13-седмична студија субхроничне токсичности 2-(л-ментокси)етанола код Ф344 пацова

Увод

2-(1-ментокси)етанол (ЦАС бр. 38618-23-4) је бистра и безбојна течност са карактеристичним мирисом и широко се користи као арома. Заједнички стручни комитет ФАО/ВХО за адитиве у храни (ЈЕЦФА) је оценио 2-(л-метокси)етанол као арома, категорисан као супстанце структурно повезане са ментолом1. На основу структурне класе арома, 2-(л-метокси)етанол је распоређен у класу И. У Сједињеним Државама и Европи, нивои уноса од 2-(л-метокси)етанола код људи је процењено на 12 уг/особи/дан и 0.01 уг/особи/дан, респективно, оба испод прага класе И од 1800 уг/особи/дан. На основу ових процена, сматра се да 2-(1-ментокси)етанол можда не представља забринутост за безбедност током рутинске употребе као ароме.

ПРИРОДНИ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ СЕКСУАЛНЕ ФУНКЦИЈЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 мг/кг телесне тежине [ТВ])1. Упркос употреби 2-(1-ментокси)етанола као ароме, доступни су ограничени подаци о токсичности овог једињења поновљених доза. Наша лабораторија је истражила токсичност неколико адитива за храну, укључујући репрезентативне ароме из сваке категорије, на моделима глодара2–7. Да бисмо разјаснили токсиколошки профил и утврдили ниво без уочених штетних ефеката (НОАЕЛ), спровели смо 13-недељну студију субхроничне токсичности 2-(1-ментокси)етанола, која је била орално даване Ф344 пацовима путем сонде.

Материјали и методе

Тест хемикалија

2-(1-ментокси)етанол (Лот бр. 5И0002, чистоћа 99,9%) произвођача Такасаго Инт. Цорп. (Токио, Јапан) обезбедило је Одељење за стандарде и процену, Одељење за безбедност хране, Министарство здравља, рада и благостања, Јапан, уз подршку Јапанског удружења за укусе и мирисне материјале (Токио, Јапан). Иако је испитивана супстанца обезбеђена као мешавина оптичких изомера (ЦАС бр. 38618-23-4), произвођач је потврдио да је л-енантиомер (ЦАС бр. 75443-64-0). Орална гаважа са кукурузним уљем (Вако Пуре Цхемицал Индустриес, Осака, Јапан) као вехикулум је одабрана као пут примене због нерастворљивости у води и испарљивости 2-(1-ментокси)етанола. Раствори 2-(1-ментокси)етанола припремани су свакодневно, непосредно пре примене. Након складиштења од 2 сата на собној температури, преостали односи 2-(1-ментокси) етанола у раствору од 4, 40 и 400 мг/мЛ су потврђени као 96,8%, 99,8% и 96,5% , односно гасном хроматографијом (Јапан Инспецтион Ассоциатион оф Фоод анд Фоод Индустри Енвиронмент, Токио, Јапан).

Експерименталне животиње

Укупно, 40 мужјака и 40 женки пацова без специфичних патогена (Ф344/ДуЦрлЦрљ, 5 недеља) купљено је од Цхарлес Ривер Лабораториес Јапан (Јокохама, Јапан) и коришћено након аклиматизације недељу дана. Током студије, животиње су биле смештене у поликарбонатним кавезима са меком простирком, одржаване у просторији са системом баријере за контролу циклуса светлост/мрак (12 х), вентилацију (брзина размене ваздуха од 18 пута/х), температуру ( 24 ± 1 степен), и релативна влажност (55 ± 5%). Кавези и постељина су замењени два пута недељно. Свака животиња је имала бесплатан приступ води из славине и основној исхрани (ЦРФ-1; оријентални квасац, Токио, Јапан). На почетку експеримента, животиње су насумично распоређене у четири групе од по 10 мужјака и женки пацова, на основу телесне тежине мерене непосредно пре почетка третмана испитиваном хемикалијом.

Дизајн студија

У прелиминарној {{0}}дневној студији која процењује 2-(1-ментокси) етанол примењен у дозама од 0, 200, 400 и 800 мг/кг телесне масе/ дана, апсолутна и релативна тежина јетре су значајно повећане у свим третираним групама оба пола (подаци нису приказани). На основу ових резултата, одабрали смо дозе 2-(1-ментокси) етанола од 0, 15, 60 и 250 мг/кг ТМ/дан за давање и мужјацима и женкама пацова у садашњем {{ 13}}недељна студија токсичности.

Свакодневно су процењивани општи услови и морталитет. Телесна тежина, као и количине унесене и преостале исхране мерене су једном недељно током експерименталног периода. Сви пацови су гладни преко ноћи по завршетку третмана, а узорци крви за хематологију и биохемију серума су сакупљени из абдоминалне аорте под дубоком инхалационом анестезијом коришћењем изофлурана. Дизајн студије је био према Смерницама за одређивање адитива у храни и ревизији стандарда за употребу адитива за храну Јапана (1996) и одобрен од стране Комитета за негу и коришћење животиња Националног института за здравствене науке, Јапан.

Хематологија и биохемија серума

Следећи хематолошки параметри су анализирани помоћу ПроЦите Дк аутоматских хематолошких анализатора (ИДЕКСКС Лабораториес, Вестброок, МЕ, УСА): број белих крвних зрнаца (ВБЦ), број црвених крвних зрнаца (РБЦ), концентрација хемоглобина (ХГБ), хематокрит (ХЦТ), средњи корпускуларни волумен (МЦВ), средњи корпускуларни хемоглобин (МЦХ), средња концентрација корпускуларног хемоглобина (МЦХЦ), број тромбоцита (ПЛТ) и диференцијалне ћелије леукоцита, укључујући неутрофиле (Неут), лимфоците (лимф), моноците (моно), еозинофиле (Еосино) и базофили (Басо). Биохемијска анализа серума је урађена од стране Ориентал Иеаст за следеће параметре: укупни протеин (ТП), албумин (Алб), однос албумин/глобулин (А/Г), укупан билирубин (Бил), глукоза, укупан холестерол (Т-Цхол), триглицерид (ТГ), азот урее (БУН), креатинин (Цре), калцијум (Ца), неоргански фосфор (ИП), натријум (На), калијум (К), хлор (Цл), аспартат аминотрансфераза (АСТ), аланин аминотрансфераза (АЛТ), алкална фосфатаза (АЛП) и -глутамил транспептидаза (-ГТП).

Тежина органа и хистопатолошка процена

Урађена је комплетна обдукција за све животиње, а мерени су мозак, тимус, плућа, срце, слезина, јетра, надбубрежне жлезде, бубрези, тестиси и јајници. Ови органи, као и ткива из кичмене мождине, тригеминалног нерва, хипофизе, носне дупље, пљувачних жлезда, језика, једњака, трахеје, аорте, штитне жлезде, паратироидне жлезде, панкреаса, желуца, танког и дебелог црева и месентебуларног црева лимфни чворови, вагина, материца, мокраћна бешика, простата, семенске везикуле, епидидимис, фемур и грудна кост са коштаном сржом, пршљенови, скелетним мишићима, ишијадичним нервом, кожом и млечном жлездом, фиксирани су у 10% неутралном пуферу са формалином; затим су припремљени парафински пресеци и обојени хематоксилином и еозином за хистопатолошки преглед. Тестиси и очи са Хардеровим жлездама су фиксиране у Боуин-овом фиксатору и Давидсоновом раствору, респективно. Коштано ткиво, укључујући носну шупљину, пршљенове, грудну кост и бутну кост, декалцификовано је мешавином 10% мравље киселине и 10% пуферованог формалина до 2 недеље. Хистопатолошка процена је обављена за сва ткива добијена од животиња у контролној групи и група је примењивала највећу дозу осим ако нису примећене било какве лезије повезане са третманом.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ ИМУНИТЕТА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Имунохистохемија за 2у-глобулин

Код мужјака пацова, акумулација 2у-глобулина у бубрегу је испитивана имунохистохемијском анализом парафинских пресека. За проналажење антигена, делови добијени од 5 пацова у свакој групи су инкубирани са протеиназом К (ДАКО, Глоструп, Данска) 1 мин на собној температури. Сви пресеци су потопљени у 3% раствор Х2О2/метанола током 10 минута на собној температури ради инактивације активности ендогене пероксидазе. Након блокирања неспецифичних реакција са 10% нормалног зечјег серума, секције су инкубиране са примарним антителом за 2углобулин (разблажено 1:400; анти-пацовско 2у-глобулин антитело; Р&Д Системс, Миннеаполис, МН, САД) преко ноћи на 4 степена 8. Визуелизација везивања антитела је изведена коришћењем ВецтаСтаин Елите АБЦ комплета (Вецтор Лабораториес, Бурлингаме, Калифорнија, САД) и 3,3′-диаминобензидина. Сви пресеци су обојени хематоксилином.

Статистичка анализа

Варијације у вредностима података за телесну тежину током експерименталног периода, као и за хематологију, биохемију серума и тежине органа, процењене су на хомогеност коришћењем Бартлетовог теста. Једносмерна анализа варијансе и Крускал-Волисов тест, респективно, коришћени су за хомогене и хетерогене податке. У одређивању статистички значајних разлика, Дуннеттов тест вишеструког поређења је коришћен за поређење контролних и третираних група. Поређења хистопатолошких инциденција и степена су анализирана коришћењем Фишеровог теста егзактне вероватноће и Манн-Вхитнеијевог У теста, респективно. П вредности од<0.05 were considered statistically significant.

Резултати

Параметри у животу, хематологија и биохемија серума

Током експерименталног периода нису забележени никакви значајни клинички знаци, а све животиње су преживеле до заказане обдукције. Штавише, нису примећене значајне разлике у телесној тежини и дневном уносу хране код мужјака и женки пацова (Слике 1А и Б).

Подаци о хематологији и биохемији серума приказани су у табелама 1 и 2, респективно. Хематолошке анализе су откриле значајно смањење ХГБ, ХЦТ, МЦВ и МЦХ и повећан ПЛТ код мужјака пацова који су примали 250 мг/кг ТМ/дан 2-(1-ментокси)етанола (Табела 1). У биохемији серума, примећено је значајно повећање ТП, Т-Цхол и Ца и смањење Бил и АЛП код мушкараца из групе од 250 мг/кг (Табела 2). Значајно повећање Цре и смањење А/Г примећено је код мушкараца из група од 60 и 250 мг/кг. Код жена, значајно повећање Ца и смањење АЛП је забележено у групама од 60 и 250 мг/кг, док су повишени Т-Цхол и смањени А/Г, Бил, ТГ, АСТ и АЛТ откривени у групама од 250 мг. /кг група. Иако је значајно повећање ТГ и смањење Цл примећено код мушкараца који су примали 60 мг/кг, недостатак било каквог односа дозе сугерише да ове разлике нису повезане са излагањем испитиваној супстанци.

Тежине органа

Подаци за тежину органа су сумирани у табели 3. Апсолутна и релативна тежина јетре су значајно повећане код оба пола у групи од 250 мг/кг (Табела 3). Значајно повећање релативне тежине јетре примећено је код мушкараца из групе од 60 мг/кг. Код мушкараца, апсолутна и релативна тежина бубрега су значајно повећане у групама од 60 и 250 мг/кг. У групи мушкараца од 250 мг/кг забележено је значајно повећање апсолутне и релативне тежине надбубрежних жлезда и релативне тежине слезине и тестиса.

Хистопатологија и имунохистохемија

Подаци за хистопатолошке и имунохистохемијске налазе сумирани су у табелама 4 и 5, респективно. Хистопатолошки налази су открили да је учесталост акумулације еозинофилних гранула (Слика 2А–Д), базофилних тубула и хијалинског гипса, као и фокалне интерстицијалне инфламације у бубрегу, значајно повећана у групама које су третирале искључиво мушкарце у поређењу са контролном групом. група (табела 4). На основу имунохистохемијских анализа, мужјаци пацова третирани испитиваном супстанцом показали су повећање имунореактивности 2у-глобулина у епителним ћелијама проксималних тубула, показујући јасну зависност од дозе (Слика 2Е–Х) (Табела 5).

На обдукцији, један мужјак пацова у групи од 250 мг/кг показао је озбиљно увећање десног бубрега због хистолошки карактеристичног нефробластома. Иако је нефробластом неуобичајен код већине сојева пацова9, овај случај се сматра случајним, јер ниједна друга животиња није имала сличне лезије. Поред тога, у студијама оралне канцерогености, инциденција спонтаног нефробластома код мужјака Ф344/ДуЦрлЦрљ пацова наводно се кретала између 0–2,0%10. Иако је неколико лезија спорадично откривено у другим органима, нису биле очигледне значајне промене зависне од третмана у инциденци ових лезија.

Дискусија

До данас, ЈЕЦФА је оценила 24 ароме, укључујући 2-(1-ментокси) етанол, као супстанце структурално повезане са ментолом, и сви су наведени као „без забринутости за безбедност“ на тренутним процењеним нивоима уноса1, 11. 2-(1-Ментокси)етанол је класификован у подгрупу алицикличних алкохола или етра и сматра се да је примарно коњугован са глукуронском киселином, након чега следи излучивање у урину1. Иако су оралне вредности ЛД50 ових супстанци код глодара релативно високе, подаци из студија токсичности поновљених доза остају ограничени. 13-недељна студија токсичности поновљених доза је открила да ментил пиролидон карбоксилат (ЦАС бр. 68127-22-0), једињење структурно повезано са ментолом, може бити повезано са повећаном релативном тежином јетре и бубрега код мушкараца и жена Вистар пацови. Акумулација 2у-глобулина у проксималним тубулима мужјака пацова је такође примећена при дози од 1,111 мг/кг ТМ/дан, а НОАЕЛ је одређен као 109 мг/кг ТМ/дан1.

У тренутној 13-недељној студији субхроничне токсичности 2-(1-ментокси)етанола, нису примећене токсиколошке промене у општем стању, телесној тежини и уносу хране. Након хематолошке процене, приметили смо смањење ХГБ (96,6% до контролних средњих вредности), ХЦТ (96,3%), МЦВ (98,4%) и МЦХ (98,2%) и повећање ПЛТ (111%) код мушкараца. 250 мг/кг групе, за које се сматрало да су токсиколошки утицаји третмана 2-(1-ментокси)етанолом. И апсолутна (115% код оба пола) и релативна (119% код мушкараца и 111% код жена) тежине јетре су значајно повећане код оба пола у групама од 250 мг/кг. Иако није било хистопатолошких промена у јетри, повећани су нивои серумског Т-Цхол (110% код мушкараца и 121% код жена) и ТП (105% код мушкараца) и смањење ТГ (60,1% код жена) у 250 мг/кг групе указују на токсичне промене повезане са метаболизмом липида и синтезом протеина у јетри. Такође су откривени смањени ХГБ и МЦХ и повишени ПЛТ, Т-Цхол и ТП код мушкараца и смањен ТГ и повећана апсолутна и релативна тежина јетре код оба пола, са статистичким значајем у 28-дневној прелиминарној студији (подаци нису приказани ), потврђујући да ови измењени хематолошки и биохемијски параметри серума, као и тежина јетре, нису били случајни, већ ефекти повезани са испитиваном супстанцом. Насупрот томе, значајно повећање релативне тежине јетре откривено у групи мушкараца од 60 мг/кг у овој студији није било праћено повећањем апсолутне тежине или променама сродних биохемијских параметара, што сугерише да је ово повећање била адаптивна промена.

ПРИРОДНИ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ СЕКСУАЛНЕ ФУНКЦИЈЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Сматра се да је значајно повећана апсолутна (120%) и релативна (118%) тежина надбубрежних жлезда у групи од 250 мг/кг мушкараца повезана са испитиваном хемикалијом. Штавише, повећана апсолутна и релативна тежина надбубрежних жлезда код оба пола показала је јасну зависност од дозе у 28-дневној прелиминарној студији (подаци нису приказани), што указује на повезаност са испитиваним хемијским третманом. Иако хипертрофија надбубрежне жлезде може бити последица стреса, није било налаза који би указивали на стрес, као што је смањено повећање телесне тежине или атрофија тимуса и других лимфоидних органа, како у садашњим тако и у прелиминарним студијама. С обзиром да можда нема хистопатолошких промена у надбубрежној жлезди чак и са поремећеном производњом глукокортикоида у случајевима инхибиције ензима повезаних са стероидогенезом12, не може се искључити могућност да је повећана тежина надбубрежне жлезде токсичан налаз. Насупрот томе, повећане релативне тежине слезине и тестиса у групи мушкараца од 250 мг/кг, које нису примећене у прелиминарној студији, сматране су токсиколошки безначајним због одсуства хистопатолошких лезија или значајно повећане апсолутне тежине. Слично, биохемија серума је открила смањење А/Г и повећање Ца код оба пола, за шта се сматрало да нема токсиколошки значај, с обзиром да нису откривене абнормалности у сродним параметрима. Штавише, смањени нивои Бил и АЛП код оба пола и смањени АСТ и АЛТ код жена били су у супротности са очекиваним токсичним ефектима и сматрани су да нису значајни.

Хронична нефропатија карактерисана базофилним тубулима, хијалином и фокалном интерстицијском инфламацијом уочена је са статистичким значајем код мушкараца свих третираних група. Поред тога, повећана серумска Цре и апсолутна и релативна тежина бубрега откривена је у групама мушкараца од 60 и 250 мг/кг; ове промене нису примећене у групама за лечење жена. У овим случајевима, степен акумулације еозинофилних гранула у проксималним тубуларним епителним ћелијама је повећан на привидно дозно зависан начин. Ове грануле су имунохистохемијски потврђене као 2у-глобулин, што указује на појаву 2у-глобулинске нефропатије. 2у-глобулини везани за одређене хемикалије, као што је д-лимонен, акумулирају се у лизозомима и примећују се у проксималним тубулима као еозинофилне или хијалинске грануле9. Ова акумулација може оштетити епителне ћелије, што доводи до хроничне прогресивне нефропатије и последичног формирања тумора9. Дакле, иако НОАЕЛ за 2-(1-ментокси)етанол повезан са 2у-глобулинском нефропатијом у бубрезима мушких пацова није идентификован, овај тип нефропатије је наводно специфичан за мушке пацове и стога није релевантан за људе процена ризика13. Повећан ризик од бубрежне инсуфицијенције посредован путем механизама повезаних са акумулацијом 2у-глобулина је врло мало вероватан, пошто овај протеин нема код људи14. Стога се сматрало разумним искључити промене повезане са хроничном нефропатијом примећене код мушкараца из одређивања НОАЕЛ.

У закључку, садашња 13-недељна студија субхроничне токсичности показала је да третман са 250 мг/кг телесне масе дневно 2-(1-ментокси) етанолом изазива токсичне промене у хематологији, биохемији серума и тежини органа код мужјака и женки Ф344 пацова. На основу уочених резултата, НОАЕЛ 2-(1-ментокси)етанолапроцењено је као 60 мг/кг ТМ/дан за оба пола.

ПРИРОДНИ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ СЕКСУАЛНЕ ФУНКЦИЈЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%