Абстрацт

Циљ:Да би се истражили ефективербаскозид (ВБ; такође познат као актеозид)назарастање тетива и костијукод пацова који следереконструкција предњег укрштеног лигамента (АЦЛ)., и да истражи да ли јеЈанус киназа 2 (ЈАК2)/претварач сигнала и активатор транскрипције 3 (СТАТ3)укључен је сигнални пут.

Методе:Пацови су насумично распоређени у шест група:Схам, Модел, ниска доза ВБ (ВБ‑Л), средња доза ВБ (ВБ‑М), висока доза ВБ (ВБ‑Х), иВБ‑Х + АГ490(инхибитор пута ЈАК2/СТАТ3). Осим Схам групе, све групе су подвргнуте реконструкцији АЦЛ да би се успоставио постоперативни модел.

Мицро‑ЦТје коришћен за процену параметара коштане микроструктуре коштаног тунела и за мерењеповршина попречног пресекафеморалног и тибијалног тунела.

Биомеханичко испитивањепроцењено реконструисано коленоукоченостимаксимално оптерећење.

ЕЛИСАизмерени инфламаторни цитокини и маркери оксидативног стреса у течности за испирање колена.

Х&Е бојењеиСафранин О-Фаст Греен бојењепроцењена патологија хрскавице.

Имунохистоцхемистрипроцењено изражавањеколаген типа И (ЦОЛ‑И)иматрикс металопротеиназа-13 (ММП13).

Вестерн блотиспитивани протеини повезани саЈАК2/СТАТ3пут.

Резултати:У поређењу са групом модела, ВБ‑Л/ВБ‑М/ВБ‑Х је повећаноднос површине кости и запремине, трабекуларна дебљина, иБВ/ТВ, и смањиофеморалнииповршина попречног пресека тунела тибијалне кости, са најзначајнијим променама у ВБ‑Х групи (П<0.05P < 0.05P<0.05). VB‑L/VB‑M/VB‑H also increased укоченостимаксимално оптерећење, поново најистакнутије у ВБ‑Х (П<0.05P < 0.05P<0.05). ELISA showed that VB reduced ТНФ‑, ИЛ‑6, ИЛ‑1, иМДА, док се повећаваСОДиГСХ‑Пк, при чему ВБ‑Х показује најјачи ефекат (П<0.05P < 0.05P<0.05). Histology indicated improved cartilage damage with thicker cartilage layers, more orderly chondrocyte arrangement, reduced inflammatory infiltration, increased proteoglycan content, and clearer tidemark-most evident in VB‑H. Immunohistochemistry showed increased ЦОЛ‑Ии смањиоMMP13у ВБ групама (ВБ‑Х најјачи, П<0.05P < 0.05P<0.05). Western blot indicated increased п‑ЈАК2/ЈАК2ип‑СТАТ3/СТАТ3у ВБ групама (ВБ‑Х најјачи, П<0.05P < 0.05P<0.05). Compared with VB‑H, AG490делимично поништио ова побољшања.

Закључак:Вербаскозид може да подстакне зарастање тетива и кости код пацова након реконструкције АЦЛ-а, потенцијално крозактивирање ЈАК2/СТАТ3 сигналног пута.

Кључне речи:ЈАК2/СТАТ3 сигнални пут; вербаскозид (актеозид); АЦЛ реконструкција; зарастање тетива и костију

Увод

Руптура АЦЛ-а је обично узрокована спортом високог интензитета и механичком траумом, која се обично манифестује болом, брзим отицањем зглобова, нестабилношћу и смањеном толеранцијом на вежбање – што често доводи до великог функционалног ограничења. Реконструкција АЦЛ се широко користи клинички, алиуспешан постоперативни опоравак у великој мери зависи од интеграције тетива-костна интерфејсу трансплантат-кост.

Последњих година, истраживачи су истражили више стратегија за убрзање зарастања тетива и костију, као што је нпрфизичка стимулација(истезање, притисак, вибрације), имплантација биоматеријала и употреба цитокина или приступа ткивном инжењерингу. Чак и тако, излечење може бити споро, а исходи остају променљиви, мотивишући интересовање занови додатни приступи, укључујућибиоактивна једињења са антиинфламаторним, антиоксидативним и заштитним својствима костију.

Вербаскозид (актеозид)је фенилетаноид гликозид растворљив у води који се налази у разним лековитим биљкама. Пријављено је да се излажеантиинфламаторно, антиоксиданс, иза заштиту костијуактивности, укључујући супресију остеокластогенезе и ублажавање ерозије костију у моделима инфламаторног артритиса.

Кључни механички кандидат јеЈАК2/СТАТ3пут, главна интрацелуларна сигнална каскада укључена у различите физиолошке и патолошке процесе. Претходни рад сугерише да активирање ЈАК2/СТАТ3 може повећати дебљину трабекуле, крутост и максимално оптерећење у контексту повреде костију - подржавајући зарастање прелома.

Листа спецификација екстракта високог актеозида Цистанцхе

Служба подршке Вецистанцхе-За више детаља о сарадњи
Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

Где се Цистанцхе уклапа

За читаоце који истражујуприродне стратегије подршке добијене од биљака, корисно је то знатиЦистанцхе(често се расправља у традиционалним биљним контекстима) је једна од биљака које се често помињу као садржефенилетаноидни гликозиди, укључујућиактеозид (вербаскозид)у неким припремама. Ово радинезначи да је то доказана или одобрена постоперативна терапија за реконструкцију АЦЛ-а, она пружа ботанички контекст зашто је актеозид/вербаскозид привукао пажњу истраживања. У контролисаним животињским моделима попут оног у овој студији, коришћење дефинисаног једињења (ВБ) омогућава механичко тестирање – нешто што суплементи са целим биљем не могу да гарантују због варијабилности у саставу и дози.

Ова студија стога истражује да ли вербаскозид може побољшати зарастање тетива и кости у моделу реконструкције АЦЛ пацова и да ли се овај ефекат односи наАктивација ЈАК2/СТАТ3.

Материјали и методе

1. Животиње

Мужјаци СПФ СД пацова (стари 7 недеља, 200–220 г) добијени су са Одељења за експерименталне животиње Медицинског универзитета Хебеи (лиценца: СЦКСК (Хебеи) 2025-005). Услови становања: влажност 55%–65%, температура 22–24 степена, циклус светлости/мрака 12‑х, слободан приступ храни и води. Студију је одобрио Комитет за етику животиња Медицинског колеџа Цангзхоу (бр. одобрења. 2202130618).

2. Лекови и реагенси

Вербаскозид (чистоћа 99,8%, ХИ‑Н0021‑107208), АГ490 (чистоћа 99,0%, ХИ‑12000‑09922): Схангхаи Хаоиуан Биопхармацеутицал Тецхнологи Цо., Лтд.

ЕЛИСА комплети за ТНФ‑ (мл002859), ИЛ‑6 (мл102828), ИЛ‑1 (мл003057), СОД (ЕК‑М26101), МДА (ЕК‑М29370), ГСХ‑Пк (ЕК‑М29370), ГСХ‑Пк (ЕК‑М29370), ГСХ‑Пк (ЕК‑М27) : Цо., Лтд.

Антитела: ЈАК2 (ФНаб04432), СТАТ3 (ФНаб08298) из Вухан Фине Биотецх; ЦОЛ‑И (ГТКС82720), ММП13 (ГТКС100665), п‑ЈАК2 (ГТКС32203) од ГенеТек-а; п‑СТАТ3 (бсм‑52210Р) компаније Биосс; ‑актин (48139) из Нањинг Саигове; ХРП-козји анти-зечји ИгГ (П0948) из Беиотиме-а.

3. Инструменти

Читач микроплоча (ЕнВисион), микроскоп (Олимпус БКС51), систем за снимање у гелу (Био‑Рад ГелДоц Го).

4. Успостављање модела, груписање и администрација

Моделирање (АЦЛ реконструкција):Пацови су анестезирани интраперитонеалним 10% хлорал хидратом (4 мЛ/кг). Направљен је медијални парапателарни рез да би се открила АЦЛ, која је трансектована (позитивна фиока и Лахманов тест). Тибијални и феморални тунели су избушени на природном отиску АЦЛ. Фиксни тетивни трансплантат је прошао кроз тибијални тунел у зглобну шупљину и у феморални тунел, затим зашивен и фиксиран на бочно меко ткиво бутне кости у близини излазног отвора тунела. Са савијеним коленом под углом од 30 степени, крај тибије је зашивен и фиксиран за коштани мост тибијалног тунела и околно меко ткиво. Негативни тестови фиоке и Лахмана и добра напетост графта указали су на успешну реконструкцију. Рез је затворен, дезинфикован и пеницилин је убризгаван 3 дана да би се спречила инфекција. Критеријуми успеха: негативна фиока/Лацхман и добра напетост графта.

Груписање:Употребљено је 120 пацова. Осамнаест је насумично одабрано као лажно (само рез и затварање). Од преостала 102 моделирана пацова, 90 је успешно установљено (стопа успеха 88,24%) и насумично распоређено (18 по групи) у: Модел, ВБ‑Л, ВБ‑М, ВБ‑Х и ВБ‑Х+АГ490.

Режим дозирања (једном дневно током 8 недеља):

ВБ‑Л/ВБ‑М/ВБ‑Х: 50/100/200 мг/кг ВБ путем сонде + физиолошки раствор једнаке запремине интраперитонеално.

ВБ‑Х+АГ490: 200 мг/кг ВБ гаважом + АГ490 5.0 мг/кг интраперитонеално.

Лажни/модел: једнака доза физиолошког раствора путем сонде + физиолошки раствор интраперитонеално.

5. Мицро‑ЦТ

Након еутаназије, нетакнути зглобови колена са суседним бутном и тибијом су сакупљени и фиксирани у 4% параформалдехиду на 4 степена током 24 сата. Узорци су умотани у влажан папир без влакана и скенирани микро-ЦТ од 360 степени (резолуција 10 μм; 70 кВ; 114 μА; експозиција 400 мс; 0,5 мм Ал филтер). Анализирани параметри:однос површина кости/запремина, БВ/ТВ, трабекуларна дебљина; иповршина попречног пресека феморалних и тибијалних тунела.

6. Биомеханичко испитивање

Реконструисана колена су монтирана у машину за испитивање материјала. Примењено је преднапрезање од 0,8 Н да би се уклонило лабавост, након чега је уследило испитивање затезања при 5 мм/мин све док оптерећење не падне ~25% од максимума. Забележено је оптерећење–померај иукоченостизрачунати.

7. ЕЛИСА за факторе инфламаторног и оксидативног стреса у испирању колена

Колена су отворена у супрапателарној врећици и испрана физиолошким раствором три пута да би се сакупила течност за испирање. Након центрифугирања (2.000 о/мин, 15 мин), супернатанти су коришћени за квантификацијуТНФ‑, ИЛ‑6, ИЛ‑1и маркери оксидативног стресаСОД, ГСХ‑Пк, МДАби ЕЛИСА.

8. Х&Е и Сафранин О – брзо зелено бојење

Колена су фиксирана, декалцификована, уграђена у парафин, пресечена на 4 μм, депарафинизована, рехидрирана и обојена Х&Е и Сафранин О-Фаст Греен за процену патологије хрскавице.

9. Имунохистохемија за ЦОЛ‑И и ММП13

Након рутинске обраде, извршено је преузимање и блокирање антигена. Секције су инкубиране са примарним антителима против ЦОЛ-И и ММП13 преко ноћи на 4 степена, затим са ХРП-коњугованим секундарним антителом 1 х на собној температури. ДАБ је коришћен за развој боје, извршено је контра-бојење хематоксилином, а експресија је посматрана микроскопски.

10. Вестерн блот за протеине путање ЈАК2/СТАТ3

Укупни протеин је екстрахован из ткива колена, квантификован, денатурисан, одвојен електрофорезом, пренет у ПВДФ и блокиран. Мембране су инкубиране са примарним антителима против п-ЈАК2, ЈАК2, п-СТАТ3, СТАТ3 и -актина преко ноћи на 4 степена, а затим ХРП-секундарним антителом током 1 х. Траке су визуализоване и анализиране дензитометријом.

 

Табела 6. Поређење нивоа експресије ЈАК2/СТАТ3 протеина везаних за сигнални пут у ткивима коленског зглоба сваке групе пацова (н=6н=6н=6, средња вредност ± СД)

Група	п‑ЈАК2/ЈАК2	п‑СТАТ3/СТАТ3
Схам	0.95 ± 0.10	0.88 ± 0.10
Модел	0.34 ± 0.04a^{a}a	0.25 ± 0.04a^{a}a
ВБ‑Л	0.52 ± 0.06b^{b}b	0.43 ± 0.05b^{b}b
ВБ‑М	0,71 ± 0,08бц^{бц}бц	0,61 ± 0,07бц^{бц}бц
ВБ‑Х	0,92 ± 0,10бцд^{бцд}бцд	0,83 ± 0,09бцд^{бцд}бцд
ВБ‑Х + АГ490	0.55 ± 0.06e^{e}e	0.46 ± 0.05e^{e}e

11. Статистичка анализа

Подаци су нормално распоређени и изражени као средња вредност ± СД. Коришћен је СПСС 29.0. Једносмерна АНОВА је примењена за вишегрупна поређења, а СНК‑к тест за поређење у пару. П<0.05P < 0.05P<0.05 indicated statistical significance.

Резултати

1. Микроструктура коштаног тунела и површина попречног пресека тунела

У поређењу са Схам-ом, група модела показала је смањењеоднос површина кости/запремина, трабекуларна дебљина, иБВ/ТВ, и повећанафеморалнииповршина попречног пресека тибијалног тунела (P<0.05P < 0.05P<0.05). Compared with Model, VB‑L/VB‑M/VB‑H increased bone microstructure parameters and decreased tunnel cross‑sectional areas (P<0.05P < 0.05P<0.05), with VB‑H being most significant. Compared with VB‑H, VB‑H+AG490 reduced these improvements and increased tunnel areas (P<0.05P < 0.05P<0.05).

2. Укоченост колена и максимално оптерећење

У поређењу са Схам-ом, група Модел је излагала смањеноукоченостимаксимално оптерећење (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB‑L/VB‑M/VB‑H significantly increased both outcomes vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05), strongest in VB‑H. AG490 partially reversed the VB‑H benefits (P<0.05P < 0.05P<0.05).

3. Инфламаторни цитокини у испирању колена

ТНФ‑, ИЛ‑6 и ИЛ‑1 су били повишени у групи модела у односу на Схам (П<0.05P < 0.05P<0.05). VB treatment decreased these cytokines vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05). AG490 increased cytokine levels vs VB‑H (P<0.05P < 0.05P<0.05).

4. Маркери оксидативног стреса у испирању колена

Модел пацова се повећаоМДАи смањиоСОДиГСХ‑Пкпротив Шама (П<0.05P < 0.05P<0.05). VB lowered MDA and raised SOD and GSH‑Px vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05). AG490 partially reversed these effects vs VB‑H (P<0.05P < 0.05P<0.05).

5. Патологија хрскавице (Х&Е и Сафранин О–Фаст Греен)

Х&Е је показао озбиљну повреду хрскавице у групи модела са губитком слојевите структуре, оштећеним и неорганизованим површинским ћелијама и израженом инфламаторном инфилтрацијом. ВБ групе су показале 明显 побољшање: дебља хрскавица, више хондроцита са уредним распоредом и смањена инфламаторна инфилтрација; ВБ‑Х је имао најјасније побољшање.
Сафранин О–Фаст Греен је указао на озбиљан губитак протеогликана и неправилан/одсутан знак плиме у моделу, док је ВБ обновио бојење протеогликана и интегритет ознаке плиме; АГ490 погоршава патологију у односу на ВБ‑Х.

6. Израз ЦОЛ‑И и ММП13

У поређењу са Схам-ом, Модел је показао смањењеЦОЛ‑Ии повећаоMMP13 (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB increased COL‑I and decreased MMP13 vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05), strongest in VB‑H. AG490 partially reversed these changes (P<0.05P < 0.05P<0.05).

7. Протеини путање ЈАК2/СТАТ3

Модел пацова је смањенп‑ЈАК2/ЈАК2ип‑СТАТ3/СТАТ3против Шама (П<0.05P < 0.05P<0.05). VB increased both ratios vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05), strongest in VB‑H. AG490 decreased both ratios vs VB‑H (P<0.05P < 0.05P<0.05).

 

Дискусија

Тетиве повезују мишиће са костима и неопходне су за обнављање функције зглобова. У поставци реконструкције АЦЛ-а, интеграција тетива-кост је главна детерминанта механичке стабилности и функционалног опоравка. У овом моделу, операција је нарушила микроархитектуру и биомеханику кости (нижи БВ/ТВ, трабекуларна дебљина, крутост, максимално оптерећење; веће површине тунела), што је у складу са одложеним сазревањем интерфејса.

Упала игра двоструку улогу у зарастању тетива-кости: контролисан инфламаторни одговор може очистити остатке и подржати ћелијску пролиферацију и формирање колагена, док прекомерна упала промовише оштећење ткива, адхезије и стварање ожиљака. Овде су се ТНФ‑, ИЛ‑6 и ИЛ‑1 значајно повећали након реконструкције, што указује на проинфламаторно окружење које је вероватно неповољно за организовано зарастање интерфејса.

Оксидативни стрес је слично важан. Повишена МДА са смањеним СОД и ГСХ‑Пк сугерише повећану пероксидацију липида и смањену антиоксидантну одбрану. Оксидативни стрес може пореметити остеогенезу и пореметити ремоделирање матрикса. Паралелно, повећани ММП13 и смањени ЦОЛ-И имплицирају убрзану деградацију екстрацелуларног матрикса, што може одложити стабилизацију интерфејса тетива-кост.

Зашто је вербаскозид (актеозид) занимљив у "природним" стратегијама

Вербаскозид је једињење биљног порекла са антиинфламаторним и антиоксидативним својствима, што је у складу са идејом да би модулација инфламаторног и оксидативног микроокружења могла помоћи зарастању интерфејса. У овој студији, ВБ је побољшао микроструктуру костију, смањио проширење тунела, побољшао механичку чврстоћу, смањио инфламаторне цитокине, побољшао редокс маркере, повећао ЦОЛ-И и снизио ММП13 - што сугерише координирани помак ка конструктивном ремоделирању, а не деструктивној упали.

ЈАК2/СТАТ3 као механичко чвориште

Пут ЈАК2/СТАТ3 се активира када се екстрацелуларни сигнали везују за рецепторе цитокина, промовишући фосфорилацију ЈАК2, регрутовање/фосфорилацију СТАТ3, СТАТ3 димеризацију и нуклеарну транслокацију ради регулисања гена укључених у запаљење, одговор на оксидативни стрес и формирање костију. Садашњи резултати су показали смањену активацију пута након моделирања, али је ВБ повећао п-ЈАК2/ЈАК2 и п-СТАТ3/СТАТ3. Важно је да је блокирање пута помоћу АГ490 делимично преокренуло предности ВБ-а на микро-ЦТ, биомеханику, инфламаторне/оксидативне маркере, протеине за ремоделирање матрикса и укљученост путева који подржавају хистологију.

 

Практични „природни“ контекст: ботаника богата цистанцхе и актеозидима

За публику заинтересовану за стратегије добијене од биљака,Цистанцхесе често разматра као ботанички извор фенилетаноидних гликозида, укључујући актеозид/вербаскозид у неким препаратима. Из перспективе превођења, кључна научна поента је дадефинисану дозу пречишћеног ВБмогу се механички потврдити на животињским моделима, док производи од целог биља могу да варирају у саставу, методу екстракције и биодоступности. Стога, иако је Цистанцхе релевантан за разговор о ботаничким препаратима богатим актеозидима, докази у овом рукопису посебно подржавајувербаскозид као једињењеу контролисаном постоперативном моделу пацова, а не клиничка препорука.

Општи закључак:Вербаскозид може побољшати зарастање тетива-кости након реконструкције АЦЛ-а код пацова, потенцијално активирањем ЈАК2/СТАТ3 сигнализације и побољшањем инфламаторног/оксидативног микроокружења уз фаворизовање интегритета колагеног матрикса.

 

Референце

(Преведена листа је сачувана каква јесте из вашег рукописа; могу да их форматирам у циљни стил часописа ако ми кажете часопис.)