Егзогени Внт1 спречава акутну повреду бубрега и њену каснију прогресију у хроничну болест бубрега

Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Ксуе Хонг^1†, Ианни Зхоу^2†, Дедонг Ванг^3†, Фупинг Лиу⁴, Тиањун Гуан³, Иоухуа Лиу^1,5и Лиангкианг Ксиао^3*

¹Државна кључна лабораторија за истраживање отказивања органа, Национални центар за клиничка истраживања за бубрежне болести, Одељење нефрологије, болница Нанфанг, Јужни медицински универзитет, Гуангџоу, Кина,²Одељење за нефрологију, болница Сјамен, придружена Универзитету кинеске медицине у Пекингу, Сјамен, Кина,³Одељење за нефрологију, болница Зхонгсхан, повезана са Универзитетом Сјамен, Сјамен, Кина,⁴Одељење за ендокринологију и дијабетес, Прва придружена болница Универзитета Сјамен, Сјамен, Кина,⁵Одељење за патологију, Медицински факултет Универзитета у Питсбургу, Питсбург, Пенсилванија, Сједињене Америчке Државе

Студије сугеришу да су агонисти Внт/-катенина корисни у лечењуакутна повреда бубрега(АКИ); међутим, остаје неухватљива у вези са његовом улогом у превенцији АКИ и њеном прогресијом до хроничне болести бубрега (ЦКД). У овој студији, бубрежна Внт/ -цатенин сигнализација је или активирана прекомерном експресијом егзогеног Внт1 или инхибирана применом ИЦГ-001, инхибитора мале молекуле сигнализације -катенина, пре него што су мишеви били подвргнути исхемијској/реперфузионој повреди (ИРИ) да би изазвали АКИ и накнадни ЦКД. Наши резултати су показали да ин виво експресија егзогеног Внт1 пре ИР-заштићених мишева против АКИ, и омета прогресију АКИ до ЦКД код мишева, што је доказано и биохемијским анализама крви и хистолошким анализама бубрега. Насупрот томе, претходна терапија ИЦГ-001 пре ИР није имала ефекта на сигнализацију бубрежног Внт/-катенина или прогресију АКИ у ЦКД. Механички, ин виво експресија егзогеног Внт1 пре ИР потиснула је експресију проапоптотичких протеина код АКИ мишева и смањила инфламаторне одговоре код АКИ и ЦКД мишева. Поред тога, егзогени Внт1 је инхибирао апоптозу тубуларних ћелија индуковану третманом хипоксијом-реоксигенацијом (Х/Р) ин витро. Да закључимо, ова студија пружа доказе који подржавају превентивни ефекат активације Внт/-катенина на АКИ повезану са ИР и његову каснију прогресију у ЦКД.

Кључне речи: акутна повреда бубрега, хронична болест бубрега, Внт1, -катенин, исхемијско-реперфузиона повреда

Третман одакутна повреда бубрега(АКИ): цистанцхе

УВОД

Акутна повреда бубрега (АКИ)је клиничко стање услед брзог губитка функције бубрега услед разних повреда, као што су лекови, исхемија, сепса и токсини (Цхавла и Киммел, 2012; Сцхолз ет ал., 2021). АКИ је повезан са високом инциденцом морбидитета и смртност, одговорна за приближно 2 милиона смртних случајева сваке године широм света (Белаиев и Палевски, 2014). Посебно, АКИ је добро признат независни предиктор за развој хроничне болести бубрега (ЦКД) или завршног стадијума бубрежне болести (ЕСРД), који су поставили огроман економски терет на здравствени систем (Леунг ет ал., 2013; Белајев и Палевски, 2014; Курзхагенет ал., 2020). Нажалост, не постоје ефикасни лекови за превенцију и лечење АКИ.

Внт/-катенин сигнализација игра фундаменталну улогу у органогенези, хомеостази ткива и развоју различитих болести, укључујући болести бубрега (Сони, 2021). -Катенин има двоструку улогу јер служи и као структурни протеин и као регулатор транскрипције (МацДоналд ет ал., 2009). За мембрану везан -катенин је део комплекса адхерентне везе и доприноси интеракцији ћелија-ћелија, док је цитосолни -катенин фосфорилисан гликогенсинтаза киназом-3 (ГСК-3) и циља на убиквитинацију и протеазомску деградацију. Међутим, такву деградацију -катенина би могли спасити Внт лиганди, породица излучених гликопротеина са различитим биолошким активностима. Везивање Внт стабилизује -катенин, који се транслоцира у језгро и делује као фактор транскрипције за регулацију гена. Значајно је да је сигнализација Внт/-катенина релативно утишана код неоштећених одраслих бубрега, али се поново активира током акутне и хроничне повреде бубрега (Хуффстатер ет ал., 2020). Активација Внт/-катенина у раној фази АКИ смањује повреду бубрега и фаворизује опоравак бубрежне функције, док би трајна активација Внт/-катенина могла довести до прогресије од АКИ до ЦКД (Ксиао ет ал., 2016; Хуффстатер ет ал., 2020). Према томе, сигнализација Внт/-катенина је мач са две оштрице код повреде бубрега и захтева боље разумевање. Приметно, остаје недостижна у вези са улогом Внт/-цатенинактивације у превенцији АКИ-а и његовог накнадног напредовања АКИ-ЦКД.

Повреда бубрежне исхемије-реперфузије (ИРИ) се сматра главним узроком АКИ. Стога се животињски модел бубрежног ИРИ обично користи за истраживање прогресије АКИ и АКИ-ЦКД (Бонвентре и Ианг, 2011). Оба фармаколошка и генетска приступа су коришћена да би се разјаснила улога активације Внт/-катенина у ИРИ моделима АКИ и ЦКД, респективно. Инхибитори литијума и ГСК-3 се обично користе за фармаколошко активирање Внт/-цатенинсигналинга у претклиничким моделима АКИ, али треба напоменути и њихове ефекте независне од -цатенин (Бао ет ал., 2014).Генетичке модификације ГСК{{9 }} , -цатенин или Внт лиганди (Внт1 и Внт9а) су коришћени да би се разјаснила улога активације Внт/ -цатенин у АКИ и ЦКД (Бонвентре андИанг, 2011; Бао ет ал., 2014; Зхоу ет ал., 2013, 2013, 2018; Лиует ал., 2020). Ипак, студије о улози Внт/-цатенинсигналинга у превенцији АКИ су прилично ограничене. Ова студија је имала за циљ да разјасни улогу Внт/-катенин сигнализације у превенцији АКИ и њеног каснијег прогресије до ЦКД.

СЛИКА 1|Ин виво експресија егзогеног Внт1 пре ИР спречава АКИ и активира бубрежни катенин код мишева

(A)Групе за третман мишева. Мишеви су третирани или пцДНА3 (ИРИ плус пцДНА3) или ПХА-Внт1 (ИРИ плус ПХА-Внт1) плазмидом путем хидродинамичке ињекције у репну вену 2 дана пре БИРИ. Ниво креатинина у серуму(B)и нивои азота уреје у крви (БУН).(C) биле мерене. (D) Репрезентативне микрографије морфологије бубрега 1 дан након БИРИ. Секције бубрега подвргнуте су бојењу периодичном киселином-Сцхиффом. Површине у кутијама су увећане. Стрелице означавају бубрежне тубуле. Скала бар, 200 µм.(E, F)Вестерн блот анализа активног катенина у бубрезима мишева. *П < 0.05="" у="" односу="" на="" лажне="" контроле="" (н="5)." †п="">< 0,05="" у="" односу="" на="" ири="" убризган="" пцдна3="" плазмидом="" (н="">

Цистанцхе побољшава функцију бубрега

МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДЕ

Студија о животињама

Мужјаци Ц57БЛ/6 мишева тежине приближно 22–25 г купљени су од Витал Ривер Лаборатори Анимал Тецхнологи (Пекинг, Кина) и одржавани у објекту за животиње (температура: 22 ± 2◦Ц, влажност: 60 ± 5 процената, 12 х мрак/светлости циклус ) на Јужном медицинском универзитету (Гуангџоу, Кина) са водом и храном ад либитум. Студије на животињама је одобрио Комитет за етику и добробит животиња на Јужном медицинском универзитету. Све животиње су третиране у складу са Водичем за негу и употребу лабораторијских животиња.

Индукција АКИ и ЦКД код мишева је описана у нашим претходним студијама (Ксиао ет ал., 2016; Зхоу ет ал., 2018). Билатерална ренална исхемија/реперфузиона повреда (БИРИ) се широко користи за изазивање АКИ код мишева, док повећава смртност током прогресије АКИ до ЦКД. Због тога се унилатерална бубрежна исхемија/реперфузиона повреда (УИРИ) користи за истраживање прогресије АКИ у ЦКД. Укратко, мишу је направљен рез на средини абдомена под општом анестезијом, а билатералне или леве бубрежне педикуле су исечене 30 минута коришћењем микроанеуристичких стезаљки (ставка бр. 18051-35; Фине СциенцеТоолс, Кембриџ, Уједињено Краљевство). Током операције, телесна температура је одржавана на приближно 37–38°Ц коришћењем система грејања контролисаног температуром.

Да би се проценио превентивни ефекат активације Внт/-катенина на АКИ, мишевима је убризган 1 мг/кг хемаглутинин(ХА) обележен Внт1 експресиони вектор (ПХА-Внт1, УпстатеБиотецхнологи) или празан вектор (пцДНА3) 2 дана пре БИРИ користећи хидродинамичку- техника преноса гена заснована на претходном извештају (Ксиао ет ал., 2016). Крв и ткиво бубрега су сакупљени 1 дан након бубрежног БИРИ.

Да би се проценио ефекат ране активације Внт/-катенина на прогресију АКИ до ЦКД, мишеви су или подвргнути дневној хидродинамичкој ињекцији експресионих плазмида Внт1 у репну вену у дози од 1 мг/кг или дневној интраперитонеалној ињекцији ИЦГ-001({{4 }}, Цхембест, Шангај, Кина) на 5 мг/кг током 3 дана пре УИРИ. Крв и ткиво бубрега сакупљени су 11 дана након УИРИ. У нашој прелиминарној студији, 2 дана ињекције Внт1 могла би изазвати експресију Внт1 код АКИ мишева (подаци нису приказани). Треба напоменути да су 3 дана ињекције Внт1 изабрана да би се осигурала и продужила експресија Внт1 током прогресије АКИ до ЦКД.

Акутна повреда бубрега (АКИ) је клиничко стање услед брзог губитка бубрежне функције

Ћелијска култура и лечење

Људска проксимална тубуларна епителна ћелијска линија (ХКЦ-8) обезбедила је др Л. Рацусен са Универзитета Џонс Хопкинс (Балтимор, МД, Сједињене Државе). Ћелијске културе су изведене како је претходно описано (Зхоу ет ал., 2013). ХКЦ-8 ћелије су третиране хуманим рекомбинантним Внт1 (СРП4754; Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, Сједињене Државе) при 100 нг/мЛ или ИЦГ-001 (847591-62-2, Цхембест, Шангај , Кина) на 10 µМ током 4 х. Ћелије су затим инкубиране у радној станици за хипоксију (Кс3-ЦК, Биоспхерик) на 1 проценту пО2 током 48 х. Затим су ћелије поново оксигенисане 2 х пре сакупљања за различите анализе.

СЛИКА 2|Ин виво експресија егзогеног Внт1 пре ИР смањује апоптозу тубуларне ћелије и активацију НФ-κБ код АКИ мишева

(A) Репрезентативне микрографије показују ТУНЕЛ-позитивне ћелије у различитим групама како је назначено. Стрелице означавају позитивно бојење. Скала бар, 100 µм.(B)Графичка презентација приказује ТУНЕЛ-позитивне ћелије по пољу велике снаге (ХПФ) у различитим групама како је назначено.(C–F)Репрезентативне Вестерн блот анализе показују бубрежну експресију ФасЛ, п53 и Бак у различитим групама као што је назначено. *П < 0.05="" у="" односу="" на="" лажне="" контроле;="" †п="">< 0,05="" у="" односу="" на="" ири="" убризган="" са="" пцднк="" плазмидима="" (н="">(G) Репрезентативни Вестерн блот протеина п65 и п-п65 у различитим групама како је назначено.

Апоптосис Ассаи

Ћелије су трипсинизоване, сакупљене и испране ПБС.ПЕ Анексином В бојење је изведено према протоколу произвођача. Цитометријска анализа је обављена са проточним цитометром (БД ФАЦСЦанто ИИ, Сан Јосе, Калифорнија, Сједињене Америчке Државе) да би се измериле стопе апоптозе откривањем релативне количине ПЕ Анексин В позитивних и 7-ААД негативних ћелија. Сваки тест је изведен у три примерка.

Тест креатинина и азота уреје у крви

Нивои креатинина у серуму и урину, као и нивои уреанитрогена у крви (БУН) измерени су помоћу аутоматског биохемијског анализатора (АУ480, Бецкман-Цоултер Инц., Бреа, ЦА, Сједињене Државе).

Хистологија и имунохистохемијско бојење

Секције бубрега и имунохистохемијско бојење изведени су као што је претходно описано (Лиу ет ал., 2020). Примарна антитела су укључивала поликлонални анти-Внт1 (аб15251; Абцам, Инц.), зечји поликлонални анти- -катенин (аб15180; .), и зечји поликлонални анти-фибронектин (Ф3648; Сигма-Алдрицх).

Вестерн блот анализа

Вестерн блот анализа је изведена као што је претходно описано (Зхоу ет ал., 2019). Примарна антитела су укључивала зечји поликлонални анти-фибронектин (Ф3648; Сигма-Алдрицх), мишје моноклонско анти- -катенин антитело (610154; БД ТрансдуцтионЛабораториес), мишје моноклонско анти- -СМА антитело (А2547), раббит СМА (А2547); поликлонско анти-Внт1 (аб15251; Абцам), мишји анти- -тубулин (Т9026; Сигма-Алдрицх), мишје анти ПАИ-1 антитело (АФ3828; Р&Д системи), анти-активни -катенин (#05 –665; ЕМД Миллипоре), анти-Фас лиганд (ФасЛ) (СЦ -6237; Санта Круз, Калифорнија, Сједињене Државе), п53 (#2524С; ЦСТ), Бак (СЦ 20067; Санта Круз), п65 ( #8242С; ЦСТ), п-п65 (#3033С; ЦСТ),ПЦНА (#2586С; ЦСТ).

Екстракција РНК и кПЦР анализа

Укупна РНК изолација и кПЦР су спроведени као што је претходно описано. Нивои мРНК различитих гена су нормализовани са -актином. Прајмерске секвенце гена су наведене у Додатној табели 1.

СЛИКА 3|Ин виво експресија егзогеног Внт1 пре ИР спречава прогресију АКИ до ЦКД код мишева

(A)Групе за третман мишева. Мишеви су били подвргнути или хидродинамичкој ињекцији репне вене од 1 мг/кг пцДНА3 (ИРИ плус пцДНА3) или ПХА-Внт1 (ИРИ плус ПХА-Внт1) плазмида, или интраперитонеалној ињекцији 5 мг/кг ИЦГ-001 3 дана пре УИРИ . Крв и ткива су прикупљени 11 дана након УИРИ. Ниво креатинина у серуму(B) и нивои азота уреје у крви (БУН).(C) биле мерене.(D) Репрезентативне микрографије морфологије бубрега 11 дана након УИРИ. Секције бубрега подвргнуте су бојењу периодичном киселином-Сцхиффом. Површине у кутијама су увећане. Стрелице означавају бубрежне тубуле. Скала трака, 100 µм. *П < 0,05;="" **п="">< 0,01.="" н="">

Статистичка анализа

Сви подаци су изражени као средња вредност ± СЕМ. Подаци су статистички анализирани коришћењем софтвера Сигма Стат (Јандел СциентифицСофтваре, Сан Рафаел, ЦА, Сједињене Државе). Поређење између група је направљено коришћењем једносмерне АНОВА, након чега је уследио Студент-Невман-Кеулс тест. П < 0.05="" се="" сматрало="">

ЦИСТАНЦХЕ ХЕРБ КОРИСТИ ЗА БУБРЕГЕ

РЕЗУЛТАТИ

Ин виво експресија егзогеног Внт1 пре ИР спречава акутну повреду бубрега и активира бубрежни катенин код мишева

Да би се утврдила улога активације Внт/-катенина у превенцији АКИ, мишевима је даван или ХА-таггед Внт1 вектор експресије (ПХА-Внт1) или празан вектор (пцДНА3) путем хидродинамичке ињекције у репну вену 2 дана пре БИРИ(Слика 1А). Нивои креатинина и БУН у серуму, два биомаркера оштећења бубрега, значајно су повећани код мишева 1 дан након БИРИ, што указује на постојање АКИ (Слике 1Б, Ц). посматрано код АКИ мишева(Слика 1Д). Значајно је да су ове промене у биомаркерима повреде серума бубрега и морфолошким лезијама код АКИ мишева значајно ослабљене егзогеним Внт1. Вестерн блотанализе су откриле да егзогени Внт1 промовише експресију бубрежног катенина код АКИ мишева(Слике 1Е, Ф). Узети заједно, ови налази сугеришу да претходни третман егзогеног Внт1 активира бубрежни катенин и спречава АКИ код мишева.

Ин виво експресија егзогеног Внт1 пре ИР смањује апоптозу тубуларне ћелије и инхибира активацију нуклеарног фактора-Капа Б

Да би се истражило да ли је регулација апоптозе механизам који лежи у основи заштитног ефекта егзогеног Внт1 на АКИ, обављено је ТУНЕЛ бојење да би се идентификовала апоптоза у ткиву бубрега АКИ мишева. У поређењу са Схам мишевима, ИРИ је значајно повећао стопу апоптозе, као и нивое протеина повезаних са апоптозом, као што су ФасЛ, п53 и Бак, бубрези мишева(Слике 2А–Ф). Такве промене у бубрезима АКИ мишева су значајно смањене ин виво експресијом егзогеног Внт1 пре ИР. Нуклеарни фактор-капа Б (НФ κБ), посебно његов хетеродимер облик п65/п50, игра кључну улогу у регулисању инфламаторног одговора у бубрезима АКИ мишева. Вестерн блот анализа је показала да су и п65 и његов фосфориловани облик (п-п65) значајно повећани бубрези мишева након ИРИ, док су такве промене спречене егзогеним Внт1(Слика 2Г). Ови налази сугеришу да ин виво експресија егзогеног Внт1 пре ИР спречава апоптозу и инхибира активацију НФ-κБ у бубрезима АКИ мишева.

СЛИКА 4|Ин виво експресија егзогеног Внт1 пре ИР смањује ендогени Внт1 и -катенин у бубрезима мишева након прогресије АКИ-ЦКД

(A)Репрезентативне микрографије показују експресију протеина Внт и -цатенин у различитим групама како је назначено. Скала бар, 50 µм.(B–E)Репрезентативне Вестерн блотанализе нивоа протеина Внт1, -катенина и активног -катенина у различитим групама како је назначено.(F) експресија мРНА ТГФ- у различитим групама као што је назначено.*П < 0.05;="" **п="">< 0,01.="" н="">

Ин виво експресија егзогеног Внт1 пре ИР спречава прогресију акутне повреде бубрега у хроничну бубрежну болест

Затим смо испитали да ли активација Внт/-катенина пре ИР може спречити прогресију АКИ у ЦКД. Као што је приказано уСлика 3А, мишеви су били подвргнути ињекцији плазмида експресије Внт1 (ПХА-Внт1) у вену хидродинамичког репа (ПХА-Внт1) или интраперитонеалној ињекцији ИЦГ-001 3 дана пре УИРИ. И нивои креатинина и БУН у серуму су повећани код мишева 11 дана након УИРИ(Слике 3Б, Ц). Поред тога, Массоново трихромно бојење открило је истакнуто таложење колагена и фиброзне лезије код мишева 11 дана након УИРИ(Слика 3Д). Ова запажања указују на прогресију АКИ до ЦКД код мишева након УИРИ. Приметно је да су уочене промене серумских биомаркера оштећења бубрега и фиброзе бубрега код мишева са ЦКД скоро потпуно спречене претходним третманом егзогеног Внт1, али не и ИЦГ-001. Стога, ин виво експресија егзогеног Внт1 пре ИР спречава прогресију АКИ до ЦКД код мишева.

Ин виво експресија егзогеног Внт1 пре пада ИР-регулише ендогени Внт1 и -цатенин у бубрезима

Даље смо истраживали ефекат егзогеног Внт1 онендогеног Внт/-катенина сигнализације у бубрезима мишева са ЦКД. Као што је приказано на Слици 4А, имунохистохемијско бојење је открило да су и ендогени Внт1 и -катенин били значајно појачано регулисани у бубрезима мишева 11 дана након ИРИ. Њихови нивои протеина су у великој мери смањени претходним третманом егзогеног Внт1, али не и ИЦГ-001. Вестерн блот анализе су потврдиле инхибиторни ефекат егзогеног Внт1, али не и ИЦГ-001, онендогену експресију Внт1, -катенина и активног -катенинина бубрега мишева са ЦКД (Слике 4Б–Е). Сигнални путеви Внт/-цатенин и ТГФ- укрштају се у бубрежној фибрози. Експресија мРНА ТГФ- је индукована у бубрезима ЦКД мишева, а таква индукција је смањена егзогеним Внт1, али не и ИЦГ-001 (Слика 4Ф). Према томе, претходни третман егзогеног Внт1 инхибира ендогену бубрежну Внт/-цатенинсигнализацију код ЦКД мишева.

СЛИКА 5 ​​| Ин виво експресија егзогеног Внт1 пре ИР смањује реналне циљне гене за Внт/-катенин код мишева након прогресије АКИ-ЦКД

(A, B) мРНА експресија ПАИ-1 и ММП-7 у различитим групама како је назначено.(C–E)Репрезентативне Вестерн блот анализе нивоа ПАИ-1 и Клотхо протеина.(F)мРНА експресија Клотха. *П < {{0}}.05;="" **п="">< 0,01.="" н="">

Ин виво експресија егзогеног Внт1 пре него што ИР не регулише циљне гене РеналВнт/-Цатенин код мишева

У поређењу са Схам мишевима, експресија мРНА ПАИ-1и ММП-7, два директна низводна циља Внт/-цатенинсигналинга, била је значајно повишена у бубрезима мишева 11 дана након УИРИ(Слике 5А, Б). Претходни третман егзогеног Внт1, али не и ИЦГ-001, инхибирао је експресију ПАИ-1 и ММП-7 мРНА код мишева са ЦКД. Вестерн блот анализе су показале да су нивои протеина ПАИ-1 повећани у бубрезима мишева са ЦКД, где су укинути претходним третманом егзогеног Внт1, али не и ИЦГ-001(Слике 5Ц, Д). Клотхо је анендогени Внт антагонист везивањем и секвестрирањем Внт лиганада. У поређењу са Схам мишевима, нивои мРНА и протеина Клотхо су смањени у бубрезима мишева 11 дана након УИР(Слике 5Е, Ф). Претходни третман егзогеног Внт1, али не и ИЦГ-001, скоро је потпуно обновио Клотхо мРНА и експресију протеина у бубрезима мишева са ЦКД. Ови налази даље сугеришу инхибиторни ефекат егзогеног Внт1 на ендогене Внт/-катенин сигналне бубреге мишева са ЦКД.

Ин виво експресија егзогеног Внт1 пре ИР смањује фиброзу бубрега код мишева након акутне повреде бубрега - хроничне прогресије болести бубрега

Затим смо истраживали ефекат активације Внт/-катенина пре ИР на гене бубрежног матрикса и фибротичне лезије код ЦКД мишева. У поређењу са Схам мишевима, експресија мРНА фибронектина (ФН), колагена И, колагена ИИИ и -СМА је била значајно индукована у бубрези мишева 11 дана након УИР(Слике 6А–Д).Такве промене су смањене претходним третманом егзогеног Внт1, али не и ИЦГ-001. Вестерн блот анализа је показала да су нивои протеина ФН и -СМА значајно повећани у бубрезима мишева са ЦКД, а такве промене су уклоњене претходним третманом егзогеног Внт1, али не и ИЦГ-001(Слике 6Е–Г). Ефекти егзогеног Внт1 и ИЦГ-001 на експресију ФНпротеина код мишева са ЦКД потврђени су имунолошким бојењем бубрега са ФН антителом(Слика 6Х). Ови налази сугеришу да претходни третман егзогеног Внт1 спречава реналфиброгенезу код ИР-индукованих ЦКД мишева.

СЛИКА 6|Ин виво експресија егзогеног Внт1 пре ИР смањује фиброзу бубрега код мишева након прогресије АКИ-ЦКД

(A–D)мРНА експресија фибронектина, колагена И, колагена ИИИ и -СМА.(E–G)Репрезентативне Вестерн блот анализе нивоа фибронектина и -СМА-СМА протеина.(H)Имунолошко бојење фибронектинских секција бубрега. *П < {{0}}.05;="" **п="">< 0,01;="" †п="">< 0,05.="" н="5." скала="" бар,="" 50="">

Ин виво експресија егзогеног Внт1 пре него што ИР ослаби запаљење бубрега после акутне повреде бубрега-хронична прогресија болести бубрега

У поређењу са Схам мишевима, експресија мРНА инфламаторних гена, као што су ИЛ-1, ИЛ-6 и ТНФ-, била је значајно повећана у бубрезима мишева 11 дана након УИР-а(Слике 7А–Ц). Такве промене су скоро потпуно укинуте претходним третманом егзогеног Внт1, али не и ИЦГ-001. Вестерн блот анализа је показала да су нивои протеина и П65 и његовог фосфорилираног облика (п-п65) значајно повећани у бубрезима мишева након 11 дана након УИРИ, што указује на активацију НФ-κБ сигнализације код ЦКД мишева(Слике 7Д–Ф). Посебно, претретман егзогеног Внт1, али не и ИЦГ-001, значајно је смањио нивое п65 и п-п65 протеина у бубрезима мишева са ЦКД. Ови налази указују да пре-третман егзогеног Внт1 спречава инфламаторне одговоре бубрега код мишева са ЦКД.

СЛИКА 7|Ин виво експресија егзогеног Внт1 пре ИР ублажава упалу бубрега код мишева након прогресије АКИ-ЦКД

(A–C) мРНА експресија ИЛ-1, ИЛ-6 и ТНФ- у бубрезима мишева. (D–F)Репрезентативне Вестерн блот анализе нивоа п65 и п-п65 протеина. *П < 0.05;="" **п="">< 0,01.="" н="">

Егзогени Внт1 штити тубуларне ћелије од апоптозе изазване повредом хипоксије-реоксигенације ин витро

Да бисмо даље прецизирали улогу Внт1 у АКИ, успоставили смо ХКЦ-8 тубуларне моделе АКИ користећи третман хипоксија-реоксигенацијом (Х/Р). Проточна цитометрија је коришћена за откривање апоптозе и открила је повећање стопе апоптозе у ХЦК 8 ћелијама након Х/Р третмана(Слике 8А, Б). Егзогени Внт1 је значајно смањио апоптозу у ХЦК-8 ћелијама након Х/Р третмана. Вестерн блот анализе су показале да Х/Р третман значајно повећава нивое протеина повезаних са апоптозом, као што су ФасЛ, п54, Бак и Парп{{4} } у ХЦК-8 ћелијама(Слике 8Ц–Г). Такве промене су смањене егзогеним Внт1. Ови подаци сугеришу да егзогени Внт1 штити од Х/Р-индуковане апоптозе у тубуларним ћелијама.

СЛИКА 8|Егзогени Внт1 штити тубуларне ћелије од апоптозе изазване повредом хипоксије-реоксигенације (Х/Р) ин витро

(A)Репрезентативне ФАЦС анализе показују да Внт1 инхибира апоптозу ћелија изазвану хипоксијом/реоксигенацијом (Х/Р). ХКЦ-8 ћелије су претходно експримиране са егзогеним Внт1, након чега је уследила инкубација у хипоксичним условима током 48 х, а затим реоксигенација током 2 х.(Б) Графикапрезентација показује проценат апоптотичких ћелија у различитим групама како је назначено. ПЕ-обележене Анексин В-позитивне ћелије су избројане проточном цитометријом. *П < 0.05="" у="" односу="" на="" контроле;="" †п="">< 0,05="" у="" односу="" на="" х/р="" (н="">(C) Репрезентативне Вестерн блота анализе показују протеинску експресију ФасЛ, п53, Бак и Парп-1 у ХКЦ-8 ћелијама.(D–G)Графичке презентације показују релативну количину ФасЛ, п53, Бак и Парп-1 у ХКЦ-8 ћелијама. *П < 0.05="" у="" односу="" на="" контроле;="" †п="">< 0,05="" у="" односу="" на="" х/р="" (н="">

ДИСКУСИЈА

Иако је учесталост АКИ у порасту и главни је фактор ризика за прогресију до ЦКД, не постоје ефикасне терапије за превенцију и лечење АКИ. Бројне ситуације, као што су операција срца, интратубуларни депозити и примена нефротоксичних лекова, могу довести до развоја АКИ (Мас-Фонт ет ал., 2017). Ово наглашава потребу за превентивним мерама АКИ.

Иако бројне студије подржавају благотворне ефекте активације Внт/-катенина у патогенези АКИ, остаје нејасно о превентивном дејству агониста Внт/-катенина на АКИ. Једно ново откриће у овој студији је да ин виво експресија егзогеног Внт1 пре ИР може заштитити мишеве од АКИ и спречити прогресију АКИ до ЦКД. Ин виво експресија егзогеног Внт1 2 дана пре реналне билатералне ИР је била у стању да активира бубрежни катенин, што је довело до смањене апоптозе и упале бубрега код АКИ мишева (1 дан након ИР). Поред тога, ин виво експресија егзогеног Внт1 3 дана пре бубрежне једностране инхибиције ИР ендогени Внт/-цатенинсигнализовани и спречили развој реналне фиброзе код мишева са хроничном болешћу бубрега (11 дана након ИР). Насупрот томе, показало се да ин виво експресија егзогеног Внт1 5 дана након бубрежне ИР изазива активацију -катенина и убрзава АКИ до напредовања ЦКД (Ксиао ет ал., 2016). Ове студије сугеришу да је тајминг агониста Внт/-катенина важан фактор када се користе за превенцију и лечење АКИ.

Студије сугеришу да би трајна активација Внт/-цатенинсигналинга могла довести до прогресије АКИ до ЦКД. ИЦГ 001 селективно инхибира Внт/-цатенин/ЦРЕБ везујући протеин (ЦБП) сигнализацију и тренутно је у клиничком испитивању за различите врсте рака. Раније смо показали да је примена ИЦГ-0115 дана након ИР обновила функцију бубрега и спречила прогресију АКИ до ЦКД, о чему сведочи смањена реналфиброза (Ксиао ет ал., 2016). Поред тога, примена ИЦГ-001 почевши од 3 дана након једностране опструкције уретера (УУО) могла је да ублажи реналне фибротичне лезије у УУО моделима ЦКД мишева (Хао ет ал., 2011). Међутим, ова студија је показала да претходна терапија ИЦГ-001 3 дана пре ИР није имала утицај на бубрежну сигнализацију Внт/-катенина или прогресију АКИ до ЦКД. Ово није изненађујуће јер је Внт/-катенин сигнализација изражена на веома ниским нивоима у неповређеним бубрезима одраслих (Танет ал., 2014). Без обзира на то, наши налази сугеришу да су време и трајање примене ИЦГ{15}} од кључне важности за одређивање њеног терапијског исхода.

Механизми који леже у основи заштитног ефекта Внт/-цатенина могу укључивати модулацију апоптозе и путева преживљавања. Генетска аблација тубула-цатенина промовише тубуларну апоптозу након третмана ИРИ или фолном киселином, док активација Внт/-цатенина потискује про-апоптотичке протеине (Ванг ет ал. , 2009; Зхоу ет ал., 2012). У овој студији, егзогени Внт1 је значајно инхибирао апоптозу тубуларне ћелије у оба ИРИмишја модела АКИ и Х/Р-индуковане ћелијске моделе АКИ. Ово сугерише да би апоптоза могла бити потенцијални механизам који лежи у основи превентивног ефекта егзогеног Внт1 на АКИ и АКИ до напредовања ЦКД. Ова студија је такође показала инхибиторни ефекат егзогеног Внт1 на активацију НФ-κБ и код АКИ и код ЦКД, што указује на супресију инфламаторног одговора. Међутим, треба напоменути да остаје да се утврди да ли је смањена упала секундарни ефекат заштите или су механизми заштите посредовани егзогеним Внт1. Потребна су даља истраживања да би се разјаснио тачан механизам за заштиту од АКИ посредоване егзогеним Внт{12}посредством и превенцију прогресије АКИ до ЦКД.

Користите Внт/-цатенин модулаторе за превенцију и лечење АКИ и ЦКД

ЗАКЉУЧАК

У закључку, ова студија пружа доказе који подржавају превентивни ефекат активације Внт/-катенина на АКИ и ЦКД повезане са ИР, иако је потребно више рада да би се разјаснили тачни механизми помоћу којих егзогени Внт1 штити од АКИ и ЦКД. Имајући у виду двоструку улогу Внт/-катенин сигнализације у АКИ и ЦКД, ова студија наглашава важност времена када се користе Внт/-цатенин модулатори за превенцију и лечење АКИ. Будуће студије које користе више фармаколошких и генетских приступа, као и оптимално време и трајање лечења су оправдане да би се истражио ефекат Внт/-катенинагониста у превенцији и лечењу АКИ.

ОД: Егзогени Внт1 спречава акутну повреду бубрега и њену каснију прогресију у хроничну болест бубрега, Ксуе Хонг^1†, Ианни Зхоу^2†, Дедонг Ванг^3†, Фупинг Лиу⁴, Тиањун Гуан³, Иоухуа Лиу^1,5и Лиангкианг Ксиао^{3 *}

Фронт. Пхисиол., 08. новембар 2021.|хттпс://дои.орг/10.3389/фпхис.2021.745816