Акутна изложеност коже ултраљубичастом светлу изазива упалу бубрега посредовану неутрофилима

Ми и други смо показали да УВ светлост изазива брзу инфилтрацију неутрофила у кожу (6, 7). Иако неутрофили главни доприносе запаљењу на местима локалног оштећења, недавно је познато да неутрофили такође могу бити смештени у органима удаљеним од примарног места упале (8-10), где доприносе повреди плућног ткива кроз производњу реактивног кисеоника. врсте (РОС) (11) или активирају адаптивни имуни систем у лимфним чворовима и коштаној сржи (9, 12). Сматра се да код СЛЕ неутрофили играју важну улогу у локалним и системским болестима. Неутрофили су присутни у лезијама коже пацијената са СЛЕ (13, 14) и убубрегаткива пацијената са ЛН (15, 16). Висока експресија неутрофилног генског потписа је снажан предиктор активне болести, укључујући ЛН и кожне нападе (17, 18). Проинфламаторни гранулоцити ниске густине (ЛДГ) су повећани посебно код пацијената са кожним обољењима (19). Иако ови налази имплицирају неутрофиле у локалној повреди ткива код СЛЕ, да ли неутрофили обезбеђују патогену везу између упале коже иповреда бубрегасе не разуме.

Да би се разјаснило како излагање коже УВ светлу утиче набубрегаи улогу неутрофила у овим процесима, проценили смо промене убубрежниекспресија гена у складу са миграцијом неутрофила. Открили смо да акутна изложеност коже УВ светлу стимулише запаљенске процесе убубрег,укључујући експресију молекула ендотелне адхезије, инфламаторних медијатора, маркера повреде и пролазне протеинурије. Посебно смо открили да су неутрофили мигрирали убубреганакон излагања УВ светлу на начин који зависи од ИЛ-17А, локализујући се у тубулоинтерстицијалним (ТИ) областима где су испољиле проинфламаторне фенотипове. Укинуто блокирање трговине неутрофилима третманом анти-Г-ЦСФ имуноглобулином (ИгГ)бубрежнизапаљење и спречена уп-регулација маркера тубуларне повреде. Заједно, ови налази показују да изложеност коже УВ светлу изазива субклиничкебубрежниинфламаторни и повредни процеси посредовани неутрофилима.

Резултати

Изложеност коже УВ светлости изазива субклиничку повреду бубрега.Излагање сунчевој светлости је повезано са погоршањем системских симптома и појавом избијања болести код пацијената са СЛЕ, укључујући нефритис (2–4). Стога смо прво питали да ли акутна стерилна упала на кожи изазвана једнократним излагањем ултраљубичастом Б (УВБ) светлу (500 мЈ/цм2) код црних 6 (Б6) мишева доводи до промена убубрега, укључујући запаљење, повреде и протеинурију (слика 1А). Плућа су изабрана као контролни орган, јер није пријављена веза између фотосензитивности и клиничке плућне болести код СЛЕ. Укупно 500 мЈ/цм2 УВБ светлости код Б6 мишева је дефинисано као две минималне еритематозне дозе (20), референтна доза која се користи за протестовање људи (21). Анализа експресије гена перфузиранихбубрега tissues (Fig. 1A) revealed up-regulation in the gene expression of adhesion molecules vcam- 1 and e-selectin on days 1 and 2 after UVB light exposure (Fig. 1 B and C). In contrast, vcam-1 and e-selectin expression demonstrated a downward trend in the lung (SI Appendix, Fig. S1). We also observed a >10-фолдбубрежнииндукција у с100А9, неутрофилном медијатору повезаном саоштећење бубрега(22), као и повећана експресија с100А6, протеина који везује калцијум који је повезан са повредом тубула (23) (Слика 1 Д и Е). Док је индукција с100А9 откривена у плућима, експресија гена с100А6 остала је непромењена у плућима (СИ додатак, слика С1). Инфламаторни одговор убубрегаје такође био повезан са раним повећањем експресије ил-1 (1. и 2. дан након УВ), док је било минималне или никакве промене у тнф или ил-6 (слика 1Ф). Експресија Ил-1 није откривена у плућима до 6 дана након излагања коже УВБ светлости (СИ додатак, слика С1). Брза индукција експресије цкцл12, хемокина који луче гломерули и тубули и који је укључен уповреда бубрега(24), пронађена је и убубрегаали не и плућа (слика 1Г и СИ додатак, слика С1). Стога, повреде коже изазване УВБ светлошћу изазивају брзобубрежнипроинфламаторни процеси, док се мање промене примећују у плућима.

Поред проинфламаторног одговора уоченог убубрег,и протеинурија и однос албумин/креатинин у урину су се повећали у првих неколико дана након излагања коже УВБ светлости (Слика 1 Х и И). Овај брзи ефекат нафункцију бубрегаје праћено појачаном регулацијом у експресији липокалина-2 иповреда бубрегамолекул 1 (ким-1) (сл. 1 Ј и К), маркери цевастихоштећење бубрегакоји се такође примећују у ЛН (25, 26). Упркос пролазној природи протеинурије, експресија овихповреда бубрегамаркери су постојали до 6. дана (сл. 1 Ј и К), вероватно одражавајући поправку ткива.

Упала коже изазвана УВ светлом резултира миграцијом неутрофила у бубрег.Да бисмо истражили да ли неутрофили учествују у системском инфламаторном одговору на УВБ светлост, испитали смо кинетику акумулације неутрофила у кожи озраченој УВ светлошћу, као и у слезини,бубрег,и плућа Ц57БЛ/6 Ј (Б6) мишева, соја који најбоље опонаша кожне промене УВБ светлости на људској кожи (слика 2А) (27). Након акутног излагања коже УВБ светлости, број неутрофила у кожи се повећао седам пута у року од 24 х и остао је повишен током 6 дана у поређењу са основним нивоима пре УВБ (Д-1) ​​(Слика 2Б). Ово је било праћено смањењем броја неутрофила у коштаној сржи и петоструким повећањем неутрофила у циркулацији у данима од 1 до 6 (Слика 2 Ц и Д). Интригантно, у истом временском оквиру, неутрофили су се повећали у слезини, плућима ибубрега(Слика 2 Е–Г и Додатак СИ, слика С2А). Прецизна кинетика варира између органа, достижући врхунац 1. дана у плућима и 2. до 6. дана убубрегаи слезина (слика 2 Е–Г). Убубрези, неутрофили углавном локализовани у тубулоинтерстицијалном подручју, укључујући васкулатуру, на шта указује бојење неутрофилне еластазе (НЕ) у близини или колокализовано са адхезионим молекулом тромбоцита/ендотелних ћелија-1 (ПЕЦАМ-1/ЦД31 ) (слика 2Х). Репрезентативне слике на слици 2Х показују неутрофиле у или око интерстицијалне васкулатуре (потпуне беле стрелице) и у интерстицијуму (испрекидане беле стрелице), са повременим неутрофилима, такође пронађеним у гломерулима (жуте стрелице). Слична локализација је откривена анти-Ли6Г имунофлуоресценцијом (ИФ) бојењем (СИ додатак, слика С2Б).

Да бисмо утврдили да ли су друге урођене имуне ћелије показале локалне и системске одговоре сличне неутрофилима, испитали смо дистрибуцију моноцита (ЦД11б плус Ли6Ц плус Ли6Г-) у истим временским тачкама након излагања УВБ светлости. Док су моноцити такође регрутовани у кожу, само мали број инфилтрирајућих моноцита је откривен убубрега6. дана након излагања УВБ (∼2- пута у односу на ∼10.5- пута повећањебубреганеутрофили) (Слика 2Ф и СИ Додатак Фиг, С3). Није откривено повећање броја моноцита у плућима или слезини (СИ додатак, слика С3), што сугерише да је системски одговор на УВ повреду био релативно селективан за неутрофиле.

Инфилтрација неутрофила у кожу била је праћена хистолошким променама, укључујући рану упалу дермиса и одумирање епидермалних ћелија (1. и 2. дан), праћено развојем акантозе и хиперкератозе са формирањем сероцелуларне коре у неким случајевима (6. дан) (СИ Додатак, слика С4). Значајно је да се након излагања УВБ светлости нису појавиле отворене лезије на кожи, што сугерише да се уочена инфилтрација имуних ћелија догодила у стерилним условима, иако се не може искључити допринос измењеног микробиома коже (20).

Заједно, ови налази показују да излагање коже једној дози УВБ светлости мобилише неутрофиле како на локално место упале, тако и на унутрашње органе, укључујућибубрег,праћено неутрофилијом крви. Док су укупни миграциони обрасци били слични и код мужјака и код женки мишева, инфилтрација неутрофила у кожу била је бржа код женки у поређењу са мужјацима (слика 2Б). Насупрот томе, епидермална повреда скидањем траке није довела до миграције неутрофила убубрегаупркос сличним нивоима инфилтрације неутрофила и инфламаторног одговора и повреде ткива као што се види при излагању УВ светлу (СИ додатак, слика С5), што указује да системска дисеминација неутрофила није уобичајена за све облике стерилне повреде коже.

ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ БОЛЕСТИ БУБРЕГА/БУБРЕГА

ИЛ-17А промовише регрутацију неутрофила након излагања коже УВ светлу.Истраживање хемотактичких и инфламаторних медијатора у кожи открило је значајну регулацију генске експресије неутрофилних хемокина и инфламаторних цитокина цкцл1, цкцл5/6, г-цсф и ил-1 1 до 2 дана након излагања УВ зрачењу (Сл. 3 А–Д). Брзо и упорно повећање експресије с100А9 одговарало је кинетици инфилтрације неутрофила у кожу (слика 2Б и СИ додатак, слика С6), док су цитокини ил-6, тнф и ил-33 били су пролазно повећани и враћени на почетну експресију до 6. дана (СИ додатак, слика С6). Насупрот томе, ил-36а је повишен тек 6. дана (СИ додатак, слика С6), што можда одражава репаративну функцију. Пролазно (1 до 2 д) присуство моноцита у кожи (СИ додатак, слика С3) паралелно је са регулацијом навише хемокина специфичних за моноците ццл4 и ццл2 (СИ додатак, слика С6). Слично акумулацији неутрофила у кожи женки мишева (слика 2Б), акумулација моноцита у кожи се такође догодила раније код женки него код мужјака (СИ додатак, слика С3).

UV skin exposure was accompanied by rapid (6 h) 12-fold induction in il-17a gene expression in the skin (Fig. 3E) as well as >1,000-кожна индукција у експресији г-цсф током 1. и 2. дана након УВ (слика 3Ц). Да бисмо утврдили да ли је индукција ових цитокина била релевантна за мобилизацију неутрофила, прво смо квантификовали концентрације протеина цитокина у крви, што је открило снажно и трајно (10- до 100- пута) повећање концентрације у плазми ИЛ-17А 6 до 24 х након излагања УВ светлу (слика 3Ф), заједно са пролазним (врх на 6 х) повећањем ИЛ-6 и ИЛ-12, цитокина који може бити низводно од ИЛ-17А (28) (Слика 3 Г и Х). Није примећено повећање концентрација ИФН, ГМ-ЦСФ, ТНФ, ИЛ-10, ИЛ-27, ИЛ-23 или ИЛ1 у плазми. Да бисмо утврдили да ли је ИЛ-17А неопходан за регрутовање неутрофила изазваног УВБ-ом, блокирали смо ефекат ИЛ-17А неутрализујућим антителом пре излагања УВ зрачењу (слика 3И). Анти–ИЛ-17А ИгГ је значајно ублажио неутрофилију у крви (слика 3Ј) и ослабио прилив неутрофила у изложено ткиво коже (слика 3К и СИ додатак, слика С7А) ибубрега(Слика 3Л и Додатак СИ, слика С7Б). Ови налази показују да је регрутовање неутрофила као одговор на УВ светло посредовано, барем делимично, ИЛ-17А.

Неутрофили посредују у запаљењу бубрега након излагања коже УВ зрачењуСветлост.Да би се утврдило да ли су неутрофили одговорни за инфламаторне промене убубрега following skin UVB light exposure, we blocked neutrophil recruitment prior to UV light exposure. Since cutaneous g-csf expression was up-regulated >1,000- пута након излагања УВ зрачењу, што сугерише хемотактичку улогу Г-ЦСФ у регрутовању неутрофила као одговор на УВ светлост, инхибирали смо мобилизацију неутрофила из коштане сржи блокирањем Г-ЦСФ као што је приказано на слици 4А. Неутрализација Г-ЦСФ спречила је неутрофилију крви, као и регрутовање неутрофила убубреганакон излагања коже УВБ светлости (сл. 4 Б и Ц). Нарочито, као што је раније објављено у различитим моделима (29, 30), блокирање Г-ЦСФ није променило број моноцита убубрега(слика 4Д). Смањена миграција неутрофила убубрегаје праћено значајним смањењем убубрежниекспресија молекула адхезије вцам-1 и е-селектина (сл. 4 Е и Ф), као и медијатора упале с100А9 и ил-1 1 д након излагања УВБ (Слика 4 Г и Х). Штавише, маркери повреде ткива липокалин-2 и ким-1 убубрегасу значајно смањене код мишева изложених УВ светлу третираних антителом које блокира Г-ЦСФ у односу на животиње које су биле изложене УВ зрачењу (Слика 4 И и Ј). Као што смо раније известили (6), акутна изложеност коже УВБ светлости изазвала је одговор интерферона типа И убубрега(слика 4К). Блокирање Г-ЦСФ значајно је смањило, али није у потпуности поништило ИФН скор (слика 4К). Док присуство неутрофила убубрегаје била потребна за акутне инфламаторне и повреде одговора примећене 1 дан након излагања коже УВ светлу (слика 4), у овом тренутку нису примећене разлике у протеинурији, пошто се врхунац протеинурије десио око 4. дана након излагања УВ зрачењу (слика 1 Х и И). Заједно, ови подаци указују да су неутрофили одговорни за инфламаторни одговор и, директно или индиректно, доприносе индукцији интерферона типа И убубреганакон излагања коже УВ светлу. Слично резултатима добијеним са анти-Г-ЦСФ ИгГ, примена неутрализирајућег анти-ИЛ-17 антитела је делимично потиснула миграцију неутрофила убубрегаи резултирало је смањеном експресијом генабубрегаинфламаторни (вцам-1 и с100А9) и маркери повреде (липокалин-2 и ким-1), иако је само смањење експресије ким-1 било статистички значајно (СИ додатак, сл. С7 Ц–Ф)

Субпопулација неутрофила бубрега је реверзно трансмигрирана, а фенотип је такође откривен у крви пацијената са СЛЕ.Иако се дуго претпостављало да неутрофили који улазе у места инфекције или стерилне упале касније пролазе кроз апоптозу и да их макрофаги брзо уклањају, бројне студије су откриле да се неки неутрофили саобраћају двосмерно, односно, након уласка у ткиво, трансмигрирају. назад у крвоток и инфилтрирају се на другу локацију, процес који се назива реверзна трансмиграција (рТЕМ) (8, 10, 11, 31–34). Да би се истражило да ли су неутрофили који живе убубреганакон излагања коже УВБ светлости која је прошла кроз изложену кожу, проучавали смо миграцију неутрофила на фотоактивирајућем Б6 моделу миша (хумани убиквитин Ц [УБЦ]-фотоактивирани [ПА]-зелени флуоресцентни протеин [ГФП]).

Експериментална шема је илустрована на слици 5А; 1 дан након излагања коже једној дози УВБ светлости, кожа је изложена љубичастој светлости (405 нм) тако да су инфилтрирајуће имуне ћелије фотоконвертоване у ГФП-позитивне ћелије. Фотоконвертовани неутрофили (ГФП плус Ли6Г плус) су затим квантификовани у перфузираномбубрезиследећи дан. Анализа проточне цитометрије је открила да је ∼20 процената неутрофила који се инфилтрирају у бубреге позитивно на ГФП након одузимања позадинског сигнала (∼10 процената) (слика 5Б). За разлику од модела стерилне инфламације у јетри или кремастом мишићу (8, 10), нисмо открили фотоконвертоване неутрофиле у плућима, вероватно зато што је мало неутрофила пронађено у плућима другог дана (слика 2Ф). Да се ​​тестира да ли ГФП плус неутрофили убубрегаекстравазиране из кожног ткива изложеног УВ зрачењу или су ПА интраваскуларно, упоредили смо промене у броју ГФП плус неутрофила добијених избубрезимишева код којих је иста кожа која је била изложена УВ светлости била ПА са љубичастом светлошћу дан касније (Група И) у односу на мишеве код којих је кожа поред те изложености УВ светлости била ПА са љубичастом светлошћу дан касније (Група ИИ, дијаграм у додатку СИ, слика С8А). Иако није било разлика у процентима циркулишућих неутрофила између група (СИ додатак, слика С8Б), примећено је веће повећање ГФП плус неутрофила убубрезимишева код којих је кожа изложена УВ зрачењу такође била ПА (Група И) у поређењу са недостатком повећања ГФП плус неутрофила код мишева где је кожа која није изложена УВ зрачењу била ПА (Група ИИ) (СИ Додатак, Слика С7Б). У Групи ИИ, бројеви неутрофила су били слични позадини ГФП позитивности која се види на слици 5Б (СИ додатак, слика С8Б).

Док је низак ниво ГФП плусбубреганеутрофили у Групи ИИ сугеришу да љубичаста светлост не ПА циркулишу ћелије у кожи која није изложена УВ зрачењу, остало је могуће да излагање УВ светлости мења интеракције неутрофила са крвним судовима у кожи, омогућавајући већу фотоконверзију и накнаднубубрегаприступ. Да бисмо одредили релативне пропорције ТЕМ неутрофила, квантификовали смо експресију површинских маркера који се користе за карактеризацију неутрофила који су били подвргнути рТЕМ: ЦКСЦР4хи (8) и ИЦАМ1хиЦКСЦР1ло (11, 35). Заиста, ГФП плусбубреганеутрофили су изразили више нивое ЦКСЦР4 у поређењу са ГФП плус неутрофилима у кожи или ГФП- неутрофилима убубрега(Слика 5Ц). Оф

интересовање,бубрежниекспресија ЦКСЦР4 лиганда, цкцл12, 1 до 2 дана након излагања коже УВБ светлости била је упоредна са присуством ЦКСЦР4хи неутрофила убубрега(Слика 1Г), вероватно обезбеђујући хемотактички стимуланс за регрутовање ових неутрофила у бубрег. Од интереса, открили смо ЦКСЦР4хи и ИЦАМ1- хиЦКСЦР1ло неутрофиле у коштаној сржи касно након излагања УВ зрачењу (6. дан, СИ додатак, сл. С9 Б и Ц), што сугерише да се неки од ових неутрофила такође враћају у коштана срж слична оној која је пријављена за рТЕМ након повреде јетре или вирусне инфекције коже (12, 36). У складу са овим запажањима, открили смо већу експресију ЦКСЦР4 на неутрофилима у крви другог дана након излагања УВ зрачењу, вероватно хватајући ћелије на путу добубрегаи коштане сржи (СИ додатак, сл. С9Д). Слично томе, значајно већи проценат ИЦАМ1хиЦКСЦР1ло ћелија је откривен међу ГФП плус неутрофилима убубрегау поређењу са ГФП плус неутрофилима у кожи и ГФП- неутрофилима убубрега(Слика 5Д). Фенотип ИЦАМ1хиЦКСЦР1ло је откривен на ∼20 до 35 процената ГФП плус неутрофила убубрега(Слика 5Д), што сугерише да је подскуп неутрофила који мигрирају убубрегапреко коже изложене УВ зрачењу то чине обрнутом трансмиграцијом, док остатак одбубреганеутрофили се вероватно активирају док циркулишу кроз упаљену кожу изложену УВ зрачењу. Субпопулација ИЦАМ1- хиЦКСЦР1ло неутрофила је такође откривена убубрезинормалних Б6 мишева изложених УВ светлу који нису примили ПА (СИ додатак, слика С9А).

Док су фенотипи неутрофила ЦКСЦР4хи и ИЦАМ1хиЦКСЦР1ло повезани са инфламаторним функцијама и повредом ткива у различитим моделима мишева (11, 31, 37), неколико студија је спроведено на овим популацијама ћелија код људских болести. С обзиром на појаву улоге неутрофила у СЛЕ (13, 17, 18) и њихову очигледну хетерогеност (19), истражили смо да ли полиморфонуклеарне ћелије нормалне густине (ПМН) или ЛДГ код пацијената са СЛЕ

демонстрирао реверзно мигрирајуће фенотипове: ЦКСЦР4хи (37, 38) и ИЦАМ1хиЦКСЦР1ло. Профилисање ПМН и ЛДГ помоћу проточне цитометрије открило је већу експресију ЦКСЦР4 на површини ових ћелија код пацијената са СЛЕ у поређењу са здравим контролама (Слика 6 А и Ц). Штавише, открили смо мали, али значајно већи проценат ИЦАМ1хиЦКСЦР1ло ПМН у СЛЕ крви (средња вредност, 3,5 процената) у односу на здраве контроле (средња вредност, 1,4 процената) (слика 6Б). Занимљиво је да је популација ЛДГ неутрофила (ЦД15 плус ЦД14лоЦД10 плус у мононуклеарним ћелијама периферне крви [ПБМЦс]) садржавала већи проценат ИЦАМ1хиЦКСЦР1ло ћелија него ПМН у здравој (средња вредност, 7,1 процената) и СЛЕ крви (средња вредност, 29,4 процената). 6 Б и Д). Популација слична рТЕМ била је значајно више заступљена у ЛДГ пацијената са СЛЕ у односу на здраве контроле (Слика 6Д). Ови подаци идентификују присуство фенотипова неутрофила сличних рТЕМ-у у ПМН, а посебно ЛДГ код пацијената са СЛЕ.

Дискусија

Системски ефекти излагања коже УВ светлу су слабо схваћени. Идентификовање ових путева у нормалним основним условима може да информише механизме захватања системског ткива након излагања сунцу које се јавља код болести као што је СЛЕ (2–4). Овде извештавамо о неколико налаза о томе како излагање сунчевој светлости утиче на бубреге. Прво, показали смо да акутна изложеност коже УВБ светлости изазива упалне реакције и реакције на повреде убубрег,укључујући субклиничку протеинурију. Интригантно, овибубрежнипромене су биле праћене инфилтрацијом неутрофила у бубрег након упале коже посредоване УВБ светлошћу. Одговор неутрофила је зависио од ИЛ-17А и Г-ЦСФ. Неутрофили у бубрезима су имали проинфламаторне фенотипове, о чему сведочи екстрацелуларна локализација НЕ, већи удео рТЕМ (ЦКСЦР4хи) такође познатих као „остареле“ и ИЦАМ1хиЦКСЦР1ло ћелије. Неутрофили су били директно укључени у субклиничкеповреда бубрега,јер је смањење неутрофила довело до значајног смањења експресије молекула адхезије, инфламаторних цитокина, потписа ИФН-И и маркера оштећења бубрега након излагања коже УВ зрачењу.

Пријављено је да друге врсте повреда коже, као што су скидање траке и локална примена агониста ТЛР7, побољшавајуповреда бубрегау одређеним моделима лупуса, иако се сматрало да је побољшање болести посредовано макрофагима и дендритичним ћелијама, а не неутрофилима (39, 40). Пошто је показао да скидање траке није довело до регрутовања неутрофила убубрега, предлажемо да се излагање УВ светлу разликује од других врста стерилних упала коже. Ово се може објаснити стварањем фотопроизвода или јединствених инфламаторних медијатора након УВ повреде који подстичу бубрег за упалу, разликама у уклањању неутрофила након УВ у поређењу са скидањем траке, или другим факторима. Приметили смо да је УВ светлост покренула брзу и снажну индукцију ил-17а месинџер РНК (мРНА) у кожи заједно са високим нивоом протеина ИЛ-17А у циркулацији (∼100- пута повећање) , што је било потребно за регрутовање неутрофила након излагања УВ светлу. Истовремена 100- до 1,000- индукција у г-цсф експресији коже сугерише да је ИЛ-17А/Г-ЦСФ оса вероватни механизам одговоран за неутрофилију и кретање неутрофилног ткива као одговор на УВ светло. Улога ИЛ-17А у регулисању гранулопоезе и регрутовања неутрофила путем индукције Г-ЦСФ је добро позната у хомеостатским условима и неколико студија је идентификовало ИЛ-17А као важно за регрутовање неутрофила на места стерилно запаљење (41, 42). Код лупуса, повишени ИЛ-17А експресија се налази у кожним лезијама (43), а повећани нивои ИЛ-17А у циркулацији су повезани са лошијим манифестацијама болести (44), иако је специфична веза са неутрофилима, патогена популација у овој болести (13, 17, 18), остаје неистражена. Поред својих директних ефеката на Г-ЦСФ посредовану мобилизацију неутрофила из коштане сржи, ИЛ- 17А такође може допринети враћању неутрофила убубрегастимулисањем експресије молекула адхезије (нпр. ВЦАМ-1 и Е-Селецтин) набубрежниендотел (45, 46).

Користећи исти модел акутног излагања УВ зрачењу, недавно смо известили да је једна доза УВ светлости изазвала локални и системски одговор ИФН-И, који је био неопходан за ефикасно регрутовање неутрофила у кожу (6). Пошто је показано да ИФН-И индукује производњу ИЛ-17А (47), вероватно је да ови путеви, било независно или заједно, доводе до регрутовања и миграције неутрофила посредованих УВ светлом о којој овде извештавамо. Док наши налази указују на инфламаторну улогу за ИЛ- 17А, супресивни ефекти УВБ светлости на ИЛ-17А сигнализацију су раније пријављени код псоријазе, где је излагање псоријатичне коже УВБ светлости елиминисало патогене Т ћелије и мијелоидне инфламаторне дендричне ћелије (48, 49). Пошто је псоријатична, за разлику од здраве, кожа богата Т ћелијама које производе ИЛ-17 и реагују на њих, разлика у ћелијском саставу ће вероватно одредити одговор на УВБ светлост, укључујући степен супресије ИЛ посредоване УВБ светлошћу -17Израз рецептора (50). УВ дозирање такође може да одреди да ли се јавља инфламаторни или терапеутски ефекат: ниске дозе су повезане са антиинфламаторним и имуносупресивним последицама (51), вероватно инхибицијом одговора ЦД8 Т ћелија (52).

Неутрофили играју вишеструке улоге током упале ткива. Када се активирају молекуларним обрасцима повезаним са патогеном и молекуларним обрасцима повезаним са оштећењем (ДАМПС) или ангажовањем рецептора, неутрофили директно доприносе повреди ткива ослобађањем протеаза, РОС и екструзијом неутрофилних екстрацелуларних замки (НЕТ) (53, 54). Неутрофили такође могу да подстичу поправку ткива фагоцитозом ћелијских остатака и омогућавањем реваскуларизације ткива (8). Код СЛЕ, неутрофилни генски потпис је снажан предиктор активне болести укључујући ЛН и кожни лупус (17, 18). Неутрофили се налазе у кожним лезијама (13, 14), као ибубрегаузорци биопсије (15, 16) пацијената са СЛЕ, а њихова инфламаторна својства се делимично приписују формирању НЕТ (16). Овај процес укључује повећану производњу РОС (55), ослобађање митохондријалне ДНК (55) и ослобађање и индукцију инфламаторних протеина, као што су с100А9 (56), ИЛ-1б (57) и интерферони типа И (55 , 58). Наши налази да је инхибиција миграције неутрофила у бубрег поништила с100А9 и значајно смањила експресију ИЛ-1б ибубрегаИФН резултат сугерише да би сличне инфламаторне функције могле бити у игри. Релевантни за болест бубрега код СЛЕ, неутрофили су углавном локализовани на ТИ ендотелу, месту повећане експресијеповреда бубрегамаркери ким-1 и липокалин-2 у ткивима ЛН бубрега (59,60). Протеинурија може настати услед превелике пермеабилности гломеруларне баријере за протеине услед поремећене реапсорпције протеина у тубулима или комбинације ових механизама (61). Повреда ТИ код пацијената са СЛЕ је чест патолошки налаз у ЛН бубрезима, укључујући и оне са благом повредом гломерула (61, 62). Показало се да повреда ТИ предвиђа тежину ЛН (63, 64), али механизми који га покрећу нису познати. Пошто су повишени ким-1 и липокалин-2 препознати маркери повреде ТИ код СЛЕ (26, 65) и блокирају миграцију неутрофила убубрегаинхибирали њихову експресију, предлажемо да је пролазна протеинурија уочена након излагања УВ зрачењу последица неутрофилне субклиничке ТИ инфламације (65). Повећана експресија вцам-1 бубрега, још један маркер ТИ повреде код СЛЕ (66), додатно подржава овај модел.

Поред пропагирања упале на локалним местима стерилне или инфективне повреде, показало се да неутрофили живе у удаљеним органима (8-10), где, у зависности од контекста, доприносе повреди ткива путем производње РОС (11) или активирају адаптивни имуни систем у лимфним чворовима и коштаној сржи (9, 12). Инфламаторна природа ових неутрофила се приписује њиховој способности да изађу из примарног места повреде и мигрирају на секундарна места, односно да се подвргну рТЕМ (9–11, 31–34). Наши налази да су ПА ћелија које садрже ГФП у кожи након излагања УВ зрачењу довеле до откривања ГФП плус неутрофила убубрегаса фенотипом рТЕМ сугеришу да је субпопулацијабубрежнинеутрофили су мигрирали са коже изложене УВ зрачењу (ГФП плус неутрофили чине ∼20 проценатабубреганеутрофили и од њих 20 до 35 процената су рТЕМ; дакле, рТЕМ чине 4 до 7 процената укупног бројабубреганеутрофили). Овај проценат рТЕМ-а је упоредив са пропорцијом пријављеним након стерилне повреде јетре (∼9 процената) (36) и исхемијске-реперфузијске повреде (∼8 процената) (11). рТЕМ су у другим околностима показали да су проинфламаторни (10, 11) и да су пореметили апоптозу (35), што је довело до могућности да играју улогу у УВ-индукованимповреда бубрега.Повишена експресија ЦКСЦР4 на овим неутрофилима је посебно релевантна, као случајностбубрежнипримећена је експресија цкцл12, ЦКСЦР4 лиганда експримираног у подоцитима и тубулима (24), што вероватно даје хемотактички сигнал за ову популацију неутрофила. Повећана експресија ЦКСЦР4 на имуним ћелијама у комбинацији са високим нивоимабубрежниЦКСЦЛ12 је идентификован код пацијената са СЛЕ са ЛН (67), а овај пут је био укључен у лупус као и исхемију-реперфузијуповреда бубрегакод мишева (24, 68). Поред тога што је маркер рТЕМ, повећана експресија ЦКСЦР4 је такође индикатор „остарелих“ неутрофила, који могу посредовати у инфламаторним одговорима који оштећују ткиво (38). Прецизна улога ЦКСЦР4 у регрутовању неутрофила убубрегаможе се истражити антагонизмом ЦКСЦР4 као што је раније урађено у другим моделима стерилне повреде (38).

Миграција неутрофила специфична за ткиво и механизми одговорни за диференцијалну експресију молекула адхезије у различитим органима нису добро схваћени (69). Виши нивои експресије хемокина цкцл12 убубрегаали не и плућа могу објаснити преференцијално присуство ЦКСЦР4хи неутрофила у бубрезима. Поред тога, индукција експресије вцам-1 и е-селектина у бубрезима, у поређењу са непроменом експресије у плућима, вероватно доприноси преференцијалном регрутовању и задржавању неутрофила у бубрезима. Повећање експресије с100А9 у плућима од 5- до 6- пута у поређењу са повећањем од 30- до 60- пута у бубрезима, као и 6- пута повећање у ил-1б експресији у плућима у поређењу са 16- пута повећањем у бубрегу даље указује на разлике у ткивима у инфламаторном одговору. Смањење инфилтрације неутрофила у бубрегу након неутрализације Г-ЦСФ може се приписати и смањењу циркулационог броја и активацији неутрофила, као и смањењу локалне експресије вцам-1 и е-селектина. Међутим, не можемо бити сигурни да ли се почетна појачана регулација ових адхезионих молекула након излагања коже УВ зрачењу приписује цитокинима/ДАМПС-има коже или да ли неутрофили, ослобађањем серинских протеаза, директно доприносе њиховој експресији, као што је показано у другим контексти (70). Без обзира на механизме, и уз напомену да нисмо извршили свеобухватну анализу свих ткива, наше студије пружају доказе о одређеној селективности органа у системским ефектима посредованим УВ светлом. Будуће студије ће се бавити ткивно специфичним функционалним последицама системске дисеминације неутрофила, на пример, цурењем васкуларног албумина и формирањем едема у плућима (11, 36).

Код пацијената са СЛЕ, тешко је недвосмислено повезати изложеност коже УВ светлу са егзацербацијама системске болести, пошто постоје значајне варијације (1 до 3 недеље) у видљивим одговорима фотосензитивности код различитих особа (21). Поред тога, субклиничкиповреда бубрегаможе се лако пропустити све док узастопно излагање УВ светлу не појача ефекте. Док смо открили да је посредовано неутрофилимазапаљење бубрегакао одговор на УВ светлост не изазива клиничку болест код здравих мишева, такав механизам може допринети ЛН бакљама код пацијената са фотосензитивним лупусом на више начина. Ангажовање Фц рецептора од стране имунолошких комплекса могло би да повећа регрутацију неутрофила, што резултира ослобађањем РОС и протеазе (71); повећан капацитет лупус неутрофила и ЛДГ да производе НЕТ, који се код пацијената са СЛЕ не уклањају ефикасно (72), може довести до ослобађања протеаза које оштећују ткиво (73), пропагације ИФН-И одговора (58) , или директно оштећењебубрегаендотела стварањем васкуларног оштећења и цурења (16). Штавише, основне разлике у кожи лупуса, као што је појачана сигнализација ИФН-И (5, 74) и дефекти у популацији заштитних Лангерхансових ћелија (75), могу да информишу о обиму и природи системских одговора посредованих неутрофилима. Праћење миграције неутрофила заједно са испитивањем аутоантитела, акумулацијом апоптотичких ћелија и ниским нивоом комплемента може се решити коришћењем нових модела лупуса, као што су генетски дефинисани троструки мутанти (Сле1.Мфге8−/− Ц1к−/− и Сле1.Мфге8− /−Ц3−/−) (76) или други сојеви лупуса након излагања УВ светлу.

Тачни механизми који повезују неутрофиле са инфламацијом код СЛЕ могу, поред тога, бити под утицајем фенотипа неутрофила/ЛДГ, пошто је хетерогеност унутар ових популација постала очигледнија (77). Наши налази о повишеној популацији ЦКСЦР4 и ИЦАМ1хиЦКСЦР1ло (рТЕМ) у циркулацији, посебно код СЛЕ ЛДГ, додатно доприносе овој хетерогености и сугеришу да би неки од проинфламаторних гранулоцита у крви могли имати претходно „искуство у ткиву“, тј. захваћена ткива органа, као што је кожа, пре системске дисеминације. Фенотипови рТЕМ су раније пријављени у синовијалној течности и циркулишућим неутрофилима пацијената са реуматоидним артритисом (35, 78) и код акутне повреде плућа изазване панкреатитисом (79). Њихова улога у СЛЕ-у захтева даљу истрагу.

ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ БОЛ БУБРЕГА/БУБРЕГА

Материјали и методе

Мишеви.Све експерименте на животињама одобрио је Комитет за институционалну негу и употребу животиња Универзитета Вашингтон, Сијетл. Иницијални експерименти су спроведени коришћењем и мужјака и женки Ц57БЛ/6Ј мишева (Јацксон Лаборатори, 3 до 4 месеца старости, слике 1 и 2). За све наредне експерименте коришћене су женке мишева. ПА студије су спроведене на Б6. Цг-Птпрц Тг(УБЦ-ПА-ГФП)1Мнз/Ј женке мишева (Јацксон Лаборатори, 3 до 4 мес.). Ови мишеви су генерисани ињекцијом трансгеног вектора који носи ПАГФП (Т203Х варијанта) под контролом транскрипције хуманог убиквитин Ц промотора у Ц57БЛ/6 ембрионе. Животиње су биле смештене у условима без патогена и одржаване у циклусима светло-мрак од 12 х са ад либитум приступом храни и води. Експерименти на свим животињама изведени су у исто доба дана како би се избегао утицај циркадијалног ритма на миграцију неутрофила (38).

Изложеност УВБ светлости и скидање траке.Дорзални аспект мужјака и женки Ц57БЛ/6 мишева је обријан најмање 24 х пре зрачења УВБ светлошћу, а у експериментима су коришћени само мишеви са непигментираном кожом. Мишеви су анестезирани изофлураном и изложени једној дози УВБ светлости (500 мЈ/цм2) коришћењем ФС40Т12/УВБ сијалица (Национална биолошка корпорација), са максималном емисијом између 300 и 315 нм. Енергија УВБ светлости на дорзалној површини мерена је радиометром Пхото лигхт ИЛ1400А опремљеним СЕЛ240/УВБ детектором (Интернатионал Лигхт Тецхнологиес). Мишеви су еутаназирани 1, 2 или 6 дана након излагања УВБ светлости, а неозрачени мишеви су коришћени као контроле (Д-1) (слика 2А). Скидање епидермалне траке је изведено као што је претходно описано (7), а кожа ибубрегапроцењени су 24 сата након повреде

Инхибиција ИЛ-17А и Г-ЦСФ.Мишеви су третирани интравенозно са 100 уг пречишћеног антимишјег ИЛ-17А ИгГ пацова (БиоЛегенд) или контролом изотипа 3 х пре излагања УВ светлу (1 × 500 мЈ/цм2) (слика 3И). Присуство неутрофила у крви, кожи и физиолошком растворубубрегаткиво је процењено проточном цитометријом 24 х након излагања УВ зрачењу као што је описано у наставку. Миграција неутрофила као одговор на УВ светлост инхибирана је интраперитонеалним третманом мишева са 50 уг анти-мишјег Г-ЦСФ моноклонског антитела или мишјим ИгГ изотипском контролом (Р&Д Системс) 24 х и 3 х пре излагања коже УВБ светлости (1 × 500 мЈ /цм2) (слика 4А). Након срчане перфузије, број неутрофила и моноцита убубрегапроцењени су проточном цитометријом и експресијом гена помоћу кПЦР, као што је описано у наставку. Мишеви који нису били изложени УВБ светлости коришћени су као додатна контролна група.

Изолација ћелија из различитих органа.Након еутаназије са инхалацијом ЦО2, комад дорзалне коже је уклоњен и држан у раствору РПМИ (Росвелл Парк Мемориал Институте) на леду до обраде. Крв је сакупљена срчаном пункцијом у шприцеве ​​обложене етилендиаминтетрасирћетном киселином. Перфузија срца је затим извршена помоћу физиолошког раствора пуферованог фосфатом (ПБС) (∼60 мЛ) кроз леву комору након исецања десне преткомора. Успешна перфузија је одређена посматрањем потпунебубрегаи бледило плућа. Плућа, бубрези, слезина и обе бутне кости су пажљиво уклоњени и стављени у РПМИ раствор на леду до обраде узорка. Ћелије су изоловане из еквивалентних површина кожног ткива (∼30 мм2) млевењем и варењем ткива са 0.28 јединица/мЛ Либерасе ТМ (Роцхе) и 0,1 мг/мЛ деоксирибонуклеазе И ( Вортхингтон) у ПБС-у са Ца плус 2 и Мг плус 2 током 60 минута на 37 степени уз мућкање. Ћелије су изоловане из једнебубрегапо животињи;бубрегаткива су млевена и дигестирана у 2 мг/мЛ колагеназе типа И (Вортхингтон) током 30 минута на 37 степени према објављеном протоколу. Ћелије плућа су сакупљене варењем ткива у ПБС (Ца плус 2 и Мг плус 2) са 1 мг/мЛ колагеназе типа 1 и 60 У деоксирибонуклеазе И. Целе слезине су уситњене на цедиљку од 40 μм и испране раствором РПМИ. Цела крв и ћелије из слезине, коштане сржи, бубрега и плућа третиране су 1Кс пуфером за лизу црвених крвних зрнаца (РБЦ) (БД Биосциенцес). После изолације/дигестије, ћелије из свих ткива су филтриране (40 μм), испране са ПБС и ресуспендоване у РПМИ раствору пре бројања.

Бојење и анализа проточном цитометријом.Ћелије су третиране са Фц Блоцк ТруСтаин ФцКс (Биолегенд) и обојене бојом Зомбие Акуа Виабилити (Биолегенд) према препорукама продавца. Ћелије су испране и површинско бојење је изведено коришћењем флуоресцентних антитела специфичних за миша купљених од Биолегенд-а. Различите популације мијелоидних ћелија су анализиране у живим имуним ћелијама (Зомбие Акуа-ЦД45 плус) капија. Проценат и број неутрофила (Ли6ЦинтЛи6Гхи) и моноцита (Ли6Ц плус Ли6Г−) су квантификовани. Репрезентативно гајтинг проточне цитометрије је представљен у додатку СИ, слика С10. Проценат експресије и средњи интензитети флуоресценције површинских маркера у моделу ПА (ЦКСЦР4, ИЦАМ1 и ЦКСЦР1) одређени су коришћењем контрола бојења флуоресценцијом минус један (ФМО) у капији неутрофила (Ли6Гхи). Сви узорци су обрађени коришћењем ЦитоФЛЕКС проточног цитометра (Бецкман Цоултер) и подаци су анализирани помоћу софтвера ФловЈо верзије 10 (Трее Стар).

Студије фотоактивације (ПА).УБЦ-ПА-ГФП мишеви су обријани и део леђа је озрачен једном дозом УВБ светлости (500 мЈ/цм2) као што је горе наведено. Само део коже који ће бити фотоконвертован био је изложен УВБ светлости, док је преостала кожа била прекривена алуминијумском фолијом. После 24 х од стерилне повреде изазване УВБ-ом, цео регион коже озрачен УВБ-ом је подвргнут љубичастој светлости (405 нм) коришћењем 50 В светлеће диодне лампе са 0,37 нумеричким отвором (НА) влакном (Мигхтек) на снази од 100 мВ (15 мин експозиције по површини). Ова метода је оптимизована на основу објављеног протокола фотоконверзије специфичне за кожу (80).Бубрезии плућа су сакупљена и обрађена за анализу проточне цитометрије 24 х након ПА, као што је горе описано. Приступ и временска линија су приказани на дијаграму на слици 5А. Проценат ГФП плус неутрофила убубрегаје упоређено са оним пронађеним код мишева под три контролна услова: 1) без УВ и без ПА, 2) УВ али без ПА и 3) без УВ али ПА. Нивои експресије ЦКСЦР4 и фенотип ИЦАМ1хиЦКСЦР1ло унутар ГФП плус и ГФП- неутрофила у кожи ибубрегапроцењени су проточном цитометријом коришћењем мишева специфичних флуоресцентно обележених антитела купљених од Биолегенд. Да би се утврдило да ли су ГФП плус неутрофили убубреганастала од коже, а не крви, кожа у једној групи мишева је била изложена УВ светлу и ПА као што је горе описано (Група И), док је у другој групи кожа била изложена УВ светлости, али је ПА изведена на суседној површини коже није изложен УВ светлу (Група ИИ) (дијаграм у додатку СИ, слика С7А).Бубрезисакупљени и обрађени за анализу проточне цитометрије као што је горе описано.

Експресија гена и протеомске анализе.кожа,бубрег,а узорци плућа су чувани у раствору РНАлатер (КИАГЕН). РНК је екстрахована помоћу комплета РНеаси из КИАГЕН-а, а комплементарна ДНК (цДНК) је синтетизована коришћењем комплета за синтезу цДНК високог капацитета (Апплиед Биосистемс). Транскрипти инфламаторних хемокина, цитокина и молекула адхезије су квантификовани кПЦР у реалном времену коришћењем прајмера наведених у СИ Додатку, Табела С1 и нормализовани на просек нивоа 18С транскрипта. Употребљена доза УВБ светлости није утицала на експресију 18С ни у једном органу. Релативна експресија мРНА циљева је одређена коришћењем стандардне формуле 2^(−Цт) × коефицијента. ИФН резултати су изведени из експресије 10 репрезентативних гена стимулисаних интерфероном (ИСГ; Мк1, Ирф7, Исг15, Исг20, Ифи44, ифит1, ифит3, оасл1, усп18 и ифи27л2а) као што је претходно описано (6). Средња вредност и СД релативне експресије сваког ИСГ су одређени убубрезимишева који нису изложени УВ светлу (меанноУВ и СДноУВ). Они су затим коришћени за стандардизацију нивоа експресије сваког ИСГ у бубрезима третираних мишева (ИгГ изотип плус УВБ или а-ГЦСФ плус УВБ). Стандардизовани нивои експресије су затим сумирани за сваког миша да би се добио резултат експресије ИФН; и=израз сваког ИСГ-а; Третман геном=релативни ниво експресије гена након третмана; и ген иноУВ=релативни ниво експресије гена код мишева који нису изложени УВБ светлости. ∑ 10 и=1=Генеитреатмент−меанГенеиноУВ СД(ГенеиноУВ) . Нивои протеина у плазми и протеинским екстрактима кожног ткива мерени су коришћењем дефинисаних панела аналита ЛЕГЕНДплек Моусе Инфламматион Панел и Инфламатор Цхемокине Панел (Биолегенд).

ИФ бојење смрзнутих бубрежних ткива.Перфузно физиолошким растворомбубрезису фиксирани у 4% параформалдехида током 1 х на собној температури и, након потапања у 30% сахарозе, замрзнути у оптималном медијуму за сечење (Сакура Финетек). Секције ткива 5- μм су рехидриране у ПБС пре ИФ бојења. Ткива су пермеабилизована са 0.1 процента Тритон Кс-100 у ПБС и накнадно блокирана у ПБС плус 0,1 процената Тритон Кс-100/5 процената БСА (говеђи серумски албумин)/5 процената зечјег серума . НЕ и ендотелне ћелије су детектоване бојењем анти-мишјим НЕ Ци5 (1:100, Биосс) и анти-мишјим ПЕЦАМ-1/ЦД31 Ал488 (1:100, Биолегенд), респективно, на 4 степена преко ноћи. Присуство неутрофила убубрегаје потврђено бојењем анти-мишјем Ли6Г Ал647 (1:100, Биолегенд). Ткива су монтирана помоћу ПроЛонг Голд са 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (ДАПИ) медијума за монтирање (Инвитроген) и снимљена помоћу Никон Ецлипсе 90и флуоресцентног микроскопа (Хистологи анд Имагинг Цоре, Универзитет у Вашингтону).

Хистолошка процена коже.Формалином фиксирани делови кожног ткива уграђени у парафин (4 до 5 μм) су обојени хематоксилином и еозином на Универзитету у Вашингтону Хистологи анд Имагинг Цоре пре УВ, дан 1, дан 2 и дан 6 након УВБ зрачења (н {{ 7}} жене). Кожа је оцењена на слепи начин за следеће параметре: запаљење дермиса/поткожног ткива, одумирање епидермалних ћелија, акантоза, хиперкератоза, формирање сероцелуларне коре и ерозија/улцерација. Ови параметри су оцењени на скали од 0 до 4 у зависности од тежине и обима, са изузетком ерозије/улцерације, која је оцењена као присутна (1) или одсутна (0). Репрезентативне слике су снимљене коришћењем НИС-Елементс БР 3.{14}}бита и обложене у Адобе Пхотосхоп-у са подешавањем осветљења примењеним на целу слику. Наведено је оригинално увећање.

Мерење урина.Нивои протеина у урину су процењени помоћу Брадфордовог протеинског теста (Тхермо Фисхер Сциентифиц). Узорци урина су тестирани при разблажењу 1:40 у ПБС, а концентрација протеина у урину је одређена на основу серијских разблажења познатих концентрација БСА. Однос албумин/креатинин у урину је процењен коришћењем Албувелл теста за албумин и комплета Цреатинине Цомпанион Кит (Екоцелл) према упутствима произвођача.

Сакупљање људских узорака и анализа проточном цитометријом.Ову студију је одобрио Одбор за преглед институција Универзитета у Вашингтону (СТУДИ00001145). Пуна крв је сакупљена у хепаринизованим епруветама од здравих добровољаца и пацијената са СЛЕ након информисаног пристанка. Неутрофили (ПМН) и ПБМЦ су изоловани Фицолл-Пакуе дисконтинуалним градијентом раздвајања (ГЕ Хеалтхцаре). ПМН су пречишћени из пелета еритроцита седиментацијом од 5 процената декстрана. После лизе еритроцита, ћелије су обојене флуоресцентно обележеним антителима купљеним од Биолегенд, а експресија ЦКСЦР4 и проценат ИЦАМ1хиЦКСЦР1ло ћелија су процењени у ПМН (ЦД66б плус) и ЛДГс (ЦД15 плус, ЦД14ло и ЦД10 плус у ПБМЦс (19)). Стратегија гајтинга за ЛДГ и ИЦАМ1хиЦКСЦР1ло бојење на основу ФМО је приказана у СИ додатку, слика С11. Узорци су обрађени коришћењем ЦитоФЛЕКС проточног цитометра (Бецкман Цоултер), а подаци су анализирани помоћу софтвера ФловЈо верзије 10 (Трее Стар).

Статистичке анализе.Подаци су анализирани коришћењем софтвера ГрапхПад Присм 7 (ГрапхПад Софтваре Инц.) и представљени као средња вредност ± СЕМ. Статистичка разлика између две групе података одређена је у односу на неозрачене контроле (Д-1) коришћењем Студентовог теста. Једносмерна АНОВА са вишеструким поређењима и Тукеи пост хоц је коришћена за одређивање статистичке значајности између три групе.