА-сек подаци, који откривају широку дисрегулацију ТЕ РНК у транскриптому вођеном КРАС(Г12Ц). До четвртине свих откривених РНК молекула у сфероидима рака плућа третираних АРС-ом изведено је из ТЕ, што указује да ТЕ РНК представљају значајан део транскрипционог излаза мутантних КРАС(Г12Ц) ћелија рака плућа.
цистанцхе користи за мушкарце - јача имуни систем
Кликните овде да видите производе Цистанцхе Енханце Иммунити
【Затражите више】 Е-пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Вхатс Апп: 0086 18599088692 / Вецхат: 18599088692
Затим смо одредили значајно различито експримиране гене између 3Д сфероида рака плућа третираних АРС-ом и ДМСО-ом да бисмо идентификовали биолошке процесе који су регулисани онкогеном КРАС(Г12Ц) сигнализацијом. Сфероиди рака плућа са интактном КРАС (Г12Ц) сигнализацијом су значајно обогаћени за гене укључене у Г2М контролну тачку, Е2Ф мете, МИЦ циљеве и митотичко вретено (Слика 1Ц). Међутим, након инхибиције КРАС(Г12Ц), сфероиди рака плућа су испољили значајно више нивое гена укључених у оксидациону фосфорилацију, комплемент и ИФН алфа и гама одговоре (слика 1Ц), пружајући додатне доказе за учешће КРАС сигнализације у регулацији гена везаних за ИФН 2,3.
КРАС(Г12Ц) инхибиција координира индукује ИСГ и младе АлуИ елементе
Да бисмо даље разјаснили интринзичну регулацију ИСГ-а након инхибиције КРАС (Г12Ц), идентификовали смо који гени и ТЕ су значајно различито експримирани у сваком скупу гена и ТЕ суперфамилији, респективно. У оба гена за ИФН алфа и ИФН гама одговор, најјаче индуковани ген након инхибиције КРАС(Г12Ц) у сфероидима рака плућа био је РТП4 (слика 2А), протеин транспортер рецептора који негативно регулише ТБК1 сигнализацију 14. Поред тога, комплекс МХЦ класе И ген бета-2-микроглобулин (Б2М), који се рекурентно инактивира код карцинома плућа 15, такође је значајно повећан у оба сета гена повезаних са ИФН у сфероидима рака плућа третираним АРС (Слика 2А).
С обзиром на директну улогу онкогене КРАС сигнализације у регулацији 3 ТЕ РНК, истражили смо које подфамилије ТЕ РНК зависе од мутантног КРАС (Г12Ц). У сфероидима рака плућа са интактном КРАС (Г12Ц) сигнализацијом, открили смо да су ЛИНЕ потфамилије Л1М6Б и Л1ПА12 биле високо изражене и зависне од КРАС (Г12Ц), о чему сведочи њихова смањена регулација у сфероидима рака плућа леченим АРС (Слика 2Б). Штавише, док је само једна ДНК подфамилија МЕР44Д зависила од КРАС(Г12Ц) сигнализације, преко десетак ЛТР подфамилија је регулисано мутантним КРАС(Г12Ц), укључујући МЛТ1А0-инт, ЛТР51, МЕР50Б и ЛТР1Б0 (Слика 2Б). Насупрот томе, све подфамилије СИНЕ су биле значајно повећане након инхибиције КРАС (Г12Ц) и координирано индуковане специфичним ИСГ генима (слика 2А) у сфероидима рака плућа. Све ове СИНЕ ТЕ РНК су изведене из подфамилије АлуИ (слика 2Б), што указује да инхибиција КРАС (Г12Ц) дисрегулише специфичну подскупину младих АлуИ елемената.
КРАС(Г12Ц) инхибиција смањује дуге некодирајуће РНК
Да бисмо даље разјаснили ефекте инхибиције КРАС (Г12Ц) на транскриптом, испитали смо све значајно различито експримиране лнцРНА у сфероидима рака плућа третираним АРС или ДМСО контролом. Открили смо да је велики број лнцРНА зависио од КРАС (Г12Ц) сигнализације за њихову експресију, јер су многе од ових лнцРНА биле значајно смањене након инхибиције КРАС (Г12Ц) (Слика 3А). Три од ових смањених лнцРНА, АЦ114546.3, НЦМАП-ДТ и АЦ073575.2, немају познате функције, али се преклапају у антисенс оријентацији на кодирајуће гене ЗНФ770, РЦАН3 и ЕРП29, респективно. Као класа некодирајуће РНК, приметили смо широку регулацију лнцРНА након третмана АРС код сфероида рака плућа (слика 3Б), што указује да многе лнцРНА зависе од КРАС (Г12Ц) сигнализације за њихову експресију.
цистанцхе користи за мушкарце - јача имуни систем
ДИСКУСИЈА
Овде показујемо да је онкогена КРАС (Г12Ц) сигнализација потребна за експресију специфичних ТЕ суперфамилија, наиме ЛИНЕ и ЛТР елемената, као и подскупа лнцРНА, што даље показује како РАС сигнализација регулише некодирајући транскриптом 2-4. Такође смо користили 3Д модел сфероида рака плућа за наше експерименте са КРАС(Г12Ц) инхибитором јер се показало да 3Д модели верније рекапитулирају ин виво одговор на лекове у поређењу са 2Д моделима културе 16. Штавише, наша примена пуне базираног на УМИ Техника РНА-сек дужине 13 нам је омогућила да прецизније ухватимо састав и динамику ТЕ РНК у нашим сфероидима рака плућа уклањањем ПЦР дупликата у нашим подацима о секвенци РНА.
Наши налази су у складу са претходним студијама инхибиције КРАС(Г12Ц), где су гени ИФН алфа и гама одговора били појачано регулисани у ћелијама рака плућа Х358 третираним АРС 17. На основу познатих имуногених својстава РНК добијених од Алу 11, наши резултати сугеришу да специфична регулација младих АлуИ елемената након инхибиције КРАС(Г12Ц) је барем делимично одговорна за снажну регулацију ИСГ-а у сфероидима рака плућа третираних АРС. Приметно је да значајно обогаћивање гена повезаних са ИФН-ом као одговор на третман инхибиторима КРАС(Г12Ц) не укључује даљу регулацију ИСГ сензора РНА као што су МДА-5, РИГ-И или ПКР, који у почетку постају појачано регулисани у ћелије плућа као одговор на онкогену КРАС сигнализацију 2,3.
Раније смо показали да је само мутантна КРАС сигнализација довољна да изазове регулацију ТЕ РНК у људским плућним ћелијама које су трансформисане ин витро 2,3, а наши резултати описани овде проширују ова запажања на ћелије рака плућа са различитом активирајућом мутацијом КРАС. Мутације КРАС (Г12Д) или КРАС (Г12В) обе изазивају значајну регулацију подфамилије ЛТР12Ц у трансформисаним ћелијама плућа 3, али нисмо видели значајно обогаћивање ТЕ РНК добијених из ЛТР12Ц у нашим КРАС (Г12Ц) сфероидима рака плућа. Уместо тога, видели смо повећање регулације ЛТР51, ЛТР1Б0, ЛТР14Б и ЛТР28Б, што сугерише да различите мутације појачања функције у КРАС-у регулишу различите аспекте ТЕ РНК транскриптома.
Наш рад пружа свеобухватну процену како некодирајући/ТЕ РНК транскриптом динамички реагује на КРАС(Г12Ц) инхибицију. Будуће студије могу пружити нове увиде у потенцијалну улогу некодирајућих/ТЕ РНК у механизмима резистенције на инхибиторе КРАС(Г12Ц). Штавише, ТЕ РНК које се луче из ћелија рака након инхибиције КРАС-а могу послужити као екстрацелуларни РНК биомаркери 2,3,5,18,19 одговора и/или резистенције на терапије инхибиторима КРАС 20.
МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДЕ
Ћелијске линије
Ћелијске линије рака плућа Х358 које садрже КРАС(Г12Ц) мутацију су култивисане у медијуму РПМИ 1640 (Инвитроген) са додатком 10% феталног говеђег серума (Сигма) на 37 степени, 5% ЦО2 у влажном инкубатору. Све ћелијске линије су биле негативне на микоплазму. Ћелијске линије су купљене од Америцан Типе Цултуре Цоллецтион (АТЦЦ).
Тестови виталности ћелија
За тестове одрживости сфероида, 10000 ћелија/бунарићу је засејано у плоче са округлим дном 96-бунарића ниске адхезије и инкубирано на 37 степени, 5% ЦО2 током 24 сата. Затим је ћелијама додат серијски разблажен АРС- 1620 или ДМСО, а плоче су инкубиране у стандардним условима културе 72 сата, са свежим АРС и ДМСО медијумима који су се свакодневно мењали. Вијабилност ћелија је мерена коришћењем Целл Титер-Гло® Луминесцент Целл Виабилити Ассаи кита (Промега) у складу са протоколом произвођача. Сигнал луминисценције узорака третираних АРС је нормализован на ДМСО контролу. Луминесценција је мерена на СпецтраМак иД3 молекуларном уређају.
изолација РНК
Укупна маса РНК је изолована из приближно 100 Х358 сфероида (по стању) коришћењем Куицк-РНА Мини-Преп комплета (Зимоген) у складу са протоколом произвођача. РНК је квантификована помоћу НаноДроп-8000 спектрофотометра.
Припрема библиотеке РНА-сек
Прилагођени Смарт-сек3 протокол 13 је коришћен за генерисање РНА-сек библиотека из укупне РНК за бројање и процену РНК молекула пуне дужине. Укратко, 10 нг укупне РНК је реверзно транскрибован коришћењем олигоДТ прајмера са бар кодом (125 нМ), након чега је уследило пребацивање шаблона са олиго прекидачем са бар кодом (125 нМ). Ове олиго секвенце су служиле као прајмери за ПЦР амплификацију. Нектера ХТ кит (Иллумина) је коришћен за претварање цДНК библиотека у библиотеке за секвенцирање уз додатак прајмера специфичног за УМИ за амплификацију цДНК крајева који садрже молекуларне бар кодове као што је описано у Смарт-сек3 протоколу. цДНК и квалитет библиотеке су процењени коришћењем Агилент биоанализер ДНК чипа високе осетљивости и квантификовани коришћењем ДНК теста високе осетљивости на Кубит 3.0.
Вестерн блот
Приближно 100 Х358 сфероида (по стању) је изоловано након третмана АРС или ДМСО. Сфероиди су затим инкубирани на леду у РИПА пуферу са додатком инхибитора протеазе током 15 минута. Лизати су затим центрифугирани на 10,000 РЦФ током 10 минута. Супернатант је затим пребачен у нову епрувету за следећу припрему узорка СДС-ПАГЕ у Лаеммли пуферу, куван 5 минута на 95 Ц до коначне концентрације од 1 мг/мл. СДС ПАГЕ је изведен да би се протеин одвојио по величини, након чега је уследио трансфер на ПВДФ мембрану. Мембране су инкубиране са примарним п-ЕРК (ЦСТ) и ХСП90 (ЦСТ) антителима преко ноћи на 4 Ц. Секундарна антитела (Абцам) су затим инкубирана на 3 пута испраним ТБСТ мембранама у пуферу за блокирање за накнадно снимање.
цистанцхе користи за мушкарце - јача имуни систем
УМИ дедупликација
Упарени очитаци крајњег осветљења су исечени адаптером помоћу ФастП 21 са подразумеваним подешавањима. УМИ-ови су извучени из прочитаног и премештени у име за читање помоћу уми_алата_извода из пакета УМИ-алата 22 са шаблоном бар кода постављеним на „НННННННН“. УМИ уклоњена очитавања су поравната са ХГ38 коришћењем СТАР поравнања са скупом напомена ГЕНЦОДЕ в38. Поравнана читања су дедуплицирана помоћу „УМИ-тоолс дедуп“ са подразумеваним подешавањима.
РНА-сек анализа
Све фастк датотеке су исечене са Триммоматиц 2 (0.38) 23, а резултујуће исечене датотеке су процењене помоћу ФастКЦ 24, а затим обрађене следећим аналитичким цевоводом: Салмон (1.3.0): псеудоусклађивање РНК -сек читања обављена са Салмон 25 користећи следеће аргументе: {{1{{20}}}}валидатеМаппингс –гцБиас --секБиас --рецоверОрпханс --рангеФацторизатионБинс 4 користећи индекс креиран од ГЕНЦОДЕ верзије 35 транскриптом фаста фајла користећи секвенце мамца да би се омогућило селективно поравнање. Додатни, ТЕ-свестан индекс креиран је на сличан начин, али допуњен секвенцама генерисаним из УЦСЦ Репеат Маскер траке. ДЕСек2 (1.32.0): Салмон излаз је увезен у ДЕСек објекат коришћењем ткимпорт 26 и анализа диференцијалног израза је извршена са стандардним аргументима 27. Сви резултати су филтрирани да би имали падј < 0,05. Тамо где су коришћени подаци о броју, они су нормализовани по узорцима коришћењем ДЕСек-а.
Анализа обогаћивања генског скупа
Диференцијално изражени гени су рангирани према смањеним вредностима лог2ФолдЦханге које је генерисао ДЕСек2. Скупови гена су набављени коришћењем Р пакета мсигдбр (7.4.1) и филтрирани да садрже само скупове гена са статусом „Халлмарк“. Р пакет фгсеа (1.18.0) је коришћен за генерисање процена обогаћивања скупа гена које су филтриране до резултата са прилагођеним пвредностима < 0.05.
РЕФЕРЕНЦЕ
1. Бурнс, КХ (2017). Преносиви елементи код рака. Нат Рев Цанцер 17, 415-424. 10.1038/нрц.2017.35.
2. Реггиардо, РЕ, Мароли, СВ, Халасз, Х., Озен, М., Царрилло, Д., ЛаМонтагне, Е., Вхитехеад, Л., Ким, Е., Малик, С., Фернандес, Ј., ет ал. (2020). Епигеномско репрограмирање понављајућих некодирајућих РНК и гена стимулисаних ИФН-ом од стране мутантног КРАС-а. биоРкив, 2020.2011.2004.367771. 10.1101/2020.11.04.367771.
3. Реггиардо, РЕ, Мароли, СВ, Халасз, Х., Озен, М., Храбета-Робинсон, Е., Бехера, А., Педду, В., Царрилло, Д., ЛаМонтагне, Е., Вхитехеад, Л. ., ет ал. (2022). Мутантни КРАС регулише РНК преносивих елемената и урођени имунитет преко КРАБ гена за цинк прст. Извештаји ћелије 40. 10.1016/ј.целреп.2022.111104.
4. Ким, ДХ, Маринов, ГК, Пепке, С., Сингер, ЗС, Хе, П., Виллиамс, Б., Сцхротх, ГП, Еловитз, МБ, и Волд, БЈ (2015). Анализа транскриптома једне ћелије открива динамичке промене у експресији лнцРНА током репрограмирања. Матична ћелија ћелије 16, 88-101. 10.1016/ј.стем.2014.11.005.
5. Реггиардо, РЕ, Мароли, СВ, и Ким, ДХ (2022). ЛнцРНА биомаркери запаљења и рака. Адв Екп Мед Биол 1363, 121-145. 10.1007/978-3-030-92034-0_7.
6. Сцхмитт, АМ, анд Цханг, ХИ (2016). Дуге некодирајуће РНК у путевима рака. Ћелија рака 29, 452-463. 10.1016/ј.ццелл.2016.03.010.
7. Ринн, ЈЛ, и Цханг, ХИ (2020). Дуге некодирајуће РНК: молекуларни модалитети за функције организма. Анну Рев Биоцхем 89, 283-308. 10.1146/аннурев-биоцхем{7}}.
8. Слацк, ФЈ, и Цхиннаииан, АМ (2019). Улога некодирајућих РНК у онкологији. Ћелија 179, 1033-1055. 10.1016/ј.целл.2019.10.017.
9. Цхиаппинели, Катхерине Б., Стриссел, Памела Л., Десрицхард, А., Ли, Х., Хенке, Ц., Акман, Б., Хеин, А., Роте, Неал С., Цопе, Леслие М. , Снидер, А., ет ал. (2015). Инхибирање метилације ДНК изазива одговор интерферона код рака преко дсРНА, укључујући ендогене ретровирусе. Ћелија 162, 974-986. 10.1016/ј.целл.2015.07.011.
10. Роулоис, Д., Лоо Иау, Х., Сингханиа, Р., Ванг, И., Данесх, А., Схен, Сху И., Хан, Х., Лианг, Г., Јонес, Петер А., Пугх, Тревор Ј., ет ал. (2015). Средства за деметилацију ДНК циљају ћелије колоректалног карцинома индукујући вирусну мимикрију ендогеним транскриптима. Ћелија 162, 961-973. 10.1016/ј.целл.2015.07.056.
11. Мехдипур, П., Мархон, СА, Еттаиеби, И., Цхакравартхи, А., Хоссеини, А., Ванг, И., де Цастро, ФА, Лоо Иау, Х., Исхак, Ц., Абелсон, С ., ет ал. (2020). Епигенетска терапија индукује транскрипцију инвертованих СИНЕ-ова и зависности од АДАР1. Природа 588, 169-173. 10,1038/с41586-020-2844-1.
12. Острем, ЈМ, Петерс, У., Сос, МЛ, Веллс, ЈА, и Схокат, КМ (2013). К-Рас(Г12Ц) инхибитори алостерички контролишу ГТП афинитет и ефекторске интеракције. Природа 503, 548- 551. 10.1038/натуре12796.
13. Хагеманн-Јенсен, М., Зиегенхаин, Ц., Цхен, П., Рамсколд, Д., Хендрикс, ГЈ, Ларссон, АЈМ, Фаридани, ОР, и Сандберг, Р. (2020). Бројање РНК једне ћелије у резолуцији алела и изоформе помоћу Смарт-сек3. Нат Биотецхнол 38, 708-714. 10,1038/с41587-020- 0497-0.
14. Хе, Кс., Асхброок, АВ, Ду, И., Ву, Ј., Хоффманн, ХХ, Зханг, Ц., Ксиа, Л., Пенг, ИЦ, Тумас, КЦ, Сингх, БК, ет ал. (2020). РТП4 инхибира ИФН-И одговор и појачава експерименталну церебралну маларију и неуропатологију. Проц Натл Ацад Сци УСА 117, 19465- 19474. 10.1073/пнас.2006492117.
15. Переира, Ц., Гименез-Ксавиер, П., Прос, Е., Пајарес, МЈ, Моро, М., Гомез, А., Наварро, А., Цондом, Е., Моран, С., Гомез- Лопез, Г., ет ал. (2017). Геномско профилисање ксенотрансплантата добијених од пацијената за рак плућа идентификује Б2М инактивацију која нарушава имунопрепознавање. Цлин Цанцер Рес 23, 3203-3213. 10.1158/1078-0432.ЦЦР-16-1946.
16. Сен, Ц., Фреунд, Д., и Гомпертс, БН (2022). Тродимензионални модели плућа: прошлост, садашњост и будућност: мини преглед. Биоцхем Соц Транс 50, 1045-1056. 10.1042/БСТ20190569. 17. Мугарза, Е., ван Малдегем, Ф., Боумелха, Ј., Мооре, Ц., Рана, С., Ллориан Сопена, М., Еаст, П., Амблер, Р., Анастасиоу, П., Ромеро -Цлавијо, П., ет ал. (2022). Терапеутска инхибиција КРАС(Г12Ц) покреће ефикасан антитуморски имунитет посредован интерфероном код имуногених карцинома плућа. Сци Адв 8, еабм8780. 10.1126/сциадв.абм8780.
18. Хојах, Р., Реггиардо, РЕ, Озен, М., Мароли, СВ, Царрилло, Д., Демирци, У., анд Ким, ДХ (2022). Екстрацелуларни РНК потписи мутантних КРАС (Г12Ц) ћелија аденокарцинома плућа. биоРкив, 2022.2002.2023.481574. 10.1101/2022.02.23.481574.
19. Ванг, Ј., Ма, П., Ким, ДХ, Лиу, БФ, и Демирци, У. (2021). Ка изолацији и детекцији егзозома заснованој на микрофлуидима за терапију тумора. Нано Данас 37. 10.1016/ј.нантод.2020.101066.
20. Мооре, АР, Росенберг, СЦ, МцЦормицк, Ф., анд Малек, С. (2021). РАС-циљане терапије. Нат Рев Друг Дисцов. 10,1038/с41573-021-00220-6.
21. Цхен, С., Зхоу, И., Цхен, И., анд Гу, Ј. (2018). фастп: ултра-брз све-у-једном ФАСТК предпроцесор. Биоинформатика 34, и884-и890. 10.1093/биоинформатицс/бти560.
22. Смитх, Т., Хегер, А., анд Судбери, И. (2017). УМИ алати: моделирање грешака секвенцирања у јединственим молекуларним идентификаторима ради побољшања тачности квантификације. Геном Рес 27, 491- 499. 10.1101/гр.209601.116.
23. Болгер, АМ, Лохсе, М., и Усадел, Б. (2014). Триммоматиц: флексибилни тример за Иллумина секвенце података. Биоинформатика 30, 2114-2120. 10.1093/биоинформатицс/бту170.
24. Бровн, Ј., Пиррунг, М., анд МцЦуе, ЛА (2017). ФКЦ контролна табла: интегрише ФастКЦ резултате у веб-базирани, интерактивни и прошириви ФАСТК алат за контролу квалитета. Биоинформатика. 10.1093/биоинформатицс/бтк373.
25. Патро, Р., Дуггал, Г., Лове, МИ, Иризарри, РА, и Кингсфорд, Ц. (2017). Лосос обезбеђује брзу квантификацију експресије транскрипта са свесном пристрасношћу. Нат методе 14, 417-419. 10.1038/нметх.4197.
26. Сонесон, Ц., Лове, МИ и Робинсон, МД (2015). Диференцијалне анализе за РНА-сек: процене на нивоу транскрипта побољшавају закључке на нивоу гена. Ф1000Рес 4, 1521. 10.12688/ф1000ресеарцх.7563.2.
27. Лове, МИ, Хубер, В. и Андерс, С. (2014). Умерена процена промене набора и дисперзије за РНА-сек податке са ДЕСек2. Геном Биол 15, 550. 10.1186/с13059-014- 0550-8.
ЗАХВАЛНИЦЕ
Захваљујемо се члановима Ким Лаб-а на корисним дискусијама. Овај рад је подржан средствима Баскин Сцхоол оф Енгинееринг (до ДХК). ДЦ је подржан од стране Предокторске стипендије Програма за истраживање болести повезаних са дуваном (Т30ДТ0997), РЕР је подржан од стране Ф99/К00 НИДДК КУХ Предокторске награде за прелазак на постдокторске сараднике Националног института за здравље (1Ф99ДК{ {7}}), а потпредседница је била подржана наградом за предокторску стипендију из Програма за истраживање болести повезаних са дуваном (Т32ДТ4904).
ПРИЛОЗИ АУТОРА
ДХК је конципирао истраживање, ДЦ и ДХК су дизајнирали истраживање, ДЦ, ЈЛ и ГМ су извели експерименте, РЕР и ВП су анализирали податке, а ДЦ и ДХК су написали рад уз доприносе аутора.
ФИГУРЕС
Слика 1. КРАС(Г12Ц) инхибиција мења кодирајући и некодирајући транскриптом А. Шема експеримента. Б. Дистрибуција броја додељених ГЕНЦОДЕ кодирајућим, лнцРНА и ТЕ/понављајућим суперфамилијама у АРС-третираним (арс) или ДМСО-третираним (дмсо) сфероидним РНА-сек библиотекама рака плућа, где свака колона представља биолошку реплику. Ц. Резултати анализе значајног обогаћивања генског скупа примећени код сфероида карцинома плућа третираних ДМСО (десно, позитиван НЕС) или АРС (лево, негативан НЕС) коришћењем диференцијално експримираних гена рангираних према нормализованом резултату обогаћивања (НЕС).
Слика 2. КРАС(Г12Ц) инхибиција координира индукује ИСГ и младе АлуИ елементе
А. Вулкански дијаграми који приказују значајну диференцијалну експресију уочену у кључним скуповима гена између сфероида рака плућа третираних ДМСО (десно, позитивна промена набора) или АРС третираних (лева, негативна промена набора). Б. Вулкански дијаграми који приказују значајну диференцијалну експресију уочену у ТЕ суперфамилијама између сфероида рака плућа третираних ДМСО (десна, позитивна промена) или АРС третираних (лево, негативна промена набора).
Слика 3. Инхибиција КРАС(Г12Ц) смањује регулацију дугих некодирајућих РНК
А. Вулкански дијаграм значајне диференцијалне експресије РНК које кодирају протеин ГЕНЦОДЕ и лнцРНА између сфероида рака плућа третираних ДМСО (десно, позитивна промена набора) или АРС третираних (лево, негативна промена набора). Б. Бокс дијаграм значајне диференцијалне експресије РНК које кодирају протеин ГЕНЦОДЕ и лнцРНА између ДМСО третираних (горња, позитивна промена набора) или АРС третираних (доња, негативна промена набора) сфероида рака плућа (Вилцокон).
ДОДАТНА ФИГУРА
Слика С1.
А. Х358 3Д сфероиди рака плућа лечени АРС или ДМСО. Б. Вестерн блот за п-ЕРК и ХСП90 коришћењем Х358 3Д сфероида рака плућа третираних АРС или ДМСО. Ц. Мерење пречника (у микрометрима) (лева графика) и виталност ћелије (виабилност ћелије Титер-Гло® луминисцентне ћелије у релативним јединицама флуоресценције) (десна графика) Х358 3Д сфероида рака плућа лечених АРС или ДМСО после 3 или 5 дана третмана (500 нМ АРС-1620 или ДМСО). Д. Мерење пречника (у микрометрима) Х358 3Д сфероида рака плућа третираних различитим концентрацијама АРС-1620 (нМ) током 7 дана.
