Експресиони образац -тубулина, инверсина и његова мета разбарушена-1 и морфологија примарних цилија у нормалном развоју и болести бубрега код људи
Mar 10, 2022
Апстрактан:Просторно-временска експресија -тубулина, инверзије и разбарушених-1 (ДВЛ-1) протеина повезаних са Внт-сигналним путем и примарна морфологија цилија анализирани су у развојубубрези(14-38. развојне недеље), здрав постнатални (1.5- и 7- година) и патолошки промењен човекбубрези,укључујући мултицистичну диспластикубубрези(МЦДК), фокална сегментална гломерулосклероза (ФСГС) и нефротски синдром финског типа (ЦНФ). Анализа је обављена двоструком имунофлуоресценцијом, електронском микроскопијом, семиквантитативним и статистичким методама. Цитоплазматска ко-експресија -тубулина, инверзија и ДВЛ-1 примећена је у проксималним извијеним тубулима (пцт), дисталним увијеним тубулима (дцт) и гломерулима (г) анализираних ткива. У токубубрегаразвоја, укупна експресија -тубулина, инверзије и ДВЛ-1спала је, док је у постнаталном периоду благо порасла. Највећа експресија -тубулина и инверзије карактерише дцт и г, док висок ДВЛ-1 карактерише пцт. -тубулин, инверзија и ДВЛ-1 обрасци експресије у МЦДК, ФСГС и ЦНФбубрезизначајно се разликовала од здраве контроле. У поређењу са здравимбубрези, патолошки измењенбубрезиимао дисморфне примарне цилије. Различита динамика експресије -тубулина, инверзије и ДВЛ-1 токомбубрегаразвој би могао да укаже на то да је пребацивање између канонског и неканонског Внт сигнала од суштинског значаја за нормалнобубрегаморфогенеза. Насупрот томе, њихов поремећен израз у патолошкимбубрезиможе бити повезано са абнормалним примарним цилијама, што доводи до хроничногболести бубрега.
Кључне речи:развој бубрега код људи; -тубулин; инверсин; ДВЛ-1; МЦДК; ФСГС; ЦНФ; бубрега, бубрега
ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ БОЛЕСТИ БУБРЕГА/БУБРЕГА
Увод
Развој дефинитивног или метанефричкогбубрезипочиње током пете гестацијске недеље (ГВ), која се затим континуирано диференцира и формира трајне бубреге [1,2]. Сигналне интеракције између метанефричног мезенхима и уретерног пупољка обезбеђују правилнубубрегаразвој током нефрогенезе. Укратко, уретерични пупољак индукује мезенхимску у епителну транзицију (МЕТ) у метанефричном мезенхиму, који се кондензује и формирабубрежнивезикуле, затим тела у облику зареза и С, и на крају доводе до формирања гломерула [3]. Заузврат, мезенхим индукује даље гранање пупољка уретера. Метанефрични бубрези постају функционалне јединице за излучивање у 11. недељи људског развоја. Међутим, нефрогенеза се завршава у периоду од 34. до 36. недеље феталног развоја, када се заврши вишеструко гранање, али се даљи процес диференцијације бубрега наставља у постнатални период [4,5]. Поремећаји ових сложених интеракција резултирају различитим урођеним абнормалностима бубрега и уринарног тракта (ЦАКУТ), укључујући дисплазију, полицистичну болест бубрега, мултицистичну диспластикуобољење бубрега(МЦДК), што последично доводи до хроничнеобољење бубрега(ЦКД) [6].
У овој студији били смо фокусирани на изглед примарне цилије и Внт-сигнални пут, који игра важну улогу током нормалне нефрогенезе и убубрегапроцес поправке, након акутног или хроничногобољење бубрега[7]. Постојање примарних цилија током нефрогенезе и велики број развојнихбубрегадефекти који се јављају код пацијената са цилијарном болешћу указују на то да је права примарна функција цилија неопходна за нормалнобубрегаорганогенеза [8,9]. Примарни цилијум је органела заснована на микротубулама важна за хомеостазу ткива, где је -тубулин основна компонента [10]. Губитак ацетилације -тубулина у имортализованим ћелијама покреће транзицију епитела у мезенхим (ЕМТ), што имплицира да је ацетиловани -тубулин важан у стабилизацији микротубула [11]. Током људског развоја, примарни Внт пут посредован цилијама омогућава пролиферацију ћелија, диференцијацију и морфогенезу ткива [12]. Значајан број деце са оштећеном функцијом примарне трепавице и поремећеним Внт-сигналним путем развија ЦКД, где је урођенабубрежнипоремећаји су одговорни за скоро половину случајева [13]. Најчешћа урођена цистична болест код деце је мултицистична диспластикаобољење бубрега(МЦДК) [14]. Вишеструке цисте које не комуницирају [15] и немају нормалнебубрежнипаренхима су карактеристични микроскопски налази за МЦДК. Фокална сегментна гломерулосклероза (ФСГС) је једно од најчешћих гломеруларних болести које доводе до крајњег стадијумаобољење бубрега[16]. У почетку, ФСГС је карактеристичан по томе што је фокалан, захвата само мањи део гломерула и сегментан, који укључује промене само у сегменту гломеруларног круга [17]. Конгенитални нефротски синдром финског типа (ЦНФ) је неуобичајена аутозомно рецесивно наследнаобољење бубрегапредстављено пренаталним избијањем екстензивног губитка протеина [18], повезаног са цистогенезом проксималних тубула [19]. Многи облици примарних гломеруларних болести развијају протеинурију као резултат оштећене баријере гломеруларне филтрације [20]. Значајна количина студија имплицира да повреде и дисфункција подоцита имају суштинску улогу у патогенези протеинурије ХББ [21]. Студија Вукојевића и сар. показује повећан број трепетљастих и слабо диференцираних подоцита у ЦНФ [22]. Претходне студије су показале да Внт/-катенин сигнални пут има фундаменталну улогу у ублажавању дисфункције подоцита са протеинуријом [23]. Постоје два главна пута Внт сигнализације, један познат као канонски зависан од катенина и други неканонски, независан од катенина. Током мишабубрегаразвоја, канонска Внт-сигнализација је активна на врховима пупољака уретера и у телима у облику слова С [24]. Штавише, Внт путем канонске сигнализације има значај за одржавање МЕТ током нефрогенезе [25]. Наиме, везивање протеинског комплекса који садржи Двл за мембрански рецептор је обавезно за активацију Внт пута, док онемогућавање кључних компоненти овог пута доводи до раног перинаталног морталитета због одсуства нефрогене зоне убубрега[25].
Утврђено је да је протеин који је кључан као молекуларни прелаз између канонских и неканонских Внт сигналних путева инверзија [26]. Иако су откривене интеракције различитих протеина са инверзијом, њихова тачна функција још није у потпуности разјашњена. Убубрежниепителних ћелија, инверзија се налази у примарним цилијама, делујући као цилијарни протеин [27]. Поред тога, инверзија формира стабилан комплекс са тубулином у културамабубрежнићелије, а оне се колокализују ин виво [27,28]. Чини се да инверзија игра суштинску улогу у раној морфогенези пронефричног система и одређивању симетрије лево-десно током развоја [29,30]. Значајан догађај и за канонске и за неканонске Внт-сигналне путеве у регрутовању цитоплазматског Двл-а на ћелијску мембрану. Пошто су претходни налази показали да се инверзија и Двл колокализују у ћелијама епитела бубрега, може се спекулисати да би инверзија такође могла имати улогу у неканонској сигнализацији. Дисрегулација Внт-сигнализације посредована инверзијом изазива аберантну пролиферацију у тубулима [31]. Генетски тестови су открили мутацију ДВЛ-1 код пацијената са аутозомно доминантним Робинов синдромом, што представља хетерогене поремећаје код неких пацијената повезаних са урогениталним ибубрежнианомалије [32].
ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ БУБРЕЖНУ/БУБРЕЗНУ ДИЈАЛИЗУ
Развојни образац експресије -тубулина, инверзије и ДВЛ-1 је истражен на различитим животињским моделима. Тако је њихова експресија у пронефросу Ксенопус лаевис потврђена применом интравиталне микроскопије [31], док су у ћелијским линијама добијеним из проксималних тубуларних ћелија миша применом конфокалне микроскопије и масене спектрометрије пронађене [33]. Поред тога, светлосна микроскопија и двострука имунофлуоресценција открили су њихово присуство у деловима мишевабубрези[34]. Студије на инверзионим нокаут мишевима су пријавиле увећане, дифузне цисте убубрежнимедула и кортекс повезани са ситус висцералном инверзијом [35]. Код људи, мутација инверзије је представљена инфантилном нефронофтизом која је довела до прекида трудноће [36]. Упркос бројним студијама обубрежни-тубулин, инверзија и образац и функција ДВЛ{1}} експресије, према нашем најбољем сазнању, образац експресије ових протеина у људском феталном и постнаталном људском ткиву још увек није истражен и доведен до корелације. Поред тога, нису пријављени докази који би разматрали експресију инверзије и ДВЛ-1 у раном људском развоју. Стога је ова студија имала за циљ да анализира просторни и временски образац експресије -тубулина, инверзије и ДВЛ-1 током феталног и постнаталног стадијума здравог човекабубрези, као и убубрегаткива МЦДК, ФСГС и ЦНФбубрезикако би се утврдила могућа карика која недостаје између ових субјеката. Наиме, предлажемо да поремећени обрасци експресије -тубулина, инверзије и ДВЛ-1 протеина могу бити основни процес цистогенезе и абнормална функција примарних трепетљика што доводи до хроничнеболести бубрега.
Резултати
Анализа развојног и постнаталногбубрегаткива вршена је на изразито диференцираним структурамабубрег:проксимални увијени тубули (пцт), дистални увијени тубули (дцт) и гломерули (г). Током анализираних развојних фаза и у постнаталнимбубрегаткива, -тубулин, инверзија и ДВЛ-1 су показали позитивне обрасце експресије, али са разликама у интензитету, дистрибуцији и количини. Анализа патолошкогткиво бубрегаМЦДК, ФСГС и ЦНФ је урађен на пуном броју позитивних ћелија у поређењу са контролом здравог бубрежног ткива.
2.1. Светлосна микроскопија, електронска микроскопија и имунохистохемија (-Тубулин) здравог и патолошки промењеног постнаталног људског бубрежног ткива
2.1.1. Здрава постнатална светлост бубрега
микроскопија постнаталногбубрегаткиво показује добро дефинисанобубрегаструктуре, са јасном разликом између медуле и кортекса и формирања пцт, дцт и г у кортикалном региону. Имунохистохемијско бојење -тубулина открива присуство једне примарне цилије у центру апикалне ћелијске површине сваке тубуларне ћелије и у 0.018 процената ± 0,00014 процената СД на површини гломеруларних ћелија. Електронска микроскопија показује присуство само једне примарне цилије која произлази из базалног тела на површини апикалне ћелије тубула (Слика 1а).
2.1.2. ЦНФ
Већина анализираних г је мања и лобулирана (80 процената), док је мањина нормалне величине или хипертрофична (20 процената, н=100). Нађена је сегментна или глобална склероза г, док су пцт и дцт делимично проширени и обложени атрофичним епителом. Ултраструктурно се примећује губитак микровила и смањење висине ћелије са мултифрагментацијом језгара. У подоцитима, процеси стопала су дифузно изгубљени. Примарне тубуларне цилије су неорганизоване, посебно у цистама проксималних тубула, показујући промене у дужини и положају цитоплазме (Слика 1б).
2.1.3. МЦДК
У бубрежном ткиву се могу наћи спорадични незрели и зрели г.Бубрегткиво је испуњено бројним овалним цистама. Колумнарне епителне ћелије покривају цисте и окружене су лабавим везивним ткивом. Имунохистохемијско бојење на -тубулин показује вишеструке дугачке и неорганизоване примарне цилије на површини епителних ћелија (Слика 1ц).
2.1.4. ФСГС
У 90 процената г налази се екстензивна сегментна склероза (н=100), повезана са интерстицијалном фиброзом и знацима тубуларног оштећења. У електронском микроскопу се налази смањење висине епителних ћелија са губитком микровила, док ендотелне ћелије и мезангијални региони имају правилну ултраструктуру. У електронском микроскопу, изузетно дуга и дислоцирана (децентрализована) цилија се уочава на површини дисталне тубуларне ћелије (слика 1е). Подоцити показују дифузни губитак процеса стопала са екстензивним микровилусним ткивом. Имунохистохемијско бојење на а-тубулин показује вишеструке дугачке и неорганизоване примарне цилије на површини епителних ћелија (Слика 1ц).
2.2. Имунохистохемијско бојење на 心Тубулин, инверзија и ДВЛ-1- и статистичка анализа развојних и здравих постнаталних људских бубрега
У 14., 15. и 16. недељи гестације,бубрегаткиво је представљено различитим развојним фазама формирања нефрона: од метанефричних чашица,бубрежнивезикуле да командују нефронима у облику слова С, формирајући тако нефрогену зону у спољашњем кортексу (Слика 2). Разликовање пцт, дцт и г може се уочити у кортикалним регионима ближимбубрегамедула. Током 22. ГВ, делови медуле и кортекса постали су јасно препознатљиви, док су у 38. ГВ,бубрегаструктуре се појављују као високо диференциране, које садрже зреле облике пцт, дцт и г
2.2.1. а-Тубулин
Током развоја, а-тубулин је снажно изражен у свим развојнимбубрегаструктуре, првенствено визуелизујући облик примарних цилија на површинама паријеталних епителних ћелија Бовманове капсуле, г, пцт и дцт. У склопубубрегаткиву, 82—97 процената пцт ћелија експримира а-тубулин, док у дцт експресија опада са 99 процената на 72 процената у 38. ГВ (види слику 3, табела 1). Међу различитим развојним фазама, најјачи израз а-тубулина налази се у г 16. ГВ.бубрези, који садржи 93 процента позитивних ћелија. гипки 14., 15. и 22. ГВ (видети слику 3а,б, табела 1), око 70 процената г ћелија експримира а-тубулин, док је најмања експресија примећена у 38. ГВ (п < 0,01)="" са="" 34="" процента="" позитивних="" ћелија="" (слика="" 3ц).="" у="">бубрегаткиво (1.5-год. и 7-годбубрези), најјача имунореактивност на а-тубулин је примећена на површини апикалне ћелије пцт и дцт (слика 3д-ф). Експресија а-тубулина је такође присутна у перинуклеарној цитоплазми дцт и паријеталним епителним ћелијама Бовманове капсуле. а-тубулин све мрљебубрежниструктуре са средњим вредностима од 50 процената позитивних ћелија у пцт, 94 процента у дцт и 85 процената у г (Слика 3ф). Дцт мрље се значајно разликују од пцт (п < 0,0001).="" све="" испитиване="" структуре="" имају="" позитивну="" мрљу="" на="" а-тубулин,="" са="" 77="" процената="" позитивних="" ћелија="" у="" пцт,="" 72="" процената="" у="" дцт="" и="" 58="" процената="" у="" г="">
Слика 3. Имунофлуоресцентно бојење -тубулина и ДАПИ у ткивима бубрега у развоју и постнаталним људским бубрезима (а–е). Бубрези 14., 15./16., 38. ГВ (а–ц);бубрезиод 1.5- и 7-годишње деце (д,е). Позитивно бојење -тубулина (стрелице) је приказано у свакој структури у кортексу кроз развојне и постнаталне фазе (а–е), проксималне увијене тубуле (пцт), дисталне увијене тубуле (дцт) и гломеруле (г). Детаљи примарних цилија у пцт (д) и дцт (а–ц,е) приказани су као уметци већег увећања (бела кутија). Увећање ×40, скала бар 100 µм. Дистрибуција -Тубулин позитивних ћелија по структури кроз различите фазе развоја иу постнаталном периоду приказана је на графикону (ф). Графикон (г) (укупан број протеин позитивних ћелија у посматраним структурама) приказује експресију протеина у вези са временом развоја (линеарна регресија) и међуоднос -Тубулина са ДВЛ-1 кроз развој и сазревање (двосмерна АНОВА праћена СИДАК-ов постхоц тест). Подаци су приказани као средња вредност ± СД.
Дистрибуција -тубулин-позитивних ћелија по структури кроз различите фазе развоја иу постнаталном периоду приказана је на графикону (ф). Графикон (г) (укупан број протеин позитивних ћелија у посматраним структурама) приказује експресију протеина у вези са временом развоја (линеарна регресија) и међуоднос -тубулина са ДВЛ-1 кроз развој и сазревање (двосмерна АНОВА праћена Сидаков пост хоц тест). Подаци су приказани као средња вредност ± СД.
2.2.2. Двоструко имунофлуоресцентно бојење до инверзије и ДВЛ-1 и ДАПИ нуклеарна мрља у развоју и здрава експресија постнаталне инверзије бубрега у развоју и постнаталног бубрежног ткива
У 14., 15. и 16. ГВ, инверзија показује јаку грануларну експресију у г, и благу грануларну експресију у цитоплазми пцт и дцт (слика 4а,б), док у 22. и 38. ГВ (видети слику 4ц), снажно позитивна експресија се примећује у г (табела 1). Између 14. и 22. ГВ, око 50 процената ћелија изражава верзију. У 16. ГВ, пцт ћелије изражавају инверзију у 73 процента ћелија, док се смањују на 29 процената ћелија (п < 0,05)="" у="" 38.="" гв="" (видети="" слику="" 4ф).="" позитивна="" експресија="" инверзије="" налази="" се="" у="" приближно="" 80-90="" процената="" дцт="" и="" г="" ћелија="" у="">бубрегаткива 14. и 16. ГВ, са најнижом експресијом у дцт од 38. ГВ (п < 0.05,="" п="">< 0,0001,="" респективно)="" где="" је="" 66="" процената="" ћелија="" било="" позитивно.="" у="">бубрези, пцт снажно мрље на апикалној ћелијској мембрани, док дцт углавном мрље на базалној ћелијској мембрани и у перинуклеарној цитоплазми (Слика 4д, е). У тој фази смо нашли израз инверзије код свих испитиванихбубрежниструктуре, укључујући пцт, дцт и г, са средњом експресијом позитивних ћелија од 92 процента за пцт, 88 процената за дцт и 90 процената за г (Слика 4ф). Нисмо приметили значајну разлику у јачини сигнала експресије инверзије између структура. Највећа експресија инверзије налази се у г, са просечним 94 процента позитивних ћелија (слика 4ф). Значајна разлика је пронађена у поређењу бојења г (где је 94 процента ћелија позитивно обојено) са пцт, где је 58 процената ћелија позитивно обојено (п < 0.01)="" и="" са="" дцт,="" где="" је="" 49="" процената="" ћелија="" позитивно="" (п="">< 0,0001,="" слика="">
Експресија ДВЛ-1 у развоју и постнаталном бубрежном ткиву
Блага до јака експресија ДВЛ{{0}} је примећена у цитоплазми пцт, дцт и г у феталном периоду (видети слику 4а–ц, табела 1). У пцт, 76–86 процената ћелија изражава ДВЛ-1 у 14.–22. ГВ, док у 38. ГВ има 57 процената позитивних ћелија (Слика 4г). У дцт 14. и 15. ГВ, 68–70 процената ћелија изражава ДВЛ-1, у 16. и 22. ГВ, број позитивних ћелија пада на 42–5{{41} } процената, док је у 38. ГВ експресија (п < 0,001),="" примећена="" у="" 19="" процената="" дцт="" ћелија.="" експресија="" двл-1="" се="" повећава="" у="" г="" кроз="" феталне="" фазе:="" у="" 14.="" гв="" износи="" 6="" процената,="" док="" се="" у="" 15.,="" 16.="" и="" 22.="" гв="" повећава="" на="" 10="" процената="" (п="">< 0,01).="" у="" 38="" гв,="" 14="" процената="" г="" ћелија="" изражава="" двл-1="" (слика="" 4="" г).="" у="" постнаталном="" периоду,="" двл-1="" имунореактивност="" је="" дисперзована="" у="" цитоплазми="" (табела="" 1)="" и="" пцт="" и="" дцт="" (слика="" 4д,е).="" сигнал="" се="" налази="" у="" свим="" истраживаним="" структурама,="" али="" највише="" у="" перинуклеарној="" цитоплазми.="" интензитет="" двл-1="" експресије="" је="" значајно="" већи="" у="" пцт="" у="" поређењу="" са="" дцт="" и="" г="" (п="">< 0,01).="" 39–45="" процената="" ћелија="" у="" пцт="" и="" дцт="" изражава="" двл-1,="" док="" је="" у="" г="" 21="" проценат="" ћелија="" позитивно="" (слика="" 4="" г).="" нисмо="" пронашли="" значајну="" разлику="" између="" процента="" имунореактивних="" ћелија="" у="">бубрежниструктуре. Проценат ДВЛ-1 имунореактивних ћелија је 34 процента у пцт, 36 процената у дцт и 27 процената у г, респективно (Слика 4г).
Слика 4. Двоструко имунофлуоресцентно бојење инверзије (зелено), ДВЛ-1 (црвено) и ДАПИ (плаво) у ткивима бубрега у развоју и након рођења (14.–38. ГВ, 1.5- и {{6 }}годишње бубрежно ткиво). Позитивно бојење (стрелице) је приказано у свакој структури током свих фаза развоја (а–ц) и постнаталног периода (д,е). Спојени микрофони заједно са структурама од интереса у кортексу: проксимални увијени тубули (пцт), дистални увијени тубули (дцт) и гломерули (г). Колокализација инверзије/ДВЛ-1 (глава стрелице) је приказана на спојеним микрофотографијама. Негативне контролне бојење су приказане као уметци на инверзији и ДВЛ-1 (а). Еритроцити се могу видети као снажно обојене ћелије у близини дцт. Детаљи су приказани као уметци већег увећања. Увећање ×40, скала бар 100 µм. Динамичка позитивна ћелијска дистрибуција инверзије и ДВЛ-1 у структурама бубрега (пцт, дцт, г) током развојних и постнаталних фаза приказана је на графиконима (ф,г). Графикон (х) приказује експресију протеина (укупан број позитивних ћелија у структурама) у вези са временом развоја (линеарна регресија) и међуодносом инверзије на ДВЛ-1 кроз развој и сазревање (двосмерна АНОВА праћена Сидаковим пост хоц тестом ). Подаци су приказани као средња вредност ± СД.
Ко-експресија инверзије и ДВЛ-1 је примећена у цитоплазми бубрега г, дцт и пцт током развоја (видети слику 4а–ц, спајање). У постнаталном периоду, коекспресија инверзије и ДВЛ-1 карактерише различите ћелијске компартменте тубуларних ћелија у пцт и дцт, док коекспресија у г карактерише јака преваленца експресије инверзије (види слику 4д, спајање ). У 7-годишњој постнаталним бубрезима, ко-експресија инверзије и ДВЛ-1 се види у тубуларним ћелијама дцт и пцт, и у г где експресија инверзије благо преовладава у поређењу са ДВЛ-1 (Слика 4е, спајање).
2.2.3. Разлике у експресији -тубулина, инверзије и ДВЛ-1 између различитих развојних фаза бубрега и постнаталних бубрега
Број -тубулин-позитивних ћелија у пцт феталног бубрежног ткива био је статистички значајно већи у поређењу са бубрежним ткивом деце 7-годишње деце (13. (п < 0.0{="" {11}}1),="" 15.="" (п="">< 0.0001)="" и="" 16.="" (п="">< 0.00001)="" гв).="" дцт="" раних="" феталних="" стадијума="" (13.,="" 15.,="" 16.="" и="" 22.="" гв)="" је="" имао="" више="" позитивних="" ћелија="" у="" поређењу="" са="" бубрежним="" ткивом="" деце="" 38.="" гв="" и="" 1.{19}}="" године="" (п="">< 0,0001,="" слика="" 3ф).="" када="" смо="" упоредили="" различите="" развојне="" фазе,="" нашли="" смо="" ниже="" нивое="" експресије="" инверзије="" у="" пцт-у="" 13.="" (п="">< 0,0001),="" 15.="" (п="">< 0,00001),="" 22.="" (п="">< 0,001)="" и="" 38.="" (п="">< 0,0001)="" гв="" у="" поређењу="" са="">бубрежниткива од 1.5-годишњег детета. У дцт, статистички значајно нижа експресија инверзије је пронађена упоређујући ткиво бубрега од 16. ГВ са 38. ГВ (п < 0.0001).="" штавише,="" нижа="" експресија="" инверзије="" у="" дцт="" је="" примећена="" у="" бубрежном="" ткиву="" детета="" 7-="" године;="" упоређивање="" 13.,="" 15.="" (п="">< 0,001,="" оба),="" 16.="" и="" 1.5-годишње="" бубрежно="" ткиво="" са="" дцт="" 7-годишњег="" бубрежног="" ткива="" (п="">< 0,00001,="" респективно,="" слика="" 4ф).="" уочени="" сигнал="" експресије="" двл-1="" кроз="" различите="" фазе="" открио="" је="" да="" је="" пцт="" 13.="" (п="">< 0,01),="" 15.,="" 16.="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">
2.2.4. Веза између експресије -тубулина и инверзије на ДВЛ-1 у развоју и постнаталног бубрежног ткива
- Експресије тубулина и инверзије су упоређене са експресијом ДВЛ-1 током развојних фаза иу постнаталном бубрежном ткиву. -тубулин је имао статистички већу експресију у свим посматраним фазама, у поређењу са експресијом ДВЛ-1 (п < 0.001,="" слика="" 3г).="" кроз="" све="" посматране="" фазе,="" инверзија="" је="" имала="" већу="" експресију="" у="" поређењу="" са="" двл-1="" (п="">< 0,0001,="" слика="" 4="">
2.2.5. Поређење имунохистохемијског бојења са -тубулином, верзија и ДВЛ-1- и Статистичка анализа патолошки промењеног ткива бубрега (МЦДК, ЦНФ, ФСГС) -Тубулин Разлика бојења -тубулина у МЦДК, ФСГС и ЦНФ била је статистички значајна у поређењу на здраво постнатално бубрежно ткиво као контролну групу (п < 0.0001,="" респективно).="" диспластична="" ткива="" бубрега="" имала="" су="" значајно="" већу="" експресију="" у="" поређењу="" са="" контролном="" групом,="" док="" су="" фсгс="" и="" цнф="" показали="" значајно="" нижу="" експресију="" -тубулина="" у="" поређењу="" са="" здравом="" контролом="" (слика="">
Инверзија
Инверзија је изражена у цитоплазми неорганизованих епителних ћелија и тубула МЦДК (Слика 5а). У ЦНФ, експресија инверзије карактерише г и дцт, док се мање интензивно показује у пцт цистама (слика 5б). У ФСГС, инверзија је снажно изражена у г и дцт, али мање интензивно у пцт цистама (Слика 5ц). Просторна експресија инверзије је показала статистички значајну већу стопу бојења у здравим ткивима бубрега (Слика 5г) у поређењу са МЦДК, ФСГС и ЦНФ (п < 0.0001,="">
Слика 5. Двоструко имунофлуоресцентно бојење инверзије (зелено), ДВЛ-1 (црвено) и ДАПИ (плаво) у патолошким ткивима бубрега у МЦДК (а), ЦНФ (б) и ФСГС (ц): тубуле (т) , гломерули (г), пцт циста (ц), висина пцт епителних ћелија (*). Структура и ко-локализација ћелија инверзије и ДВЛ-1 (главе стрелица) су приказане у спојеним одељцима са детаљима у уметнутим елементима већег увећања. Негативне контролне бојење су приказане као уметци на инверзији и ДВЛ-1 (а). Увећање ×40, скала 10{{20}} µм. Однос -тубулина (д) и инверзије (е) према ДВЛ-1 експресији у МЦДК, ФСГС и ЦНФ (двосмерна АНОВА праћена СИДАК-овим пост хоц тестом). Разлика у висини епителних ћелија (ф) ФСГС, ЦНФ и МЦДК пцт у поређењу са здравом контролом (једносмерна АНОВА праћена Тукеијевим пост хоц тестом, н=50). Разлика у укупном проценту позитивних ћелија -тубулина, инверзије и ДВЛ-1 у МЦДК, ЦНФ и ФСГС у поређењу са здравом контролом (г–и), једносмерна АНОВА праћена Тукеијевим пост хоц тестом). Подаци су приказани као средња вредност ± СД. Значајне разлике су означене п-вредношћу (* п < 0,05,="" **="" п="">< 0,01,="" ****="" п="">< 0,0001).="" двл-1="" двл-1="" је="" веома="" благо="" изражен="" само="" у="" неорганизованим="" тубулима="" мцдк,="" док="" у="" цнф="" његова="" експресија="" карактерише="" дцт="" и="" г="" (слика="" 5а,б).="" у="" фсгс,="" двл-1="" се="" примећује="" као="" блага="" реактивност="" у="" г,="" дцт="" и="" пцт="" (слика="" 5ц).="" здрава="" ткива="" бубрега="" обојена="" на="" двл-1="" показала="" су="" значајно="" већу="" стопу="" бојења="" (слика="" 5="" х)="" за="" разлику="" од="" мцдк="" и="" фсгс="" (п="">< 0,0001,="" оба),="" док="" за="" цнф="" није="" пронађена="" значајна="">
2.2.6. Веза између експресије -тубулина и инверзије на ДВЛ-1 у патолошки промењеном ткиву бубрега (МЦДК, ЦНФ, ФСГС)У МЦДК, ФСГС и ЦНФ, -тубулин је обојен знатно више од ДВЛ-1 (п < 0.0001,="" респективно,="" слика="" 5д).="" инверзија="" је="" значајно="" већа="" у="" поређењу="" са="" двл-1="" у="" мдцк="" (п="">< 0,0001)="" и="" у="" фсгс="" (п="">< 0,01,="" слика="">
2.2.7. Разлике у висини епителних ћелија проксималних увијених тубула између здраве контроле и патолошки промењеног ткива бубрега (МЦДК, ЦНФ, ФСГС)Висина пцт епителних ћелија (н {{0}} по групи) је упоређена између ћелија тубула у здравом ткиву бубрега и патолошки измењеним ткивима бубрега (Слика 5б,ц,ф). Средња висина епителних ћелија у ХЦ била је 12,91 µм ± 1,847 µм и била је значајно виша у поређењу са ЦНФ и ФСГС (п < 0.0001,="" респективно).="" средња="" висина="" ћелије="" у="" цнф="" пцт="" била="" је="" 9,011="" µм="" ±="" 1,453="" µм,="" док="" је="" у="" фсгс="" била="" 8,114="" µм="" ±="" 0,9248="" µм.="" пцт="" епителне="" ћелије="" мцдк="" нису="" показале="" значајне="" промене="" у="" висини="" (12,17="" µм="" ±="" 1,476="" µм)="" у="" поређењу="" са="">
2.2.8. Разлике у дужини примарне цилије између здраве контроле и патолошки промењеног ткива бубрега (МЦДК, ЦНФ, ФСГС)
Примарна дужина цилиума (н= 50 по групи) је упоређена између ХЦ и патолошки измењеног ткива бубрега (Слика 6ц). Здрава ткива бубрега и МЦДК су обојени -тубулином да би се уверила специфичност бојења -тубулина цилијумом (слика 6а,б). У здравом ткиву бубрега примарни цилијум је био дугачак 5,065 µм ± 1,229 µм, док су у МЦДК, ЦНФ и ФСГС били значајно дужи (п<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>
Дискусија
Циљ нашег истраживања био је да се испита имунохистохемијска експресија а-тубулина, инверзије и ДВЛ-1 код фетуса.бубрежниткива и постнаталног ткива бубрега. Штавише, желели смо да истражимо да ли је експресија и образац бојења а-тубулина, инверзије и ДВЛ-1 поремећен код различитих болести бубрега у поређењу са здравом контролом. Наиме, упркос великом интересовању других истраживача за улогу а-тубулина, инверзије и ДВЛ-1 током развоја бубрега, већина претходних студија је користила животиње или ин витро експерименталне моделе. Колико нам је познато, ово је прва студија која је показала експресију и локализацију а-тубулина заједно са инверзијом и ДВЛ-1 у феталним и постнаталним људским бубрезима, а која је истраживала експресију поменутих протеина у бубрезима болести, као што су МЦДК, ФСГС и ЦНФ. Такође смо анализирали промене у дужини и изгледу цилија помоћу светлосне и електронске микроскопије, пошто је наша претходна студија већ показала да поремећаји цилијара могу бити повезани са цистогенезом у ФСГФ и ЦНФ [19].
У канонском Внт-сигналном путу, везивање Внт лиганада за рецепторе регрутује Двл [37]. Процеси МЕТ и путање поларитета планарне ћелије током раних фаза морфогенезе бубрега контролишу се Внт сигнализацијом. Посредовањем Внт пута, примарне цилије контролишу ћелијску пролиферацију, диференцијацију и морфогенезу ткива [12] кроз организовање ћелијског цитоскелета и оријентације ћелије, као и елонгације тубуларне структуре [2,38]. У нашој студији, -тубулин, инверзија и ДВЛ-1 су били присутни у структурама бубрега, и сви су колокализовани не само током развоја феталног бубрега већ и у ткиву бубрега од 1.5- и {{9 }}годишња деца. Ови налази су у сагласности са активацијом Внт-сигналног пута за који је доказано да се јавља већ током тубулогенезе [39]. Поред тога, наши резултати су открили да су експресија -тубулина и инверзија реципрочно повезани са ДВЛ-1 и да показују статистички значајну разлику између њихових образаца експресије. То је у корелацији са експерименталним моделима, пошто мутација пуне породице Двл протеина код мишева доводи до недостатка процеса гаструлације, док мутације које не укључују целу породицу протеина показују дефекте у нодалном постављању цилија заједно са дефектима органа [40] . Претходни налази сугеришу да инверзија има улогу у миграцији ћелија у Ксенопус пронепхрос. Пошто је тај сегмент у корелацији са Хенлеовом петљом код сисара и дисталним тубулима, то би могло да укаже на важност инверзије током развоја бубрега и код људи [41]. У складу са том претпоставком, претходне студије су откриле да мутација инверзионог гена може довести до нефронофтизе типа 2, која је посредована абнормалном експресијом ДВЛ-1 [42]. Упркос томе што је улога примарне цилије контроверзна у регулацији Внт-сигналног пута, открили смо да је -тубулин колокализован са инверзијом и ДВЛ-1 у анализираним узорцима бубрега. Штавише, претходне студије су истакле да примарни цилиум заједно са инверзијом регулише деградацију Двл-а утичући на Внт-сигнални пут [43]. Код болести бубрега код људи повезаних са развојем циста, примећена је абнормална локализација и функција примарних цилија [19]. Слично томе, ова студија је такође потврдила морфолошке промене формирања примарних цилија у патолошким стањима као што су ЦНФ, ФСГС и МЦДК. Претходни налази су потврдили да прекомерна активација канонског Внт пута након оштећења бубрега доводи до неповратних структурних промена бубрежног ткива [44]. Напротив, примарној цилијуму је дата улога преласка са канонског на неканонски Внт пут у помагањубубрежнипоправити. Штавише, утврђено је да прекомерна активација канонског Внт пута у трансплантираном бубрежном ткиву има позитивну предиктивну вредност према фибрози бубрега [45]. Ако канонски Внт пут превладава на рачун неканонског, он подржава теорију о фибрози бубрега као исходу. Наши налази о смањеној експресији -тубулина и инверзије у ЦНФ и ФСГС имплицирају неактивност неканонског Внт пута, посебно пошто оба услова имају тенденцију да доведу до завршне фазебубрежна болест.Наиме, сматра се да нормална локализација и функција примарног цилијума може бити фактор у одржавању правилног Внт пута и самим тим предуслов за нормалан развој. Насупрот томе, ако је Внт пут побољшан, то може довести до нерегулисане ћелијске пролиферације и диференцијације која доводи до карциногенезе [46]. Као што је претходно описано, канонски Внт пут је обавезан за иницирање МЕТ-а и формирање нефрона, док његов поремећај може довести добубрежнихипоплазија [47]. Наши резултати подржавају ову идеју откривањем најниже експресије ДВЛ-1 са највећом експресијом -тубулина у МЦДК у поређењу са здравом контролом. Ови резултати могу имплицирати најнижу активацију канонског Внт пута, што би могло бити основни узрок одсуства формирања нефрона. Насупрот томе, највећа експресија -тубулина са најнижом експресијом ДВЛ-1 може објаснити налазе више циста јер не постоји организовано елонгација и ћелијска поларизација вођена неканонским Внт путем. Претходне студије су такође показале да инверзија инхибира канонски Внт сигнални пут циљајући Двл ради деградације [26]. Утврђено је да је овај корак у њиховој интеракцији неопходан да се инхибира канонски Внт-сигнал у одржавању нормалног издужења и позиционирања цеви. Инверзиона мутација доводи до повећања канонске Внт сигнализације, што је касније изазвало абнормалну пролиферацију у тубуларним ћелијама. Показало се да је овај корак кључан у цистогенези [42], док нокаут инверзије код мишева доводи до полицистичне болести бубрега [48]. Према теорији обубрежницистогенезе, инверзија се сматра "микопротеином", због своје локализације на примарним цилијама убубрежницевасте ћелије. У нашем истраживању примарне цилије су биле присутне на апикалној ћелијској површини тубуларних ћелија у свим анализираним стадијумима, док је у феталним фазама експресија -тубулина била јача него у постнаталном периоду.
ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ БОЛ БУБРЕГА/БУБРЕГА
Претходне студије су показале да на функцију примарне трепавице може утицати дисрегулација -тубулина током развоја, што може довести до цистогенезе, абнормалног развоја бубрега и могуће хроничне болести бубрега у детињству [31,49]. Ово је у складу са нашим налазима скраћених и дисморфних примарних цилија уочених у МЦДК или са вишеструким и екстремно издуженим или дислоцираним цилијама пронађеним у проширеним тубулима ЦНФ и ФСГС у поређењу са здравом контролом. Да бисмо подржали чињеницу да се канонски и неканонски Внт-сигнални путеви, регулисани примарним цилијама, сматрају обавезним за нормалан развој бубрега, открили смо значајно ниже бојење инверзије и ДВЛ-1 у МЦДК у поређењу са здравом контролом [31,49]. Различита динамика обрасца експресије -тубулина, инверзије и ДВЛ-1 током различитих фаза развоја бубрега може указивати на пребацивање између канонског и неканонског Внт-сигналног пута током нормалне морфогенезе бубрега. Предлажемо да њихова размена одређује транскрипцију у канонском путу или редоследу миграције ћелија и поларизације током развоја бубрега у неканонском сигналном путу. Њихова равнотежа и израженост у свим истраживаним структурама бубрега имплицира њихову важну улогу у нормалном развоју бубрега. Током нормалног развоја бубрега (од 13. ГВ до 38. ГВ), укупна експресија -тубулина, инверзије и ДВЛ-1 се смањује како ткиво бубрега добија зрелу морфологију. У ткивима бубрега старим 1.5- и 7--тубулин и инверзија су показали благи пораст експресије што подржава чињеницу да неканонски Внт пут остаје активан након рођења. Напротив, ДВЛ-1 опстаје са смањеним обрасцем експресије, што би могло додати закључку да је канонски Внт пут утишан у здравом ткиву бубрега. Као резултат патолошких стања бубрега, епителне ћелије бубрега могу реаговати поновним појављивањем ЕМТ-а и фиброзе [50] повезане са реактивацијом канонског Внт пута [44]. Стога, поремећаји -тубулина, инверзије и ДВЛ-1 који се налазе у оболелим бубрезима могу бити основни патолошки механизам и резултат преласка са неканонског на канонски Внт пут у бубрегу у развоју, алудирајући на прелазак са реверзибилног на иреверзибилни бубрег оштећења. Штавише, промене у њиховом пренаталном и постнаталном периодубубрежниобразац експресије може бити повезан са оштећењем функције бубрега у одраслом добу, што доводи до урођених болести и хроничне бубрежне инсуфицијенције.
4. Материјали и методе
4.1. Хуман Самплес
Узорци ткива бубрега фетуса прикупљени су након губитка трудноће у 14., 15., 16., 22. и 38. ГВ на Клиници за гинекологију и акушерство КБЦ-а Сплит. Сав добијени фетални материјал прегледан је од стране патолога, а за испитивање су коришћена само ткива без знакова абнормалности, мацерација или интраутерине смрти и са нормалним кариограмом. Медицински картони мајки су прегледани пре узимања узорка и у случају здравствених проблема који би могли утицати на исход трудноће, ткива бубрега су искључена из студије. Зрелост је одређивана обимом главе, обимом абдомена и дужином бутне кости [51] у корелацији са менструалним календаром пацијената. Узорци бубрежног ткива старости 1.5- и 7- године прикупљени су након случајне смрти. Узорци су добијени на Одјелу за патологију КБЦ-а Сплит. Узорци мултицистичног диспластичног ткива бубрега (МЦДК) добијени су након губитка трудноће, фокалне сегментне гломерулосклерозе (ФСГС) и нефротског синдрома финског типа (ЦНФ) услед нефректомије. Сав добијени материјал прегледао је и оценио патолог, који је класификовао дијагнозе. Протокол студије одобрио је Етички одбор Медицинског факултета Универзитета у Сплиту (20. маја 2016.) у складу са Хелсиншком декларацијом и њеним ажурирањима (класификациони број: 003-08/16-03/0001, регистарски број: 2181-198-03-04-16-0024, 20. мај 2016.) [52].
4.2. Имунохистоцхемистри
Фиксација сакупљеног узорка ткива је обрађена са 4 процента параформалдехида у физиолошком раствору пуферованом фосфатом (ПБС) током 24 х на 22 ◦Ц. Након дехидрације у 100% етанолу, узорци су стављени у парафин, као што је претходно описано [53]. Узорци су исечени на делове дебљине 5 µм коришћењем микротома и затим постављени на микроскопске плочице. Да би се потврдила очуваност ткива, сваки 10. пресек је обојен хематоксилином и еозином [54]. Департ-феминизација и имунохистохемија су обављене као што је претходно описано [2,55,56]. Након испирања у ПБС, микроскопски предмети су инкубирани преко ноћи са примарним антителима у влажној комори на 22 ◦Ц (СтаинТраи систем за бојење слајдова; Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, САД). Примарна коришћена антитела била су зечја моноклонска анти-алфа тубулинска антитела (разблаживање 1:1000; аб179484, Абцам, Кембриџ, УК), зечје поликлонско анти-инверзионо антитело (разблаживање 1:100; аб65187, Абцам, Цамбридге, УК моноцлонал ДВ), -1 антитело (разблаживање 1:150; сц-8025, Санта Цруз Биотецхнологи, Даллас, ТКС, САД) и зечје поликлонско анти-гама тубулинско антитело (како би се верификовало примарно бојење специфично за цилије алфа- тубулин, разблаживање 1:500; аб11321, Абцам, Кембриџ, УК). Након испирања у ПБС-у, секундарна антитела су давана сат времена како је наведено: магарећи анти-зечји ИгГ Х&Л, Алека Флуор 488 (разблаживање 1:400; аб150073, Абцам, Кембриџ, УК) и козји анти-мишји ИгГ Х&Л, ТРИТЦ (разблаживање 1:400; аб6786, Абцам, Цамбридге, УК) 4',6-диамидино-2-фенилиндол дихидрохлорид (ДАПИ) је коришћен за бојење језгара и након 2-мин инкубације, слајдова су опрани у ПБС-у и прекривени медијумом за монтажу и покровним стакалцима. Неспецифично бојење је спречено коришћењем протеинског блока (аб64226; Абцам, Цамбридге, УК) пре примарне примене антитела. Као негативна контрола урађен је предадсорпциони тест, док је специфичност секундарних антитела проверена изостављањем примарних антитела из поступака бојења.
4.3. Електронска микроскопија
Фикатион офбубрегаткива је изведена у 4% параформалдехида током 24 х, након чега је уследила накнадна фиксација у 1% осмијум тетроксиду током 1 х. Процес дехидратације је изведен са серијом етанола и завршен је уградњом у смолу ЛКС 112 [22]. Танки делови од једног микрометра су обојени толуидин плавим и проучавани да би се одабрали ултратанки делови. Ултратанки пресеци дебљине 0.05 микрометара су испитивани након бојења уранил ацетатом и олово цитратом. За добијање микрофотографија коришћен је микроскоп ЈЕОЛ 1200 ЕКС.
4.4. Генетска анализа
Као што је претходно описано [19], коришћењем леукоцита из периферне крви, екстрахована је геномска ДНК. Пронађена је хомозиготна миссенс мутација у гену НПХС1 (ц.1096А > Ц; п.Сер366Арг) што је потврдило дијагнозу конгениталног нефротског синдрома финског типа (ЦНФ) [57].
ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ ИНФЕКЦИЈУ БУБРЕГА/БУБРЕГА
4.5. Анализа података
Анализа пресека је изведена на ФЛ флуоресцентном микроскопу коришћењем 3 ФЛ флуоресцентна канала (Олимпус БКС51, Токио, Јапан). Слике су снимљене дигиталном камером ДП71 (Олимпус, Токио, Јапан) на повећању велике снаге (×40). Самобубрежникортекс који садржи проксималне увијене тубуле (пцт), дисталне увијене тубуле (дцт) и гломеруле (г) били су од интереса. Слике су затим обрађене софтвером ИмагеЈ (Расбанд, ВС, ИмагеЈ, УС Натионал Институтес оф Хеалтх, Бетхесда, МД, САД, хттпс://имагеј.них.гов/иј/ (приступљено 15. октобра 2018), 1997–2021. ) и Адобе Пхотосхоп (Адобе Инц., Сан Хозе, Калифорнија, САД) за даљу процену. Пре бројања ћелија, коришћен је алат ИмагеЈ подељених канала. Након тога, оригинална имунофлуоресцентна микроскопска фотографија је одузета црвеним или зеленим каналом (у зависности од оригиналног канала) помоћу алатке ИмагеЈ калкулатора слике да би се спречило цурење сигнала. Вредности испод нивоа прага 50 сматране су негативним. Пребројали смо имунореактивне сигнале у ћелијама од најмање 20 структура (пцт, дцт или г) по фази или укупан позитиван број ћелија по микро фотографији мултицистичне диспластикебубрегаткива, ФСГС и ЦНФ. Ћелије смо класификовали као позитивне ако се сигнал имунофлуоресценције акумулирао на било ком нивоу мембране, цитоплазме или језгра изнад вредности 50 мерене на софтверу ИмагеЈ коришћењем команде прага. Негативне ћелије су категорисане као ћелије са одсуством било какве имунореактивности. Два независна истраживача су анализирала податке.
4.6. Семиквантитативна анализа
Интензитет -тубулина, инверзије и ДВЛ-1 сигнала бојења су проценила два независна истраживача користећи софтвер ИмагеЈ. Укупни интензитет сигнала је мерен након што је слика постављена у 8-битни тип; након тога, интензитет бојења маркера је процењен у 20 пцт, дцт и г мерењем зацртане површине структуре. Ако су резултати између евалуатора били различити, трећи независни истраживач је разјаснио сумњу. Максимални интензитет сигнала за -тубулин био је 84,125 ± 3,214 СД, за инверзију 71,50 ± 2,715 СД и за ДВЛ-1 80.916 ± 1,875 СД. Највећа засићеност сигналне боје на фотографијама микроскопа означена је са 3 (66,66–99,99 одсто укупног интензитета сигналне слике), затим са 2 (33,33–66,66 одсто) за средњи интензитет сигнала и 1 (0,33 одсто –33,33 одсто) за низак интензитет сигнала (табела 1.).
4.7. Статистичка анализа
За одређивање разлика између степеница и структура, урађен је Крускал-Волисов тест, а затим Дунн-ов пост хоц коришћењем софтвера ГрапхПад Присм (Грапхпад Софтваре Инц., Сан Диего Калифорнија, САД, ввв.грапхпад.цом (приступљено 15. октобра). 2018.)). Број позитивних ћелија изражен је у процентима као средња вредност ± стандардна девијација (СД), док је статистичка значајност потврђена при п < 0,05.="" број="" анализираних="" структура="" био="" је="" 4200="" у="" 35="" узорака,="" са="" укупним="" бројем="" пребројаних="" 135.256="" ћелија.="" користили="" смо="" 2-начин="" анова="" са="" сидаковим="" пост="" хоц="" тестом="" да="" тестирамо="" разлике="" у="" експресији="" -тубулина,="" инверзије="" и="" двл-1="" у="" различитим="" развојним="" фазама.="" да="" бисмо="" проучавали="" експресију="" протеина="" у="" вези="" са="" временом="" развоја,="" користили="" смо="" линеарну="" регресију.="" једносмерна="" анова="" праћена="" тукијевим="" пост="" хоц="" тестом="" коришћена="" је="" за="" истраживање="" разлика="" у="" експресији="" -тубулина,="" инверзије="" и="" двл-1="" код="">бубрегаткива у поређењу са ткивима МЦДК, ФСГС и ЦНФ. Разлике у експресији протеина између МЦДК, ФСГС и ЦНФ истраживане су помоћу 2-начин АНОВА праћене Сидаковим пост хоц тестом. Једносмерна АНОВА праћена Тукеијевим пост хоц тестом коришћена је за процену разлика у дужини цилија и висини епителних ћелија пцт између здраве контроле и патолошкебубрегамарамице. Подаци су приказани као средња вредност ± стандардна девијација (СД) са статистичком разликом признатом на п <>
