ТУНЕЛ тест: моћан алат за процену повреде бубрега

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Апстрактан:Терминал деоксинуклеотидил трансферазе дУТП ницк-енд обележавање (ТУНЕЛ) тест је дуго успостављен тест који се користи за откривање фрагментације ДНК повезане са ћелијском смрћу (3'-ОХ ДНК термини) помоћу ендонуклеаза. Пошто су ови ензими посебно активни у бубрезима, ТУНЕЛ се широко користи за идентификацију и квантификацију фрагментације ДНК и ћелијске смрти у култивисанимбубрега ћелије и бубрези животиња и људи који настају изтоксичне или хипоксичне повреде. Рана карактеризација ТУНЕЛ-а као апоптотичког есеја довела је до бројних погрешних тумачења механизамаћелија бубрега повреда.Ипак, ТУНЕЛ постаје све популарнији заповреда бубрегапроцену јер се може универзално користити у култивисаним и ткивним ћелијама и за све механизме ћелијске смрти. Штавише, осетљив је, тачан, квантитативан, лако се повезује са одређеним ћелијама или деловима ткива и може се комбиновати са имунохистохемијом да би се омогућила поуздана идентификација типова ћелија или вероватних механизама ћелијске смрти. Традиционално, ТУНЕЛ анализа је ограничена на присуство или одсуство ТУНЕЛ сигнала. Међутим, додатне информације о механизму ћелијске смрти могу се добити анализом ТУНЕЛ образаца.

лечење поремећаја бубрега код сексуалног узбуђења са прахом додатка цистанцхе

Увод ДНК је једини молекул у ћелији који се може поправити, али се не може у потпуности поново синтетизовати након оштећења. Уништавање ДНК је једна од завршних фаза процеса смрти ћелије у више корака, који је потенцијално реверзибилан до тачке терминалне фрагментације ДНК. Дакле, ово друго је уобичајен атрибут и механистички маркер иреверзибилне ћелијске смрти [1,2]. Фрагментација ДНК повезана са смрћу ћелије се обично „визуализује“ тестом терминалног деоксинуклеотидил трансферазе дУТП ницк-енд обележавања (ТУНЕЛ), ДНК лествицом или тестом комета [3]. Електрофореза у пулсном пољу [4] и есеј рандом олигонуклеотид-примед синтхесис (РОПС) [5] су још два ретко коришћена секундарна теста. Употреба кометног теста ограничена је само на ин витро (култивисане ћелије), а његова квантификација је радно интензивна [6]. Извођење кометних тестова у изолованим ћелијским језгрима је могуће, али је повезано са додатним збуњујућим факторима током изолације језгара. Други, ДНК ладеринг тест, није квантитативна метода, а почетна нада да ће лествица узорака од размаза направити разлику између апоптозе и некрозе, респективно, распршена је пошто се овај приступ показао непоуздан [7]. Од три главне методе, ТУНЕЛ је најосетљивији, најмање дуготрајан и најуниверзалније применљив. Може се користити у култивисаним ћелијама и ткивима и за све механизме ћелијске смрти. Тачан је, квантитативан, лако се повезује са одређеним ћелијама или одељцима ткива и може се комбиновати са имунохистохемијом како би се омогућила поуздана идентификација типова ћелија или механизама оштећења ћелија повезаних са ТУНЕЛ-позитивним сигналима [2].

Прекиди ДНК мерљиви помоћу ТУНЕЛ-а производе се углавном апоптотичким ендонуклеазама. Најактивније ендонуклеазе у бубрегу су деоксирибонуклеаза 1 (ДНаза И) и ендонуклеаза Г (ЕндоГ) [8–10]. ДНаза И је најактивнија и најзаступљенија апоптотичка ендонуклеаза код сисара [11]. Бубрези, пљувачне жлезде, панкреас и црева су органи за које се зна да производе велике количине ДНазе И. Епителне ћелије у пљувачним жлездама, панкреасу и цревима луче ДНазу И као дигестивни ензим у пробавном тракту. Нека ћелијска ДНаза И се бори против "стране" ДНК која напада ћелије домаћина [12]. Не-секретована ДНаза И представља скривену опасност за ДНК ћелије домаћина, али ДНазе нормално не делују на ДНК ћелије домаћина све до повреде или смрти ћелије. У бубрезима, ДНазу И луче тубуларне епителне ћелије, вероватно да би уништиле вирусе и бактерије у урину. Ова функција се вероватно одвија заједно са протеиназама, посебно меприном, који је главна протеиназа у урину [13]. Иако штити од инфекције, присуство високо активне ДНазе у бубрезима чини овај орган рањивим на повреде, где је познато да је активност ДНазе цитотоксична за ћелије домаћина. ДНазе промовишу ћелијску смрт изазвану токсичним или хипоксичним стимулусима и уништавају све ДНК ћелије бубрега домаћина ослобођене као резултат ћелијске смрти.

Бубрезису органи за филтрирање који уклањају токсична једињења из тела. Висока активност ДНазе И у бубрезима чини ћелије бубрега веома осетљивим на повреде од токсичних једињења и њихових метаболичких производа. Ово чини ТУНЕЛ најприкладнијим и најприменљивијим методом за мерење повреде бубрега. У овом прегледу ћемо се фокусирати на ТУНЕЛ као широко коришћен, информативан и прецизан тест за мерење ћелијске смрти и повреде ткива у бубрегу. Разговараћемо о аспектима ТУНЕЛ-а који се примењује на бубрежне болести и повреде и идентификовати квалитете, технике и недовољно коришћене карактеристике ТУНЕЛ-а да бисмо промовисали продуктивну и одговарајућу употребу овог моћног теста у истраживању, дијагностици и терапији болести бубрега. Такође ћемо разговарати о различитим ТУНЕЛ узорцима слика који се могу повезати са механизмима смрти ћелије. Тачке изнете у овом прегледу су широко применљиве за употребу ТУНЕЛ-а у другим органима осим бубрега.

Кључне речи:ТУНЕЛ; смрт ћелије; бубрег; ДНазе; ендонуклеазе; повреда ткива

ТУНЕЛ ПринциплесТУНЕЛ тест су развили 1992. године Горцзица ет ал. [14] и Гавриели ет ал. [15], користећи обележавање флуорохромом и авидин-пероксидазом, респективно. У то време, постојала је очајничка потреба за новим методама за процену апоптозе, и ТУНЕЛ је успешно попунио ову празнину. Првобитно пласиран на тржиште као тест за прекиде ланца ДНК током или у вези са апоптозом [14,16], у недостатку бољих тестова, ТУНЕЛ је брзо постао стандардни тест за апоптозу [17,18]. Међутим, истраживачи су скоро одмах препознали да ТУНЕЛ неселективно мери било какву фрагментацију ДНК, а не само ону повезану са апоптозом [19–21]. Ипак, потреба за апоптотичким тестовима била је толика да су ретки извештаји да је ТУНЕЛ неспецифичан за апоптозу углавном игнорисани. Ово је довело до огромне количине лажно позитивних извештаја о апоптози у бубрезима и другим органима, до степена где је до 20 процената укупних ћелија пријављено као апоптотично чак и без повреда [22–25] када се промене као мали као 0,01 проценат могао би бити статистички значајан доказ повреде ткива.

ТУНЕЛ тест је доживео ренесансу последњих година од краја бума студија апоптозе пре неколико година. Наша ПубМед претрага чланака у часописима који укључују термине „бубрег“ и „ТУНЕЛ“ дала је преко 1500 резултата од 1992. до 2020. У 2019. објављено је 170 чланака, највећи број у једној години у последњих 28 година (Слика С1) и који чине већину чланака анкетираних за ову рецензију. Бројне студије су користиле ТУНЕЛ-позитивност као универзалну меру ћелијске смрти повезане са фрагментацијом ДНК у другим типовима ћелијске смрти осим апоптозе. На пример, фероптоза, новооткривени облик програмиране, не-апоптотске ћелијске смрти изазване оксидативним оштећењем које се јавља током бубрежне исхемије-реперфузије (ИР) код мишева, може се открити помоћу ТУНЕЛ-а [26]. Показало се да је пироптоза, која је инфламаторни облик програмиране ћелијске смрти, која се разликује од апоптозе и некрозе, повезана са ТУНЕЛ-позитивним сигналима [27,28]. ТУНЕЛ-позитивност је примећена током некроптозе која је допринела прогресивном исцрпљивању ћелија бубрежних тубула код пацова подвргнутих субтоталној нефректомији [29]. У бубрезима и другим ткивима, позитивни ТУНЕЛ сигнали су пронађени у некрози [30,31], дисрегулисаној аутофагији [32–35], аноикису [36,37], митотичкој катастрофи [35,38], аутолизи [39], аутолизи [39], проптоза [40] и апонеуроза [30], показујући да је ТУНЕЛ заиста универзални тест за иреверзибилну ћелијску смрт.

ТУНЕЛ тест се заснива на обележавању 3'ОХ крајева помоћу ензима ДНК који је специфичан за 3'ОХ крај, терминалне деоксинуклеотидил трансферазе (ТдТ) (слика). Употреба ДНК полимеразе или ДНК полимеразе Кленов фрагмента уместо ТдТ може помоћи у одређивању типа 3'ОХ крајева (урези, празнине или превисоки олигос) јер ДНК полимеразама је потребан шаблон (супротан ДНК ланац) и стога неће означити висећи или истурени крајеви ДНК. Важно је запамтити да производња крајева 3ЗОХ ДНК није јединствена за апоптотичке (деградирајуће ДНК) ендонуклеазе. 3'ОХ ДНК крајеви су главни сигнал "комуникатора", заједнички именитељ већине ДНК ензима. Производе их и користе скоро сви ДНК ензими код еукариота, укључујући ендонуклеазе за поправку ДНК (апуринске/апиримидинске, АП), егзонуклеазе, ДНК полимеразе, ДНК лигазе, ДНК трансферазе и топоизомеразе. Поред тога, 3'Ид 3з-шећер, или 3з-протеин коњугати могу да се конвертују у 3'ОХ терминале помоћу фосфатаза, гликозилазе и протеиназа, респективно. Због тога је за успешну примену ТУНЕЛ-а и интерпретацију његових резултата неопходно прецизно разумевање онога што се мери.

У поређењу са две друге примарне методе мерења фрагментације ДНК, тестом ДНК лествице и кометом, ТУНЕЛ има предност што се заснива на идентификацији завршетака ДНК, а не на фрагментима (слика 2). Теоретски, ТУНЕЛ би требало да буде осетљивији и линеарнији за идентификацију почетне (ниске) фрагментације ДНК од ДНК лествице или комете, од којих оба имају период кашњења акумулације малих фрагмената велике покретљивости. У сваком случају, студије које комбинују ТУНЕЛ са кометом )41,42] или ДНК лествицом [43,44] имају одређену предност у хватању ране фрагментације ДНК са максималном осетљивошћу.

ТУНЕЛ апликацијеТУНЕЛ се користи за идентификацију и квантификацију оштећења бубрега у клиничким и основним токсиколошким студијама у различитим применама, укључујући медицинске третмане [45], еколошке [46], пољопривредне [41] и индустријске [47] изложености и животињске [48] ] и науке о храни [49]. ТУНЕЛ је применљив на све типове ћелија, органе и врсте које имају ДНК и ДНазе, што укључује скоро све врсте. ТУНЕЛ се користи за идентификацију и квантификацију оштећења бубрега код широког спектра животиња, укључујући зебрицу [50], јапанску пиринчану рибу [51], пилиће [48], гербиле [52], мишеве [41], пацове [45], раббит [53], мини-свиње [54] и људи [55]. Важна предност ТУНЕЛ-а је да се може користити у фиксним култивисаним ћелијама као иу фиксним ткивима. Ово обезбеђује методолошку доследност за поређење ин витро и ин виво резултата у студијама у којима се механизми могу истражити у култивисаним ћелијама бубрега, док се ин виво импликације процењују у бубрезима животиња. Може се користити и било шта између целих ћелија и ткива, укључујући култивисане ћелијске сфероиде [56] и ек виво резове бубрега [57,58].

Интензитет ТУНЕЛ-а у смислу јачине сигнала или броја ТУНЕЛ позитивних ћелија може да варира између врста у зависности од активности ДНаза. Према нашем искуству, бубрег пацова има активнију ДНазу И него бубрег миша, а јачина ТУНЕЛ-позитивног сигнала је у корелацији са овим. Када се бубрег упореди са другим органима, његов ТУНЕЛ-позитиван сигнал је веома интензиван и сличан другим органима са високом активношћу ДНазе И, као што су црева и пљувачна жлезда. На другом крају спектра, најнижа ТУНЕЛ-позитивна јачина сигнала је примећена у мозгу и ћелијама тумора/карцинома, где је експресија ДНазе И највероватније инактивирана алтернативним спајањем у кодирајућем региону [59]. ТУНЕЛ-позитиван сигнал се примећује у свим типовима ћелија у бубрегу. У просеку, тубуларни епител је оштећен чешће од гломерула, посебно код акутних повреда (слика 3А). Ово добро корелира са активношћу ДНазе И која преовладава у овим типовима ћелија. Судећи по полним и старосним разликама уоченим у нашим експериментима, Дназа И је заступљенија и активнија код мужјака него код женки и животиња средњих година у поређењу са животињама старијег или новорођенчета. Међутим, никаква јасна разлика у ТУНЕЛ-позитивности није евидентна у односу на пол или старост, вероватно зато што су истакнути или доминирају други фактори. У неким моделима бубрега (као што је исхемија-реперфузија), ДНаза И је индукована [9]; док код других није и чак може бити потиснут (на пример, код токсичности цисплатина) [10]. Показало се да се активација ендонуклеаза, ако је присутна, јавља у првих 24 х након повреде бубрега [9,60,61]. Стога није било изненађујуће да је најмање половина ТУНЕЛ апликација у истраживању бубрега у овом прегледу коришћена за акутну повреду бубрега (АКИ) јер се процена АКИ често врши у року од 24 до 72 х након повреде када су ендонуклеазе најактивније. . Листа студија АКИ је дуга и укључује токсичне, септичке, трансплантационе и хипоксичне повреде. У овом раду смо испитали моделе, типове изложености, третмане, временске оквире процене и типове ћелија на које су утицале ове студије. Испитиване студије су обухватиле акутне и мешовите акутно-хроничне облике оштећења бубрега и хроничне болести бубрега.

Да ли се повреда бубрега са ТУНЕЛ-позитивним сигналом примећује у тубулима или гломерулу зависи од врсте штетног агенса или болести. На пример, лупус нефритис код људи и оштећење наночестица никла су описани као стриктно гломеруларни ТУНЕЛ-позитивни сигнали [62,63]. С друге стране, исхемија-реперфузија и дијабетичка нефропатија изазвана стрептозотоцином код пацова су произвеле ТУНЕЛ-позитивне ћелије само у тубулима [64,65]. Проксимални тубули, Хенлеова петља, дистални тубули и колективни канали су често ТУНЕЛ-позитивни у моделима исхемије-реперфузије. ТУНЕЛ-позитивне ћелије у гломерулима и тубулима описане су код пацова који су били изложени лековима као што су циклоспорин А [66] и доксорубицин [67] или материјалима потрошачких производа као што су наночестице цинк оксида [68] и у моделу дијабетес мелитуса код пацова [ 69]. АКИ изазван септичким шоком код људи је такође био повезан са гломеруларним и тубуларним ТУНЕЛ-позитивним ћелијама [70]. задављена опструкција танког црева затворене петље изазвала је ТУНЕЛ-позитивност у бубрегу за 3х [87].

АКИ се може јавити након трансплантације и хипоксичних повреда. Одбацивање алографта код људи је обично повезано са повећањем ТУНЕЛ-позитивних ћелија [88,89]. Након хладне исхемије, ТУНЕЛ-позитивне ћелије су обично примећене у року од 2-24 х током реперфузије [90], или још уже, између 14 и 17 х након исхемије [91], а понекад смо још увек примећени чак 7 дана у одбацивање трансплантата [92]. Слично, у моделима исхемије-реперфузије, ТУНЕЛ-позитивне ћелије су најчешће примећене 24 х након реперфузије [44,93,94], или у распону између 4 [95,96] и 72 х [97]. У студијама трансплантације и исхемијског АКИ, ТУНЕЛ-позитивне ћелије су биле локализоване на дисталне и проксималне тубуларне епителне ћелије [44,93]. У мишубубрезинакон исхемијско-реперфузијске повреде, ТУНЕЛ-позитивне ћелије су описане као концентрисане у кортикомедуларном споју, уобичајеној мети исхемијске повреде [98].

Мешовите акутне и хроничне повреде, где су изложеност токсичности, стања болести и/или процене биле и акутне (тј. сати, дани) и хроничне (тј. недеље, месеци, године) у истој студији, примећене су код трансплантације људи одбацивање (биопсија од 1 недеље до 3 године након трансплантације) [88], инфекција вирусом хепатитиса Е свиња (7 и 14 дана након инокулације) [52], ЦО2 пнеумоперитонеум изазван стрес код хидронефротскогбубрези(2 недеље хидронефроза, 2 дана након пнеумоперитонеума) [53], мезангијални пролиферативни гломерулонефритис изазван змијским отровом (1 до 14 дана након ињекције) [99], унилатерална опструкција уретера (1 до 14 дана опструкције) [100], излагање уранил ацетату (од 1 до 28 дана изложености) [101], нефропатија аристохолне киселине (5 и 30-дневна изложеност) [102] и неонатална хипероксија (тестирано 1 до 60 постнаталних дана, изложена хипероксији прво 14 дана) [103]. Четрнаест дана након удара је врло уобичајена временска тачка за процену за ове врстеповреде бубрега[52,53,99,101,103]. У већини случајева ТУНЕЛ-позитивне ћелије су биле локализоване у тубулима и колективним каналима. Једини изузетак је била токсичност змијског отрова, која је првенствено оштетила гломеруле [99].

Хроничнибубрегаболест (ЦКД), дефинисана као присуствобубрегаоштећење или смањена стопа гломеруларне филтрације (ГФР) код људи дуже од 3 месеца, такође је чест предмет ТУНЕЛ процене, која може да утврди да ли је ЦКД повезана са прогресивномоштећење бубрега.Најчешће проучавана ЦКД код које се примењује ТУНЕЛ је дијабетичка нефропатија. Повреда идентификована ТУНЕЛ-позитивношћу десила се у тубулима и подоцитима [69] код пацијената са дијабетесом са почетком дијабетеса пре ТУНЕЛ тестирања у распону од 7 до 30 година [104,105] и 2 до 16 недеља након третмана стрептозотоцином код глодара [106,107]. Слична ТУНЕЛ-позитивна хистопатологија је пријављена код имуноглобулинске нефропатије А [22]. Код лупус нефритиса и мембранопролиферативног гломерулонефритиса, ТУНЕЛ-позитивност је примећена првенствено у гломерулима [62,108,109]. С друге стране, студије о безбедности лекова цисплатина [110], хлорокина [45], доксорубицина [67], финастерида [23], такролимуса [111] и леветирацетама [24] су приметиле углавном оштећење тубула. Слично томе, континуирана акутна повреда идентификована тубуларним ТУНЕЛ-позитивним ћелијама описана је у студијама нефропатије мокраћне киселине [112], недостатка метионина [48], изложености токсинима из животне средине микроцистину-ЛР [50] и кадмијуму [113] и у повезаност са индукованом калцијум-оксалатомбубрегакамење [114] и калцифицирајуће наночестице [115]. Док је идентификација прогресивног оштећења бубрега током ЦКД коришћењем ТУНЕЛ теста користан дијагностички алат, комбиновање ТУНЕЛ теста са имунохистохемијом (ИХЦ) би можда било још информативније у одређивању механизма повреде.

ТУНЕЛ Квантификације и технике колокализације

Методе ТУНЕЛ квантификације се разликују. У већини извештаја, ТУНЕЛ-позитивне ћелије/језгра се квантификују као проценат укупних ћелија/језгара [83,116,117]. Чини се да је ово права ствар, иако број ТУНЕЛ-позитивних ћелија вероватно не одговара тачно броју мртвих ћелија. Неке ћелије можда нису достигле препознатљиве нивое фрагментације ДНК, док су друге већ могле бити елиминисане макрофагима. Квантификација броја ТУНЕЛ-позитивних ћелија по квадратној јединици (мм2) се такође користи [118], али овај метод изгледа мање прецизан јер зависи од локације и садржаја типа ћелије у областима. Кортикални делови садрже углавном гломеруле, тубуле, крвне судове и медуларне зраке, док медуларни пресеци првенствено садрже Хенлеове петље, сабирне канале и крвне судове. Квантификација „по пољу“ свакако зависи од тога шта је поље [72,119], а квантификација „по делу“ је, још више, недефинисана [61,120]. Лоше идентификована мерења, као што су „хистолошки резултат“ [121], „апоптотички индекс“ [113], „стопа апоптозе“ [92], „проценат апоптозе“ [122] или проценат нетретиране контроле [123,124], изгледа да бити још мање прикладан и отежати тумачење и не може се поредити са већином студија.

Ћелијска смрт у суседним ћелијама почиње неједнако јер зависи од васкуларизације, ћелијског циклуса и других варијабли. Ово често доводи до неуједначеног ТУНЕЛ бојења ћелија у ткиву [45,96,125]. Изненађујуће, општи интензитет ТУНЕЛ-позитивног сигнала се не користи за ТУНЕЛ мерење, упркос томе што директно зависи од степена фрагментације ДНК. Ово је можда зато што се ћелије сматрају мртвима независно од интензитета ТУНЕЛ сигнала, јер ћелија не може бити "више мртва" ако је ТУНЕЛ бојење интензивније. Иако је тешко упоредити студије које користе широк спектар метода за квантификацију ТУНЕЛ резултата, количина ТУНЕЛ-позитивних ћелија код контролних животиња је обично испод 2 процента [75,99,100,116,126]. Акутна повреда је повезана са порастом ТУНЕЛ-позитивности од ~5–40× [79,126,127]. Током хроничне повреде, повећање ТУНЕЛ-позитивних ћелија је нешто ниже, ~2–20-пута, [29,43,65] у поређењу са нетретираним контролама.

Иницијални ТУНЕЛ тест заснован на бојењу диаминобензидином (ДАБ) дизајниран је за светлосну микроскопију [14,15]. Ова традиционална метода се и даље користила у две трећине студија обухваћених овим прегледом и у огромној већини студија биопсије код људи. Квантификација се врши ручним бројањем ћелија и, иако прецизна, одузима много времена. Често се квантификација уопште не користи, а резултати се приказују коришћењем слика третираних и обојених узорака као једноставног доказа да је дошло до смрти ћелије. Аутоматизација може убрзати процес квантификације [128,129]. Међутим, ДАБ се не може комбиновати са било којим другим бојењем у истом узорку, тако да ТУНЕЛ заснован на ДАБ-у може да обезбеди само број мртвих ћелија, без икакве идентификације типа ћелије (осим визуелног препознавања) или механизма ћелијске смрти.

Док се студије на људима у великој мери ослањају на ТУНЕЛ заснован на ДАБ помоћу светлосне микроскопије, отприлике половина студија на животињама користи ФЛ флуоресцентну микроскопију (слика 3). Флуоресцентни ТУНЕЛ је визуелно атрактиван, лако разумљив и има неколико великих предности. Поред прецизне квантификације идентификацијом ТУНЕЛ-позитивних језгара или средњег интензитета боје, ФЛ флуоресцентни ТУНЕЛ сигнал може бити колокализован са другим бојама за хистохемију (нпр. ДАПИ) (слика 3А) или ИХЦ (слика 3Б). У другом случају, употреба протеинских маркера може помоћи да се идентификују ТУНЕЛ-позитивни сигнали повезани са различитимбубрегапреграде или дају информацију о врсти ћелијске смрти. Нисмо могли да пронађемо ниједан пример ТУНЕЛ-а у комбинацији са двоструким бојењем ИХЦ антитела. Иако би таква комбинација била веома информативна, на пример, за идентификацију механизма ћелијске смрти у одређеним типовима ћелија, техничке потешкоће повезане са таквим бојењем могу бити веће од користи.

Идентификацијабубрегатип ћелије свакако није проблем за искусногбубрегапатолог [104]. Због тога је ретка употреба додатних маркера за идентификацију типа ћелије, на пример, коришћење ЦД31 за идентификацију ендотелних ћелија [130]. Међутим, често се користи употреба ИХЦ протеинских маркера за карактеризацију повреде ткива. Већина студија користи ТУНЕЛ-позитивност као једини доказ апоптозе. У другим студијама, признање да ТУНЕЛ-позитивност није специфична за апоптозу довело је до тога да се многи морфолошки (нпр. хематоксилин и еозин или бојење периодичном киселином-Сцхиффом), биохемијски и ИХЦ маркери комбинују са ТУНЕЛ бојењем како би се потврдила апоптоза. Најчешће коришћени маркер за апоптозу зависну од каспазе је цепана (активна) каспаза-3 коришћењем антитела које не препознаје каспазу пуне величине-3 [131,132]. И ТУНЕЛ и тестови са цепаном каспазом-3 показали су искључиво тубуларно, а не гломеруларно бојење у исхемијској реперфузији пацова [64]. Друге студије каспазе су користиле каспазу-1 [27], -9 [53], -11 [28] и -12 [75]. Остали апоптотички маркери укључивали су породицу протеина Б-ћелијског лимфома 2 (Бцл2) Бцл-2 [27], Бцл2Л1 [43], Бцл-кл [71], Бак [99], Бак [49] и Бад [43]; апоптотички рецептор Фас [52] и апоптотички рецептор-лиганд ФасЛ [66]; Форкхеад бок (ФОКС) протеински транскрипциони фактори Фок01 [133] и Фок03 [27]; и цитокром ц [53]. Запаљење је идентификовано ИХЦ фактора некрозе тумора-алфа (ТНФ) [134]; фактори раста тумора ТГФ [66] и ТГФ- 1 [135]; серин/треонин киназа 1 (СГК1) [135]; флавопротеин за пренос електрона, бета-подјединица (ЕТФ) [136]; Јанус киназа-2 (ЈАК2) [137]; претварач сигнала и активатор транскрипције 3 (СТАТ3) [137]; нуклеарни фактор капа лаког ланца појачивача активираних Б ћелија (НФ-κБ) [137] и његов инхибиторни протеин ИκБ [137]. Забубрегапроцена повреде, молекул повреде бубрега-1 (КИМ-1) [24], аквапорин-1 канал (АКП-1) [45], фактор изазван хипоксијом {{7} }алфа фактор транскрипције (ХИФ-1) ​​[103], транспортер аминокиселина типа Асц-1 (Асц-1) [121], мета рапамицина (мТОР) [131] киназе сисара , и коришћена је трансглутаминаза ИИ [89]. Оксидативна повреда бубрега проучавана је коришћењем маркера као што су 8-хидроксигуанозин (8ОХдГ) [102], липокалин повезан са неутрофилом желатиназом (НГАЛ) [102], НАД зависна деацетилаза сиртуин-1 (СИРТ1) [138] и хем оксигеназа 1 (ХО-1) [90]. Интензивно су проучаване киназе, укључујући пут ц-Јун Н-терминалне киназе (ЈНК) [101], фосфоинозитид 3-киназа/протеин киназа Б/нуклеарни фактор еритроид 2-фактор 2 транскрипције повезан са фактором 2 (ПИ3К/ Акт/Нрф2) пут [46], паннекин-1 (ПАНКС1) плазма мембрански спојни протеин [26], и митоген-активирана протеин киназа/екстрацелуларна сигнално регулисана киназа (МАПК/ЕРК) [26]. Студије апоптотичких ендонуклеаза укључивале су ДНазу активирану каспазом (ЦАД) [139], ДНазу И [108] и ЕндоГ [139], а маркери оштећења ДНК укључивали су туморски протеин п53 (п53) [99] и протеин 1 повезан са динамином (ПАРП1 ) [66]. Неке студије су такође откриле корисном процену апоптозе ендоплазматског ретикулума посредоване стресом и повреде ткива [75].

С обзиром на велики број испитаних механичких студија и предност комбиновања ТУНЕЛ-а са ИХЦ маркерима за идентификацију механизама ћелијске смрти, очекивало би се многе студије које користе колокализацију између ова два. Анализа се може извршити колокализацијом пиксел по пиксел између ТУНЕЛ-позитивних ћелија и ИХЦ маркера, средњим интензитетом ИХЦ маркера у ТУНЕЛ-позитивним областима или ТУНЕЛ-позитивним сигналом означава интензитет у областима позитивним на ИХЦ маркер. Нажалост, ова предност ТУНЕЛ-а је коришћена у само неколико студија. ТУНЕЛ-позитивне ћелије су колокализоване са цепаном каспазом-3 убубрегатубуле током токсичности ацетаминофеном код пацова [74]. Колокализација ИХЦ са ТУНЕЛ-позитивним сигналом омогућила је идентификацију ћелијске смрти мезангијалних ћелија током Хабу нефритиса [99]. У светлосној микроскопији, колокализација са механичким маркерима токсичности је урађена у серијским секцијама, како су известили Отт ет ал. [89].

ТУНЕЛ Проблеми и ограничења

Неколико потенцијалних проблема може се појавити и треба их очекивати када радите са ТУНЕЛ-ом. Један је да се 30ОХ ДНК крајеви јављају не само током ћелијске смрти као резултат деловања ендонуклеазе, већ и као нормални интермедијарни метаболит у скоро свим ензимским реакцијама са ДНК. Примарна ћелијска функција која производи 30ОХ крајеве је синтеза ДНК, у којој бројни Оказаки фрагменти могу теоретски произвести лажно позитиван ТУНЕЛ сигнал, посебно у високо осетљивим модификацијама теста. У токуповреда бубрега,Поправка ДНК такође може допринети лажним ТУНЕЛ-позитивним сигналима као резултат деловања АП ендонуклеазе. Масивна оксидативна повреда бубрега изазвана хемијском (водоник пероксид, блеомицин) или физичком (гама зрачење) повредом може повећати број 30ОХ крајева, повећавајући лажно позитивна ТУНЕЛ очитавања осим фрагментације ДНК посредоване ендонуклеазом.

Чешће и вероватније, неправилно постављени експериментални услови ТдТ реакције (време, температура, ензимска активност или кофактори) могу довести до вештачки повишене ТУНЕЛ-позитивне сигналне позадине. Иако остаје недефинисано шта се сматра нормалном базом за нетретиране узорке ткива бубрега, чини се вероватним да би око 1 проценат укупних ћелија био разуман број. Свакако, позадина од 10 процената или више је јасан доказ или некарактеристичних и нерафинисаних услова анализе или одступања од одговарајућих услова складиштења узорака.

Други проблем за очекивати је ниска активност ДНазе И у неким типовима ћелија (нпр. ендотел),бубрегакомпартменти (нпр. гломерули) или патолошка ткива (нпр. тумори). Од ових ћелија треба очекивати да покажу ниску ТУНЕЛ позитивност, не зато што су отпорне на повреде, већ зато што нема довољно активности ендонуклеазе за производњу мерљивог сигнала у ТУНЕЛ-у. Према нашем искуству, чак и промене између {{0}},01 процената и 0,1 процената ТУНЕЛ позитивних ћелија могу бити статистички значајне и коришћене као чврст доказ повреде бубрега (другог ткива).

Коначно, проблем са квантификацијом ТУНЕЛ бојења настаје када је количина фрагментације ДНК превисока, на пример, у касним фазама ћелијске смрти или у повредама високог интензитета, где преостала ДНК не може бити правилно обојена ДАПИ због растављања двострука спирала (слика 3Д). У овим случајевима, ТУНЕЛ-позитивни сигнали "висе у ваздуху", и наизглед нису повезани са језгром. Постаје одговорност патолога да их тумачи као ТУНЕЛ-позитивне ћелије, а не као артефакт. Код ТУНЕЛ-а обележеног флуоресцеином, постоји опасност од идентификовања позадинске аутофлуоресценције у ткиву као ТУНЕЛ-позитивности [140]. У овим случајевима препоручује се прелазак на ТУНЕЛ црвеног спектра [51,54].

ТУНЕЛ обрасци као извор додатних информација

Неколико ТУНЕЛ образаца може се јасно разликовати и користити за одређивање потенцијалног механизма и степена повреде (Табела 1, Слика 3). Обично, тип ТУНЕЛ узорка који садржи само језгра настаје благом повредом, док јача повреда (тј. повећана изложеност) доводи до јачег бојења и дезинтеграције језгара или ћелија. Строго апоптотички ТУНЕЛ образац је нуклеарна фрагментација као резултат формирања апоптотичких тела (Слика 3Е). Мали фрагменти ТУНЕЛ-позитивних језгара, који су вероватно апоптотска тела, примећени су у исхемијској реперфузији пацова 24-72 х [97]. Апоптотична тела су такође виђена са ТУНЕЛ обележавањем језгара у бубрежном тубуларном епителу и интерстицијуму 14 дана након исхемијско-реперфузијске повреде код пацова [141]. Повећање дозе уља лаванде смањило је ТУНЕЛ обрасце само за језгра и претворило их у ТУНЕЛ сличан некрози са цурењем у цитоплазму [94]. Ово последње је резултат уништења нуклеарног омотача услед дејства протеиназа и липаза у некрози. Цитоплазматски ТУНЕЛ (Слика 3Ф) виђен као ТУНЕЛ-позитивна цитоплазма примећен је у светлосној микроскопији у моделу рабдомиолизе у тубулима пацова [142] и у подоцитима култивисаним у присуству високе глукозе и код дијабетичке нефропатије код мишева [135]. Цитоплазматски ТУНЕЛ је такође описан у исхемијској реперфузији бубрега код мишева коришћењем ФЛ флуоресцентног ТУНЕЛ-а [98] и код исхемије-реперфузије код пацова коришћењем светлосне микроскопије [143]. Дубоко и искључиво тубулно оштећење изазвано живиним хлоридом са јаким цитоплазматским ТУНЕЛ бојењем које указује на оштећење нуклеарне мембране [60]. Ако се повреда настави или се доза штетног агенса повећа, цитоплазматски ТУНЕЛ се може претворити у "неуредну" слику распршеног ТУНЕЛ-а (Слика 3Г) који се приписује касним фазама деструкције ћелије услед некрозе и просипања ћелијске цитоплазме и остатака. На пример, и цитоплазматски и дисперговани ТУНЕЛ је примећен код мишева третираних цисплатином [71,72] и пацова [144], као и код повреде подоцита код дијабетичких пацова изазваних стрептозотоцином [145]. Дисперговани некротични ТУНЕЛ је такође примећен током нефротоксичности изазване уранил ацетатом код мишева [101]. На крају, још једна варијабла ТУНЕЛ сигнала на коју треба обратити пажњу је интензитет ТУНЕЛ-позитивних сигнала, који могу одступати од ћелије до ћелије у зависности од броја прекида (степена повреде) које свака ћелија доживљава, као што су документовале неке студије [45,96,125 ]. За моделе у којима се примећује варирајући интензитет ТУНЕЛ сигнала, препоручује се квантификација према броју ТУНЕЛ позитивних објеката и средњем интензитету бојења.

Закључци

Због високе активности апоптотичких ендонуклеаза у бубрезима, посебно ДНазе И и ЕндоГ, употреба ТУНЕЛ-а заистраживање и дијагноза бубрегаје веома информативан. Може постати још корисније ако се ТУНЕЛ примени изван његове почетне употребе као метод за идентификацију апоптозе. Примена ТУНЕЛ-а искључиво за студије апоптозе је добар пример како наука може бити ненамерно погрешно усмерена неприкладно коришћеном методом. Упркос његовој употреби као тесту за углавном акутне повреде, ТУНЕЛ се може успешно применити за процену и АКИ и ЦКД. Међутим, код ЦКД, треба очекивати да ће степен ТУНЕЛ-позитивности бити нижи него код акутне повреде. Пошто је активност ендонуклеаза (углавном, ДНаза И) много већа у тубуларном епителу него у другим одељцима бубрега, повреда бубрежних тубула се обично сматра израженијом. Међутим, гломеруларне или васкуларне повреде се такође могу проучавати коришћењем ТУНЕЛ-а ако се повреда заиста догоди у овим одељцима. Колокализација ФЛ флуоресцентног ТУНЕЛ-а са ИХЦ маркерима дозвољава идентификацију и повезивање типова ћелија и механизама ћелијске смрти са ТУНЕЛ сигналима. Квантификација ТУНЕЛ-а може дати драгоцене информације о степену ћелијске смрти, а примена софтвера за анализу слике може бити веома корисна у том погледу. Узимајући у обзир разноврсност ТУНЕЛ образаца, снажно се предлаже да се утврде и демонстрирају репрезентативне слике

ТУНЕЛ сигнали који се сматрају позитивним. Коначно, ТУНЕЛ обрасци треба да се користе као извор додатних информација, као што су механизам смрти ћелије и степен токсичности. На пример, разликовање између ТУНЕЛ-позитивних апоптотичких тела, присуства цитоплазматских ТУНЕЛ сигнала или диспергованих ТУНЕЛ образаца може помоћи у идентификацији апоптотичких наспрам некротичних ТУНЕЛ-позитивних ћелија за прецизније тумачење резултата истраживања и дијагностике.

лечење поремећаја бубрега због сексуалног узбуђења