Секвенцирање целог генома за дијагнозу неуролошких поремећаја понављања експанзије у УК: ретроспективна дијагностичка тачност и проспективна студија клиничке валидације

За више информација:ali.ma@wecistanche.com

Резиме

Позадина

Поремећаји поновљене експанзије погађају око 1 од 3000 особа и клинички су хетерогене болести узроковане експанзијама кратких тандемских понављања ДНК. Генетско тестирање је често локусно специфично, што доводи до недовољне дијагнозе људи који имају атипичне клиничке презентације, посебно код педијатријских пацијената без претходне позитивне породичне историје. Секвенцирање целог генома се све више користи као тест прве линије за друге ретке генетске поремећаје, а циљ нам је био да проценимо његов учинак у дијагнози пацијената санеуролошкимпонављају поремећаји експанзије.

Методе

Ретроспективно смо проценили дијагностичку тачност секвенцирања целог генома да бисмо открили најчешће поновљене локусе експанзије повезане санеуролошкимисходе (АР, АТН1, АТКСН1, АТКСН2, АТКСН3, АТКСН7, Ц9орф72, ЦАЦНА1А, ДМПК, ФМР1, ФКСН, ХТТ и ТБП) коришћењем узорака добијених у оквиру Националне здравствене службе у Енглеској од пацијената за које се сумњало да имајунеуролошкимпоремећаји; претходни резултати ПЦР теста су коришћени као референтни стандард. Клиничка тачност секвенцирања целог генома ради откривања поновљених експанзија проспективно је испитана код претходно генетски тестираних и недијагностикованих пацијената који су регрутовани 2013–17. у 100 000 Геномес Пројецт у УК, за које се сумњало да имају генетскинеуролошкимпоремећај (породични или рани облици атаксије, неуропатије, спастичне параплегије, деменције, болести моторних неурона,паркинсоновацкретањепоремећаји, интелектуални инвалидитет или неуромишићни поремећаји). Ако је позив за поновљено проширење направљен коришћењем секвенцирања целог генома, ПЦР је коришћен за потврду резултата.

Налази

Дијагностичка тачност секвенцирања целог генома за откривање поновљених експанзија процењена је у односу на 793 ПЦР теста која су претходно обављена у оквиру НХС од 404 пацијента. Секвенцирање целог генома је исправно класификовало 215 од 221 проширеног алела и 1316 од 1321 непроширеног алела, показујући 97,3 процента осетљивости (95 процената ЦИ 94·2–99·0) и 99,6 процената специфичности (99·1–99 ·9) преко 13 локуса повезаних са болестима у поређењу са резултатима ПЦР теста. У узорцима од 11 631 пацијената у 100 000 Геномес Пројецт, секвенцирање целог генома идентификовало је 81 поновљено проширење, које је такође тестирано ПЦР: 68 је потврђено као поновљена експанзија у пуном патогеном опсегу, 11 није било -патогене интермедијарне експанзије или пермутације, а два су била не-проширена понављања (16 процената лажног открића).

Интерпретација

У нашој студији, секвенцирање целог генома за детекцију поновљених експанзија показало је високу осетљивост и специфичност, што је довело до идентификацијенеуролошкимпонављају се поремећаји експанзије код претходно недијагностикованих пацијената. Ови налази подржавају примену секвенцирања целог генома у клиничким лабораторијама за дијагнозу пацијената који имајунеуролошкимпрезентација у складу са поремећајем понављања експанзије.

Финансирање

Савет за медицинска истраживања, Одељење за здравство и социјалну заштиту, Национална здравствена служба Енглеске, Национални институт за здравствена истраживања и Иллумина.

Увод

Упркос недавном напретку у нашем разумевању генетске основе реткихнеуролошкимпоремећаја, до 70 процената пацијената са таквим поремећајима остаје генетски недијагностиковано.1–3 Делимично, то је због техничких изазова тестирања сложених и понављајућих генетских варијанти, укључујући поновљене експанзије; Процењује се да таква проширења погађају око 1 од 3000 људи (додатак п 1) и да су водећи узрок више од 40 неурогенетских поремећаја,4 укључујући Хантингтонову болест и крхки Кс синдром. Поремећаји поновљене експанзије су клинички и генетски хетерогени, а поновљена експанзија може бити повезана са различитим болестима. На пример, експанзије у Ц9орф72 могу се представити или као амиотрофична латерална склероза или фронтотемпорална деменција.5 Поновљене експанзије у различитим локусима такође могу да доведу до сличних фенотипских карактеристика, што их чини тешким за клиничко разликовање: понављање експанзије у најмање десет спиноцеребеларне атаксије је често заступљено као гени за атаксију одраслих. -почетна атаксија,6 и оне у Ц9орф72 и АР могу да изазову болест моторних неурона.7,8

Поремећаји експанзије понављања су узроковани повећањем броја понављајућих кратких тандем ДНК секвенци, а прагови патогености за сваки поремећај су специфични за локус. Величина проширења варира од мање од 30 понављања (нпр. у ЦАЦНА1А) до неколико хиљада јединица понављања (нпр. у ФМР1, ДМПК, Ц9орф72 и ФКСН, које се могу проширити до 5 кб). Експанзије понављања показују молекуларну нестабилност, што може довести до промена у величини понављања (генерално повећање дужине) кроз генерације и ткива.4 У овим условима, повећање броја понављања често доводи до ранијег почетка и теже болести у узастопним генерације.4 Педијатријски почетак поремећаја поновљене експанзије може се представити као мултисистемски синдроми без специфичних фенотипских потписа,9 и стога је већа вероватноћа да ће деца са овим поремећајима бити недовољно дијагностикована када је породична историја поремећаја поновљене експанзије одсутна него када је присутна.10– 12

Лабораторијска процена поновљених експанзија је типично ограничена на циљану молекуларну процену појединачног локуса вођену сумњивом клиничком дијагнозом коришћењем метода заснованих на ПЦР-у или Соутхерн блот метода,13 које могу бити скупе и дуготрајне. Поред тога, због разноврсних и преклапајућих фенотипских карактеристика ових поремећаја, локуси поновљене експанзије повезани са болешћу могу остати непроверени.14

Секвенцирање целог генома се појављује као дијагностичко средство прве линије код пацијената са ретким болестима15, али се до недавно сматрало да има ограничену способност да процени локусе који садрже поновљене експанзије.16 Напредак биоинформатике је, међутим, учинио изводљивим откривање болести. – изазивање поновљених експанзија из података о секвенцирању следеће генерације.17–22 Овде извештавамо о дијагностичкој процени приступа секвенцирању целог генома за откривање поновљених експанзија коришћењем ретроспективних ПЦР података и његовој клиничкој валидацији код пацијената у Пројекту 100000 генома који имао сумњу на неуролошки поремећај, недијагностикован претходним генетским тестирањем.

Методе

Дизајн студије и учесници

Ова евалуација секвенцирања целог генома за детекцију поновљених експанзија укључивала је и дијагностичку тачност и процену клиничке тачности. Дијагностичка тачност је процењена коришћењем података пацијената који су претходно били тестирани ПЦР-ом на поновљене експанзије за које се зна да узрокују неуролошке болести.4 Пацијенти су идентификовани из два извора: Геномски пројекат 100 000 и Геномска лабораторија са седиштем у Универзитетским болницама Кембриџ ( Кембриџ, Велика Британија). За оба скупа пацијената, ПЦР тестирање је обављено на узорцима пацијената од стране лабораторија у Националној здравственој служби (НХС) као део рутинске клиничке процене: за узорке у Пројекту 100000 генома, ПЦР тестови су урађени пре него што је регрутовање у пројекат од стране Универзитетски колеџ Лондон Хоспитал Неурогенетицс Лаборатори (Лондон, УК); узорци са ПЦР-потврђеним поновљеним експанзијама су добијени од пацијената тестираних у Геномској лабораторији са седиштем у Кембриџу. Пацијенти са ПЦР-позитивним и ПЦР-негативним резултатима тестова за понављање поремећаја експанзије идентификовани су за укључивање у нашу студију путем система лабораторијских записа; сви пацијенти су дали писмени информисани пристанак за коришћење свог узорка у сврху осигурања квалитета и истраживања и обуке, као део оптимизације и валидације клиничке услуге.

Секвенцирање целог генома сваког узорка је урађено у једној од две лабораторије: Геномицс Енгланд (Хинктон, УК) за узорке пројекта 100000 Геномес (н=254) и Иллумина Цлиницал Сервицес Лаборатори (ИЦСЛ; Сан Диего, ЦА, САД) за узорке добијене у Геномској лабораторији са седиштем у Кембриџу (н=150). Све у свему, овај скуп података је коришћен за део студије о дијагностичкој тачности и састојао се од ПЦР и података секвенцирања целог генома од 404 пацијента, покривајући 13 локуса који представљају најчешће неуролошке поремећаје понављања: 11 локуса повезаних са атаксијом и касним неуродегенеративни поремећаји са почетком (ХТТ, АР, АТН1, АТКСН1, АТКСН2, АТКСН3, АТКСН7, ЦАЦНА1А, ТБП, Ц9орф72 и ФКСН), један локус повезан са интелектуалним инвалидитетом (ФМР1) и један локус повезан са миотоничном дистрофијом (ДМПК). За сваки локус, подаци ПЦР теста су били доступни за најмање један проширени алел (додатак п 24).

Клиничка тачност је процењена испитивањем подударности поновљених експанзија, као што је откривено секвенцирањем целог генома, са сумњом на клиничку дијагнозу након ПЦР потврде код пацијената са сумњом на генетске неуролошке поремећаје (породични или рани облици атаксије, неуропатија, спастична параплегија, деменција болест моторних неурона,паркинсоновацпоремећаји кретања, интелектуални инвалидитет или неуромишићни поремећаји) регрутовани за пројекат 100000 генома 2013–17. Пројекат 100000 Генома је програм у Великој Британији за процену вредности секвенцирања целог генома код пацијената са незадовољеним дијагностичким потребама за ретке болести и рак. Након етичког одобрења за пројекат 100.000 генома од стране Етичког комитета за истраживање Јужне Кембриџа Источне Енглеске (референца 14/ЕЕ/1112), укључујући анализу података и враћање дијагностичких налаза пацијентима, ове пацијенте су регрутовали здравствени радници и истраживачи из 13 центара за геномску медицину у Енглеској и били су укључени у пројекат ако су они или њихов старатељ дали писмену сагласност да се њихови узорци и подаци користе у истраживању, укључујући ову студију. Пробанди и, ако је то изводљиво, остали чланови породице уписани су према критеријумима подобности одређеним за специфична стања ретких болести (додатак стр. 5–11). Пацијенти су регрутовани у пројекат 100000 генома након стандардног генетског тестирања у НХС-у, као што је наведено у критеријумима подобности. Стандардизовани основни клинички подаци су забележени коришћењем онтологије хумане фенотипизације (ХПО)23 у односу на моделе података специфичних за болест.24 Статус болести чланова породице, у односу на клиничку индикацију пробанда за тестирање, такође је прикупљен.

Да бисмо идентификовали узрочне поновљене експанзије код пацијената са генетски недијагностикованом болешћу, тестирали смо пацијенте са сумњивим генетским поремећајима који су у складу са болешћу поновљене експанзије. Пацијенти су одабрани на основу усаглашености њихове болести и термина ХПО са поновљеним поремећајима повезаним са експанзијом. Подаци секвенционирања целог генома пацијената су испитивани да би се тражила експанзија у одређеним скуповима понављања користећи четири различита панела за проширење понављања у складу са њиховим клиничким карактеристикама (Додатак п 5). Поновљене експанзије одабране за укључивање на ове панеле су најчешћи локуси понављања експанзије који изазивају неуролошке болести. Пацијенти са клиничким карактеристикама потенцијално компатибилним са више од једног поремећаја поновљене експанзије тестирани су на више панела. Ако је позив за поновљено проширење направљен коришћењем секвенцирања целог генома, извршено је потврдно тестирање помоћу ПЦР-а.

За сваког пацијента са потврђеном поновљеном експанзијом, локални клиничар је обавештен о потенцијалном дијагностичком резултату и процењен је допринос поновљене експанзије клиничким карактеристикама пацијента. За поновљене експанзије које су у потпуности или делимично објасниле клиничке карактеристике пацијента, издат је дијагностички извештај према локалним стандардним процедурама.

Процедуре

За историјске узорке НХС који су коришћени у делу наше студије о дијагностичкој тачности, поновљене експанзије су претходно тестиране коришћењем ПЦР амплификације и анализе фрагмената. Соутхерн блоттинг је изведен за велике експанзије Ц9орф72. У делу наше студије о клиничкој тачности, поновљене експанзије откривене секвенцирањем целог генома код пацијената из 100 000 Геномес пројекта су тестиране ПЦР-ом у узорцима ускладиштеним у генетским лабораторијама НХС. Додатни детаљи, укључујући секвенце прајмера, дати су у додатку (стр. 2–3, 25–26).

ДНК је припремљена за секвенцирање целог генома коришћењем припреме библиотеке без ПЦР-а ТруСек ДНК, а секвенцирање парних крајева од 150 бп или 125 бп је изведено на ХиСек 2000 или ХиСек Кс платформама у високопропусном постројењу за геноме за Геномицс Енгланд и на ИЦСЛ-у. . Геноми су секвенцирани до просечне дубине од 35× (31× до 37×; додатак п 27). Генотипизација са кратким тандемом је изведена коришћењем софтверског пакета ЕкпансионХунтер верзије 3.1.2.25,26 Укратко, ЕкпансионХунтер поново поравнава секвенцирање читања преко унапред дефинисаног скупа кратких тандем понављања да би проценио величину оба алела од појединца (додатак п 3).

ЕкпансионХунтер излаз укључује процену броја елемената који се понављају, укупне величине и границе поверења за сваки процењени локус. Смернице Удружења за медицинску патологију и Колеџа америчких патолога препоручују визуелну инспекцију варијантних позива током рутинске процене варијанти секвенцирања високе пропусности.27

Међутим, кратке тандемске варијанте понављања не могу се адекватно визуелизовати уобичајеним алатима за визуелизацију као што је Интегративе Геномицс Виевер.28 Да би се испитали подаци о секвенцирању читавог генома који су у основи сваког позива генотипа, коришћен је алат за визуелизацију графа, који омогућава директну визуализацију хаплотипова и одговарајуће гомиле читања. генотипова ЕкпансионХунтер (додатак стр. 3, 15). Визуелна инспекција графика гомилања обављена је на свим кратким тандемским поновљеним позивима секвенцирања целог генома да би се потврдило да је предвиђање ЕкпансионХунтер за алеле у потпуности садржано у сваком читању (тј. секвенца понављања је била мања од дужине читања секвенционирања); да се потврди присуство моноалелне или биалелне експанзије; да открије наводне лажно позитивне позиве; и за откривање лажно негативних алела у биалелним експанзијама понављања, као што је ФКСН (додатак, стр. 4, 16).

ЕкпансионХунтер процењује величину понављања на основу података секвенцирања целог генома анализом секвенцирања које у потпуности или делимично садржи кратко понављање у тандему. Ако је кратки алел тандем понављања краћи од дужине читања, ЕкпансионХунтер предвиђа тачну величину; ако је кратки алел тандем понављања дужи од дужине читања, ЕкпансионХунтер процењује величину понављања унутар ЦИ, у зависности од састава секвенце локуса, дубине секвенцирања и квалитета секвенцирања.

Статистичка анализа

Понављања смо класификовали као проширене секвенцирањем целог генома ако је величина коју је предвидео ЕкпансионХунтер била изнад граничне вредности премутације, или као непроширене ако је предвиђена величина била испод граничне вредности (додатак п 28).

Осетљивост и ЦИ за откривање експанзије понављања секвенцирања целог генома израчунати су као пропорција алела са проширеним понављањима међу претходно потврђеним ПЦР алелима са проширеним понављањима. Специфичност је процењена као удео непроширених алела међу претходно тестираним неекспандираним понављањима помоћу ПЦР-а. Потпуни опис статистичких формула дат је у додатку (п 1).

Да би се упоредиле величине понављања помоћу ПЦР-а са проценама величине понављања секвенцирањем целог генома, ПЦР-квантификовани алели су упоређени са величинама понављања које је предвидео ЕкпансионХунтер за алеле краће од дужине читања у свих 13 кратких тандемских локуса понављања. Конкорданција је израчуната на основу процента величина понављања које је предвидео ЕкпансионХунтер које су биле у сагласности са ПЦР-квантификованом величином, узимајући у обзир ПЦР грешку од плус или минус једно понављање. Статистичка анализа је извршена коришћењем Р статистичког софтвера верзије 3.6.3.

Улога извора финансирања

Дизајн студије, упис пацијената, прикупљање података и секвенцирање водили су запослени у Геномицс Енгланд-у и академски истраживачи. Запослени у Иллумини извршили су секвенцирање 150 узорака пацијената као планирану компоненту дијагностичке тачности секвенцирања читавог генома и развили ЕкпансионХунтер. Запослени у Геномицс Енгланд-у, академски истраживачи и коаутори РТХ, ЕД и МАЕ извршили су анализу и интерпретацију поновљених експанзија код пацијената регрутованих у 100 000 Геномес Пројецт. Извори финансирања нису имали никакву улогу у тумачењу података или писању извештаја.

Резултати

Дијагностичка тачност секвенцирања целог генома за откривање поновљених експанзија процењена је у односу на 793 ПЦР теста која су претходно обављена у оквиру НХС од 404 пацијента (64 пацијента су тестирана за више од једног понављања; слика 1). Од ових тестова, 183 су класификована као са проширеним понављањем, а 610 као без поновљене експанзије помоћу ПЦР-а, што је дало укупно 221 проширени и 1321 непроширени појединачни алел у 13 локуса болести (Додатак, стр. 24, 28). Секвенцирање целог генома је исправно класификовало 215 од 221 проширеног алела и 1316 од 1321 непроширеног алела у поређењу са резултатима ПЦР теста (додатак, стр. 27, 29), показујући почетну осетљивост од 97,3 процента (95 процената ЦИ 94·2–99 ·0) и специфичност од 99·6 процената (99·1–99·9; табела 1). Након визуелне корекције свих позива на основу квалитета очитавања, осетљивост се повећала на 99·1 проценат (96·8–99·9), а специфичност на 100 процената (99·7–100; слика 2А, табела 1). Визуелизација проширених алела омогућила је детекцију лажно позитивних резултата и рекласификацију свих лажно негативних алела у ФКСН, од којих је само један алел исправно класификован као проширен у узорцима са биалелним експанзијама (прилог стр. 17, 18).

Дужина понављања је квантификована помоћу ПЦР-а у 509 ПЦР тестова који су испитивали 945 алела у 13 локуса експанзије понављања. Корелације између ЕкпансионХунтер и ПЦР-а за величине понављања краће и веће од дужине читања секвенционирања (тј. 150 бп) приказане су у додатку (додатак стр. 19). Висока подударност је примећена за понављања краћа од дужине читања, са 92,7 процената (836 од 902) слагања између ПЦР-а и ЕкпансионХунтер-а. Уочена је варијабилност локуса, са високом подударношћу између ЕкпансионХунтер и ПЦР-а за АТКСН2, АТКСН7, ЦАЦНА1А и ХТТ, и ниском подударношћу за ДМПК или ТБП (додатак п 30). ЕкпансионХунтер је потценио дужине алела већих од читане, што је утицало на тачност позивања у ДМПК, ФМР1 и ФКСН (слика 2Б, додатак, стр. 19, 31).

Иако је ЕкпансионХунтер успео да исправно идентификује велике проширене алеле у ФМР1, ДМПК, Ц9орф72 и ФКСН (додатак п 29), предвиђене процене величине су имале тенденцију да буду ниже од оних добијених ПЦР-ом како се величина понављања повећавала унутар патогеног опсега, што је утицало на способност разликовања између великих и малих проширења у ДМПК, Ц9орф72 и ФКСН, или између пуних проширења и пермутација у ФМР1 (додатак стр 31). На пример, локуси са ПЦР процењеном дужином понављања већом од 200 понављања у ФМР1 и класификованим као пуна мутација имали су средњу величину понављања коју је ЕкпансионХунтер проценио од 92,6 (СД 17,8; додатак п 31).

Да бисмо тестирали способност откривања поновљене експанзије секвенцирањем целог генома да би се решила дијагноза претходно тестираних и генетски недијагностикованих пацијената, тестирали смо 11 631 пацијената са сумњивим генетским неуролошким поремећајем ангажованих у пројекту 100000 генома (слика 1). Подаци секвенционирања целог генома су процењени коришћењем четири различита панела за проширење понављања у складу са клиничким карактеристикама пацијента. Број пацијената тестираних са сваким од четири панела приказан је у табели 2.

Све у свему, открили смо и визуелно потврдили поновљене експанзије у узорцима од 105 пацијената (табела 2, додатак стр. 20, 33). Од тога, 81 узорак је био доступан за потврдно тестирање ПЦР-ом, а за 68 је потврђено да имају поновљено проширење (0·6 процената приноса): 45 (1·2 процента) од 3692 у панелу А, осам ({ {18}}·3 процента ) од 2743 на панелу Б, пет (0·6 процената) од 860 на панелу Ц и десет (0·1 проценат) од 6731 на панелу Д. Тринаест од 81 позива за проширење нису потврђене као патогене поновљене експанзије (стопа лажног откривања од 16 процената). Од тога, два су била непроширена алела у АТКСН1 и АТКСН2, четири су била ФМР1 позиви средње величине (додатак п 21), а седам су биле ФМР1 пермутације.

Клинички детаљи о 68 пацијената са поновљеним експанзијама потврђеним ПЦР-ом, укључујући њихову клиничку слику, идентификовану поновљено проширење и допринос поновљене експанзије клиничким карактеристикама пацијента дати су у табели 3; ХПО услови, величина понављања коју је проценио ЕкпансионХунтер и да ли је издат дијагностички извештај наведени су у додатку (стр. 33).

Експанзије су примећене код пацијената са широким спектром преклапајућих клиничких презентација тестираних са панелом А (табела 3, додатак п 22), укључујући поновљено проширење АТКСН2 код пацијената са Паркинсоновом болешћу која је рано реаговала на леводопу и историјом прогресивне церебеларне атаксије , и проширења АР код четири пацијента са клинички дијагностикованом Цхарцот-Марие-Тоотх болешћу, укључујући и једног са генетски потврђеном демијелинизирајућом неуропатијом (тј. Цхарцот-Марие-Тоотх болест тип 1, пацијент 42; додатак стр 33). Широк спектар претходних клиничких дијагноза примећен је код пацијената са патогеним поновљеним експанзијама.

На пример, код седам пацијената са амиотрофичном латералном склерозом или другом болешћу моторних неурона, експанзије су идентификоване у АР (н=4) и Ц9орф72 (н=3). Код пацијената са сумњом на наследну атаксију, идентификовали смо експанзије у локусима који нису били процењени као део рутинске дијагностичке обраде у оквиру НХС у време регрутовања, укључујући АТН1, АТКСН2, АТКСН3, АТКСН7, ЦАЦНА1А, ФКСН, ТБП и ХТТ ( табела 3). Такође смо открили поновљене експанзије код пацијената са клиничким карактеристикама које су у складу са алтернативним поремећајима поновљене експанзије, укључујући експанзију Ц9орф72 код раног почетка и породичне Паркинсонове болести (пацијент 24, табела 3) и поновљене експанзије у смањеном опсегу пенетрације у ХТТ (38 понављања) код две сестре са поремећајем кретања, деменцијом, депресијом и тешкоћама у говору (пацијенти 44 и 45), наглашавајући дијагностички изазов који представљају ови поремећаји који се понављају.

Утврђено је да осморо деце тестиране са панелом Б има велике експанзије ЦАГ понављања (слика 3), од којих је седам у потпуности објаснило клиничке карактеристике пацијента. Шест пацијената није имало информативну породичну анамнезу и није им понуђено поновно тестирање експанзије као део њихове клиничке процене у време регрутовања (пацијенти 48–53; табела 3, додатак п 33). Двоје од ове деце имало је велике ХТТ експанзије (90–100 ЦАГ понављања). Треба напоменути да је једно дете наследило понављање од родитеља који није био погођен без породичне историје Хунтингтонове болести. Породично тестирање је у току, али је у проширеној породици идентификован алел смањене пенетрације, што указује да се понављање проширило за преко 60 поновљених јединица у једној генерацији (пацијент 52). У време писања овог текста, нико у породици није показивао знакове Хантингтонове болести, а генетско саветовање и тестирање родитеља су у току. Двоје деце млађе од 5 година имало је велике поновљене експанзије у АТКСН7 и имало сложену мултисистемску болест. За једно од ове деце (пацијент 50), њихов родитељ је показао проблеме у ходу 2 године након уписа у пројекат 100.000 генома. Слично томе, откривено је да девојчица од 10 година са интелектуалним инвалидитетом има 99-поновну експанзију у АТКСН2, упркос чињеници да су оба родитеља означена као непромењена, а девојчица од 18 година са деменцијом има { {19}}поновно проширење у АТН1 (додатак стр. 33).

Откривено је пет експанзија у ДМПК (панел Ц), укључујући дете и мајку са клиничком дијагнозом мишићне дистрофије, код двоје браће и сестара са сумњом на дисталну миопатију и код адолесцената са урођеном миопатијом (пацијенти 54–58). Експанзије ФМР1 (панел Д) откривене су код девет дечака и једне девојчице, а дијагноза Фрагиле Кс синдрома је у потпуности или делимично објаснила присутне клиничке карактеристике (пацијенти 59–68).

Дискусија

Дијагноза поремећаја поновљене експанзије је изазовна у здравственој заштити због хетерогених и преклапајућих клиничких карактеристика и неспецифичних клиничких налаза, који се могу повећати у тежини са годинама и у свакој следећој генерацији. Поремећаји поновљене експанзије су међу најчешћим узроцима наследних неуролошких болести.4 Без обзира на то, пацијентима се може недовољно дијагностиковати, било зато што није обављено довољно генетског тестирања или зато што узрочне генетске варијанте тек треба да буду откривене. Приступи тестирању су тренутно фрагментирани, а пацијенти могу имати тестиран нетачан поновљени локус експанзије29 или добити молекуларни тест за другу класу варијанти због преклапања клиничких карактеристика са другим неуролошким генетским поремећајима.30

Секвенцирање целог генома је коришћено у више окружења као дијагностички тест прве линије за ретке неуролошке поремећаје, али се раније сматрало да има ниску способност откривања поновљених експанзија.16 Развијено је неколико алата за идентификацију поновљених експанзија из целог генома. секвенционирање у истраживачком окружењу,31 али ниједан од ових приступа није примењен на податке секвенцирања целог генома прикупљене од великог броја пацијената у једној здравственој служби. Представљамо доказе да алгоритам дизајниран за откривање поновљених експанзија из секвенцирања целог генома може поуздано проценити најчешћа поновљена проширења која изазивају болести и решити претходно генетски недијагностиковане случајеве у великој групи пацијената са неуролошким поремећајима. Наши резултати показују да секвенцирање целог генома може разликовати између непроширених и проширених алела са високом осетљивошћу и специфичношћу преко 13 поновљених локуса експанзије (који се могу додатно побољшати визуелном инспекцијом), може прецизно израчунати величину алела мањих од дужине читања , и може потценити величину великих проширења у ФМР1, ДМПК, ФКСН и Ц9орф72.

Када је детекција поновљених експанзија секвенцирањем целог генома процењена у односу на позитивне и негативне резултате претходно добијене у клиничким дијагностичким геномским лабораторијама коришћењем метода златног стандарда, пронашли смо минимум од 97,3 процента осетљивости и 99,6 процената специфичности. Штавише, показали смо да се и специфичност и осетљивост могу побољшати ручним курирањем гомиле читања, омогућавајући детекцију лажно позитивних резултата и рекласификацију лажно негативних алела у узорцима са биалелним експанзијама. Од 6731 пацијента тестираног на ФМР1 (панел Д), предвиђено је да ће 124 позива бити проширено. Успели смо да искључимо 97 визуелним прегледом као вероватне лажне позитивне резултате. Ово указује да би 1 од 54 теста секвенцирања читавог генома имао ФМР1 позив који би морао бити визуелно прегледан да би се одбацио потенцијални лажно позитиван позив. У току је рад на побољшању методе генотипизације ЕкпансионХунтер како би се смањио број лажно позитивних позива за ФМР1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 понављања) изазивају тежу болест, а спиноцеребеларна атаксија типа 36 (НОП56), за коју се експанзије веће од 650 понављања сматрају патогеним, а величине понављања од 15–650 сматрају се средњим и варијантама неизвесног значаја.

Идентификовано је више од 40 поновљених локуса експанзије; многи од ових локуса су тек недавно идентификовани и сада су повезани са раније необјашњивим стањима, укључујући церебеларну атаксију са неуропатијом и синдромом вестибуларне арефлексије (РФЦ1) 32 и миоклоничну епилепсију (САМД12).33 Најчешћи локуси поновљене експанзије који изазивају неуролошке болести били су одабрани за нашу студију на основу доступности узорака позитивне и негативне контроле.

Налази представљени овде сугеришу да би ЕкпансионХунтер требало да буде у стању да прецизно класификује непроширене и проширене алеле на било ком поновљеном локусу експанзије ако су непроширени алели мањи од дужине читања (тј. 150 бп). Иако већина поновљених локуса експанзије има алеле који су мањи од 150 бп када нису проширени, неке локусе за које је величина непроширеног алела близу 150 бп (нпр. НОТЦХ2НЛЦ)34 може бити теже генотиповати коришћењем овог приступа. За локусе где је проширено понављање значајно веће од дужине очитавања, секвенцирање целог генома може открити патогене експанзије (нпр. НОП56,35 РФЦ120,32). Нове технологије секвенцирања које се дуго читају могу понудити комплементарне приступе приликом генотипизације великих експанзија.36

Процена поновљених експанзија коришћењем секвенцирања целог генома код 11 631 недијагностикованих пацијената регрутованих у 100 000 Геномес Пројецт је дала 68 пацијената са објашњењима. Пацијенти су регрутовани у 100 000 Геномес Пројецт након стандардног генетског тестирања; стога, пропорција поновљених експанзија идентификованих у овој кохорти представља повећање дијагностичког приноса у односу на стандардно НХС тестирање, које укључује тестирање специфично за локус за поремећаје поновљене експанзије као што су ФКСН или ДМПК. Треба напоменути да се на неке дијагнозе није сумњало на основу клиничких карактеристика пацијента, укључујући шест педијатријских пацијената који нису имали познату породичну историју поремећаја поновљене експанзије. Просечне величине поновљене експанзије предвиђене секвенцирањем целог генома код педијатријских пацијената описаних у овој студији су знатно веће од средње вредности код одраслих, у складу са очекивањем да су веће експанзије повезане са ранијим и тежим почетком, чак и код деце. Потребан је даљи рад, али овај налаз сугерише да би процена патогености зависна од старости и поновљена процена патогености могла да подржи педијатријску дијагнозу смањењем потенцијалног ризика од идентификовања алела ризика код одраслих, што доводи до нежељеног предиктивног тестирања код деце.

Наши налази омогућавају успостављање тока клиничке дијагностике за секвенцирање целог генома (Додатак стр. 23). Предлажемо да се визуелна инспекција уради за све позиве класификоване као проширене ради откривања лажних позитивних резултата, и за биалелне експанзије за које је откривен само један проширени алел (нпр. ФКСН). Препоручујемо да лабораторије користе ЕкпансионХунтер за процену присуства проширења без придржавања процене величине и да изврше потврдно ПЦР тестирање као стандардну компоненту тока рада тестирања.

Ретке наследне болести укључују широк спектар клиничких карактеристика, чинећи геномско тестирање специфично за локус неефикасним, напорним и скупим. Представљамо доказе да се секвенцирање целог генома клиничког степена са потенцијалом за дијагностицирање низа ретких неуролошких болести које се обично представљају са једном базом, инделом или варијантом броја копија сада може проширити на поновљене експанзије. Пошто секвенцирање целог генома обезбеђује један тест који може да идентификује најчешће поновљене експанзије, као и омогућава истовремено тестирање тачкастих мутација и варијанти броја копија у генима повезаним са овим стањима, нуди могућност да се идентификује већина пацијената са овим хетерогеним поремећајима. који нису дијагностиковани коришћењем локус-специфичног тестирања. У ери нових терапија за ове поремећаје, рано откривање може постати кључно.37 Ови резултати подржавају примену секвенцирања целог генома за откривање поновљених експанзија у клиничким дијагностичким лабораторијама, приступ који је већ укључен у НХС Енгланд Натионал Геномиц Тест Дирецтори,38 за истраживање недијагностиковане ретке неуролошке болести.

Референце

1 Нго КЈ, Рекацх ЈЕ, Лее Х, ет ал. Дијагностички плафон за секвенцирање егзома код церебеларне атаксије и повезаних неуролошких поремећаја. Хум Мутат 2020; 41: 487–501.

2 Линцх ДС, Коутсис Г, Туцци А, ет ал. Наследна спастична параплегија у Грчкој: карактеризација раније неистражене популације коришћењем секвенцирања следеће генерације. Еур Ј Хум Генет 2016; 24: 857–63.

3 Грациола Ф, Гароне Г, Стрегапеде Ф, ет ал. Дијагностички принос циљаног панела гена за секвенцирање следеће генерације за поремећаје кретања код деце: 3-годишња кохортна студија. Фронт Генет 2019; 10: 1026.

4 Паулсон Х. Болести поновљене експанзије. Хандб Цлин Неурол 2018; 147: 105–23.

5 Госсие Х, Енгелборгхс С, Ван Броецкховен Ц, ван дер Зее Ј. Ц9орф72 фронтотемпорална деменција и/или амиотрофична латерална склероза. Сијетл, Вашингтон: Универзитет у Вашингтону, 2015.

6 Клоцкгетхер Т, Мариотти Ц, Паулсон ХЛ. Спиноцеребеларна атаксија. Нат Рев Дис Примерс 2019; 5: 24.

7 Схаккоттаи ВГ, Фогел БЛ. Клиничка неурогенетика: аутозомно доминантна спиноцеребеларна атаксија. Неурол Цлин 2013; 31: 987–1007.

8 Ла Спада А. Спинална и булбарна мишићна атрофија. У: Адам МП, Ардингер ХХ, Пагон РА, ет ал, ур. ГенеРевиевс. Сијетл, Вашингтон: Универзитет у Вашингтону, 1999.

9 Гоуссе Г, Натурал Х, Тоураине Р, ет ал. Смртоносни облик спиноцеребеларне атаксије типа 7 са раним почетком у детињству. Арцх Педиатр 2018; 25: 42–44.

10 Ансорге О, Гиунти П, Мицхалик А, ет ал. Агрегација и убиквитинација атаксин-7 код инфантилног СЦА7 са 180 ЦАГ понављања. Анн Неурол 2004; 56: 448-52.

11 Рамоцки МБ, Цхапиески Л, МцДоналд РО, Фернандез Ф, Малпхрус АД. Спиноцеребеларна атаксија тип 2 са когнитивном регресијом у детињству. Ј Цхилд Неурол 2008; 23: 999–1001.

12 Митцхелл Н, ЛаТоуцхе ГА, Нелсон Б, Фигуероа КП, Валкер РХ, Соберинг АК. Спиноцеребеларна атаксија са почетком у детињству 3: дистонија језика као рана манифестација. Тремор Отхер Хиперкинетиц Мов 2019; објављено на мрежи 13. септембра.

13 Бирд ТД. Миотонична дистрофија типа 1. У: Адам МП, Ардингер ХХ, Пагон РА, ет ал, ур. ГенеРевиевс. Сијетл, Вашингтон: Универзитет у Вашингтону, 2019.

14 Аидин Г, Декомиен Г, Хоффман С, Гердинг ВМ, Епплен ЈТ, Арнинг Л. Учесталост експанзија понављања СЦА8, СЦА10, СЦА12, СЦА36, ФКСТАС и Ц9орф72 код пацијената са СЦА негативним за најчешће подтипове СЦА. БМЦ Неурол 2018; 18: 3.

15 Турро Е, Астле ВЈ, Меги К, ет ал. Секвенцирање целог генома пацијената са ретким болестима у националном здравственом систему. Природа 2020; 583: 96–102.

16 Асхлеи ЕА. Ка прецизној медицини. Нат Рев Генет 2016; 17: 507–22.

17 Лиу ХИ, Зхоу Л, Зхенг МИ, ет ал. Дијагностичка и клиничка корисност секвенцирања целог генома у кохорти недијагностикованих кинеских породица са ретким болестима. Сци Реп 2019; 9: 19365.

18 Мусави Н, Схлеизер-Бурко С, Ианицки Р, Гимрек М. Профилисање пејзажа тандемских понављања широм генома. Нуклеинске киселине Рес 2019; 47: е90.

19 Танкард РМ, Беннетт МФ, Дегорски П, Делатицки МБ, Лоцкхарт ПЈ, Бахло М. Детецтинг експанзије тандемских понављања у кохортама секвенцираним са подацима секвенцирања кратког читања. Ам Ј Хум Генет 2018; 103: 858–73.

20 Рафехи Х, Сзмулевицз ДЈ, Беннетт МФ, ет ал. Идентификација проширених понављања заснована на биоинформатици: нереферентна експанзија интроничног пентамера у РФЦ1 узрокује ЦАНВАС. Ам Ј Хум Генет 2019; 105: 151–65.

21 Гросс АМ, Ајаи СС, Рајан В, ет ал. Варијанте броја копија у секвенцирању клиничког генома: примена и тумачење за ретку и недијагностиковану болест. Генет Мед 2019; 21: 1121–30.

22 Трост Б, Енгцхуан В, Нгуиен ЦМ, ет ал. Детекција тандемских ДНК понављања у целом геному која су проширена код аутизма. Природа 2020; 586: 80–86.

23 Робинсон ПН, Кохлер С, Бауер С, Сеелов Д, Хорн Д, Мундлос С. Онтологија људског фенотипа: алат за означавање и анализу људских наследних болести. Ам Ј Хум Генет 2008; 83: 610–15.

24 Геномика Енглеска. Модели клиничких података стања ретких болести. 2018. хттпс://ввв.геномицсенгланд.цо.ук/?впдмдл=5500 (приступљено 4. августа 2021).

25 Долзхенко Е, ван Вугт ЈЈФА, Схав РЈ, ет ал. Детекција експанзија дугог понављања из података секвенце целог генома без ПЦР-а. Геноме Рес 2017; 27: 1895-903.

26 Долзхенко Е, Десхпанде В, Сцхлесингер Ф, ет ал. ЕкпансионХунтер: алатка заснована на секвенцама за анализу варијација у регионима кратких тандем понављања. Биоинформатика 2019; 35: 4754–56.

27 Рои С, Цолдрен Ц, Карунамуртхи А, ет ал. Стандарди и смернице за валидацију биоинформатичких цевовода следеће генерације за секвенцирање: заједничка препорука Удружења за молекуларну патологију и Колеџа америчких патолога. Ј Мол Диагн 2018; 20: 4–27.

28 Робинсон ЈТ, Тхорвалдсдоттир Х, Винцклер В, ет ал. Интегративни прегледник геномике. Нат Биотецхнол 2011; 29: 24–26.

29 Сцхнеидер СА, ван де Варренбург БПЦ, Хугхес ТД, ет ал. Фенотипска хомогеност приказа налик Хунтингтоновој болести у породици СЦА17. Неурологи 2006; 67: 1701–03.

30 Сцхнеидер СА, Бирд Т. Хунтингтонова болест, сличице Хунтингтонове болести и бенигна наследна хореја: шта је ново? Мов Дисорд Цлин Працт 2016; 3: 342–54.

31 Бахло М, Беннетт МФ, Дегорски П, Танкард РМ, Делатицки МБ, Лоцкхарт ПЈ. Недавни напредак у откривању поновљених проширења са секвенцирањем следеће генерације кратког читања. Ф1000Рес 2018; 7: 736.

32 Цортесе А, Симоне Р, Сулливан Р, ет ал. Биалелна експанзија интроничног понављања у РФЦ1 је чест узрок атаксије са касним почетком. Нат Генет 2019; 51: 649–58.

33 Исхиура Х, Дои К, Митсуи Ј, ет ал. Експанзије интроничног ТТТЦА и ТТТТА понављања код бенигне одрасле породичне миоклоничне епилепсије. Нат Генет 2018; 50: 581–90.

34 Исхиура Х, Схибата С, Иосхимура Ј, ет ал. Некодирајуће експанзије ЦГГ понављања код неуронске интрануклеарне инклузивне болести, окулофарингодисталне миопатије и болести која се преклапа. Нат Генет 2019; 51: 1222–32.

35 Рафехи Х, Сзмулевицз ДЈ, Попе К, ет ал. Брза дијагноза спиноцеребеларне атаксије 36 у породици од три генерације користећи кратко читане податке секвенцирања целог генома. Мов Дисорд 2020; 35: 1675–79.

36 Мантере Т, Керстен С, Хоисцхен А. Дуго читано секвенцирање које се појављује у медицинској генетици. Фронт Генет 2019; 10: 426.

37 Еллерби ЛМ. Поремећаји експанзије понављања: механизми и терапија. Неуротхерапеутицс 2019; 16: 924–27.

38 Национални здравствени систем. Национални директоријум геномских тестова: критеријуми за тестирање ретких и наследних болести. октобар 2021.