Предња таламусна језгра: критични супстрат за непросторно упарено памћење код пацова, део 2

2|МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДЕ

2.1|Животиње и услови смештаја

Мужјаци Лонг-Еванс пацова (стари 12 месеци; просечно 630 г) смештени су у групе од по три или четири у Макролон кавезима (48 28 22 цм) на обрнутом 12- х светло-тамном циклусу (светло се укључује у 20 часова). ).

Тестирање понашања се одвијало у мрачној фази светлосног циклуса, пет сесија недељно; запажања су потврдила да су пацови били релативно активнији током мрачне фазе. Пацови су одржавани на 85% телесне тежине слободног храњења са водом ад либитум; храна је била ад либитум пре и после операције за постоперативни опоравак.

Хирургија је процес лечења болести и побољшања физичког здравља. Процес опоравка након операције захтева посебну пажњу. Поред физичког опоравка, добро осећање захтева и фокусирање на опоравак памћења. Постоји јака веза између постоперативног опоравка и памћења.

Током операције, фактори као што су реакција тела на невоље и ефекти анестетика често утичу на меморијску функцију мозга. Након што се тело опорави, обратите пажњу на правилну исхрану, умерено вежбање и адекватан сан. Током периода опоравка ван болнице, морате наставити да избегавате прекомерне активности и одржавате удобно стање тела.

Поред животних навика, разумна психолошка прилагођавања такође помажу у обнављању здравља и памћења. Опустите се, одржавајте миран ум и помозите себи да се прилагодите опоравку памћења. Истовремено, требало би да активно учествујете у рекреативним активностима и комуницирате са рођацима и пријатељима како бисте одржали мозак активним и побољшали своје когнитивне и меморијске способности. Ова активност се може постепено повећавати и може се радити у основи једном недељно.

Укратко, процес опоравка након операције захтева свеобухватну пажњу. Одржавање добрих животних навика и психолошких прилагођавања игра веома важну улогу у промовисању физичког опоравка и опоравка памћења. Суочимо се са тим позитивно, са пуним поверењем и надом. Морамо да побољшамо памћење, а Цистанцхе десертицола може значајно да побољша памћење, јер Цистанцхе десертицола такође може да регулише равнотежу неуротрансмитера, као што је повећање нивоа ацетилхолина и фактора раста. Ове супстанце су веома важне за памћење и учење. Поред тога, месо такође може побољшати проток крви и подстаћи испоруку кисеоника, што може осигурати да мозак добије довољно хранљивих материја и енергије, чиме се побољшава виталност и издржљивост мозга.

Кликните на сазнајте начине за побољшање функције мозга

Све процедуре су биле у складу са одобреним смерницама Комитета за етику животиња Универзитета у Кентерберију. Четири групе пацова су установљене случајним додељивањем након упознавања пре операције у лавиринту радијалне руке (РАМ) и писти. Четири групе су биле билатералне лезије АТН-а са или без трага између мириса и стимуланса предмета када су обучаване у задатку упареног сарадника и одговарајуће две групе Схам-лезија.

Коначне величине узорка су биле (1) лажно без трага=7 (тј. група лажних лезија без интервала између мирисних и предметних стимулуса који се користе у задатку упарени-сарадници); (2) Лажни траг=7 (Шамлезионој групи дат је 10- траг између презентације мириса и стимулуса објекта); (3) АТН-Но Траце=8; и (4) АТН-Траце=9. Додатни пацов са АТН лезијом је искључен јер није испуњавао критеријуме лезије (види доле).

2.2|Хирургија

Пацови су анестезирани изофлураном (индукција 4%; одржавање 2,5%) и смештени у стереотаксични апарат са атрауматским шипкама за уши (Копф, Тујунга, ЦА). Шипка секутића је постављена на 7,5 мм испод интерауралне линије да би се минимизирало оштећење форникса.

У свакој хемисфери, две инфузије су биле усмерене на антеровентрално језгро (АВ; горње и доње), а једна инфузија је усмерена на антеромедијално језгро (АМ). Свака хируршка интервенција користила је једну оффиор антериор-постериор (АП) координате у односу на Брегма-Ламбда растојање појединачног пацова (све вредности инмм). За АВ лезије, АП координате су биле: 2,20 за Б–Л 6,9–7,2; 2,25 за Б–Л 7,3 до 7,6; 2,30 за Б–Л Веће или једнако 7,7. АВ инфузије су направљене на 5,68 и 5,73 испод дуре и 1,52 латерално од средње линије.

Инфузија АМ је направљена {{0}}.1 мм напредније од АВ координате, на 5,76 испод дуре и 1,16 латерално; прва АМ лезија је направљена након завршетка свих АВинфузија и почела је контралатерално од последњег места АВ лезије. 0.15 М Н-метил-д-аспартат (НМДА; Сигма, ЦастлеХилл, НСВ) у 0.1 М фосфатном пуферу (пХ 7,20) је инфундирано у свако место при 0,04 ул у минути преко 2.{18}}улХамилтон шприц (Рено, НВ, САД) помоћу микро инфузионе пумпе (Стоелтинг, Воод Дале, ИЛ).

АВ ситепер хемисфера је добила {{0}}.12 и 0.10 ул за дорзална и вентрална места, респективно; 0,06 ул је коришћено за сваку АМ локацију. Игла шприца је остала ин ситу током 3 минпер стране, након инфузије.
Операције лажних лезија су користиле исту процедуру, али је игла спуштена на 1 мм изнад горњег АВ и АМ места лезије уз дату инфузију.

2.3|Задаци понашања

РАМ са осам кракова потврдио је оштећење просторне меморије код пацова са АТН лезијом након операције. Апарат за полетно-слетно-слетно-слетно-слетно-слетно-слетну стазу је коришћен за обуку пацова за све непросторне задатке, то јест, једноставно разликовање мириса и једноставних објеката и задатке упарени-сарадници мирис – објекат и мирис – траг – објекат.

Пре операције, пацови који су били ограничени на храну навикли су на РАМ са осам кракова, описан у наставку, да би добили 0.1 г комадића чоколаде (Фоодфирст ЛТД Ауцкланд, НЗ) и прилагодили се отварању и затварању врата за руке. На црвеној перспекс писти (слика 1), пацови су такође били обликовани тако да забадају у нос 2-цм кружну белу пластичну капу која је била 10 цм изнад нивоа пода и у средини танког сунђера на провидном перспекс уметку који је био причвршћен за крајњи зид.

Такође су били обликовани да гурају (користећи нос или шапу) предмет који је био спојен на шаркама на задњој страни његове основе до врха бунара за храну који је био увучен у центар дрвеног блока од 5 8,5 3 цм. Храна је садржавала комадиће чоколаде (и држала је неприступачну храну испод удубљења). Објекат који је коришћен за претходну обуку није поново коришћен. Након операције, пацови који су се опоравили су поново упознати са РАМ-ом и пистом.

2.4|Просторна радна меморија у РАМ-у

Након операције, просторна радна меморија је тестирана коришћењем РАМ меморије смештене у центру собе без прозора (3 3 м). Лавиринт је имао сиво обојену дрвену централну главчину ширине 35 цм са осам алуминијумских кракова (65 цм дужине и 8,6 цм широке, са ивицама висине 4,5 цм), подигнутих 67,5 цм изнад пода просторије. Прозирни зидови од перспекса (дужине 19 цм и висине 25 цм) протежу се дуж једне стране сваке руке од главчине да би спречили пацове да скачу између кракова.

Црни дрвени бунар за храну (5 8,5 3 цм), са недоступном храном испод, стављен је на крај сваке руке. Током тестирања, 2 0.1 г комада чоколаде било је присутно у свакој посуди за храну на почетку сваке суђење. Прозирна врата од перспексгиљотине, која су се могла подићи испод главчине помоћу система ременица, контролисала су приступ краковима главе.

Десет узастопних дана формалне обуке у РАМ-у коришћено је за тестирање просторне радне меморије. Пацов је стављен у централну главчину, а 10 секунди касније, свих осам руку је отворено, а пацу је дозвољено да направи избор дефинисан као обе задње ноге преко прага руку. Када је пацов ушао у руку, сва врата су била затворена, и био је затворен за руку 15 с, без обзира да ли је направио исправан избор.

Пацов је тада пуштен назад у централно чвориште и држан тамо 10 секунди пре него што су сва врата поново отворена да би се омогућио други избор руке. Суђење је завршено када је ратхад посетио свих осам кракова, направљено је 20 избора руку или је прошло 10 минута.

2.5|Непросторни задаци: Једноставна дискриминација и учење у пару

И једноставна дискриминација и задаци упарени-сарадници користили су исту црвену перспекс писту (93 26 26 цм) постављену на сто висок 75-цм (слика 1). Писта би могла бити подељена са три вертикално уклоњива врата (редПерспек, 26 26 цм) која су изабрана на основу специфичног задатка понашања. Што се тиче упознавања, сунђер танки 6,5 6 8 мм са поклопцем у средини држао је награду за чоколадну храну (слика 1).

Сунђер је био причвршћен за врата која се могу уклонити на писти (за задатке упарених сарадника) или на крајњи зид писте (за једноставан задатак дискриминације). За сваки мирис је коришћен другачији сунђер за врата, који је уливан поред посуде са 5 мл сунцокретовог уља помешаног са 20 ул есенцијалних уља новозеландске супстанце.

Мириси су били лимун и каранфилић за упарене задатке, а цимет и лимета за једноставне задатке дискриминације, или обрнуто у групама са противтежом. Лагани и визуелно различити објекти (Слика 1) били су причвршћени шарком на задњој страни своје базе за врх бунара за храну тако да је пацов могао лако да гурне предмет назад (било нос или шапу) да би тражио награду за храну.

Дрвени оквир (висок 1,8 м од пода ширине 1,3 м), застрт црним завесама, затворио је све стране испитног простора како би се смањили просторни знаци током тестирања.

Једноставна дискриминација (само мирис; само објекат) и задаци упарени-сарадници користили су процедуру 'иди/не-иди'.

Прво испитивање за сваку сесију почињало је задржавањем пацова у почетној зони на 120 с да би се поново аклиматизовао на тему; наредна испитивања су користила 20 с у овој почетној области. Аллратс је примио 12 масовних испитивања по дневној сесији, са шестго (награђених) и шест не-гос (ненаграђених) испитивања по апсеудо-рандомизованом редоследу. Не више од три го или три суђења забрањена су узастопно у току сесије.

Ниједан од четири различита пара стимуланса мирис-предмет није поновљен у узастопним испитивањима. Тачне ставке у једноставним задацима дискриминације и исправни парови стимуланса у задацима упарени-сарадници били су противтежа међу пацовима.

За једноставну дискриминацију мириса, одговор је дефинисан као забадање носа у капицу у центру теодоризованог сунђера; само њушење сунђера сматрало се одговором забраном. Храна је увек била присутна у капици у центру сунђера за задатке упарени мирис – предмет; аспект иди/не-иди овде се односи на то да ли је објекат гурнут да би се открило да ли је испод њега, на крају писте, била награда за храну.

За објекте, одговор је дефинисан као сваки гурање носом или шапом који је нагнуо објекат уназад. Латенција од тренутка када су задња врата подигнута и када је пацов ступио у интеракцију са мирисом (бод нос у капицу; за дискриминацију једноставног мириса) или са објектом (гурнут назад на шарку, за једноставну дискриминацију објеката и задатке упарене сараднике) била је мерено тихом штоперицом (Дицк Смитх, Нови Зеланд).

Посматрач је седео унутар завеса и поред писте да би отворио врата и забележио понашање. Испитивање је означено као 'тачно' ако је пацов одговорио за мање од 8 секунди у покушају или није реаговао пре 8 секунди у покушајима без употребе.

2.6|Једноставне дискриминације

Половина пацова је обучена у једноставном задатку дискриминације мириса, праћеном једноставном дискриминацијом објеката и обрнуто за другу половину. Забележено је кашњење између врата Кс (слика 1а) и интеракције са мирисним или објектом на крају писте. Пацови су обучавани на једноставном задатку дискриминације мириса и једноставног предмета све док нису достигли критеријум (80% тачних током 2 узастопна дана).

За једноставан задатак дискриминације мириса, један мирис је представљен у сваком испитивању. Ратхад да се разликује који од два мириса је упарен са наградом за храну представљеном у сунђеру на крају одељка Б (слика 1а).

У једноставном задатку дискриминације објеката, један објекат је представљен на сваком огледу на крају одељка Б (није приказан на слици 1). Тхерат је морао да научи који од два предмета је упарен са наградом за храну представљеном испод објекта.

2.7|Упарени задаци (траце андно-траце) Ови задаци су користили нови распоред вертикално уклоњивих врата (Слика 1). Пацови су научили који од два пара мирис-објекат ће бити награђен (нпр. Мирис 1 + Објекат А и Мирис 2 + Објекат Б) и који парови нису награђени (тј. Мирис 1 + Објекат Б и Мирис 2 + Објекат А).

Без обзира на упаривање, пацови су увек добијали награду за представљање мириса када су били дозвољени у други одељак писте. Ово је био одељак Ц за стање 'без трагова' у којем одељак А није коришћен, а одељак Б је био почетни одељак. Мирис је био на крају одељка Б за стање 'траг', за који је одељак А коришћен као почетна кутија.

Пацови у стању трагова били су подвргнути кашњењу од 10- између приказа мириса и стимулуса објекта, тако што су држани у одељку Ц, док су пацови у стању без трага били изложени објекту непосредно након њихове интеракције са мирисом (након једе награду). И у условима трагова и без трагова, забележили смо кашњење за прелазак преко одељка Д, од тренутка када су врата З подигнута док пацов није ступио у интеракцију са објектом или се уздржао од интеракције са њим 8 секунди.

Две групе пацова (Схам-лезија и АТН-лезија) су обучаване на задацима упарени-сарадници мирис-објекат (групе без трага), а две одговарајуће групе су обучаване на задацима упарени-сарадници мирис-траг-објекат (групе у траговима) све док нису достигнути критеријум (80% тачних испитивања током 3 дана) или максимално 50 дана.

2.8|Тест задржавања након аквизиције

Задржавање задатка упарени-сарадник за било ког пацова је спроведено 5 дана након постизања критеријума или након 50 дана тренинга. Ова сесија је користила 12 масовних награђених/ненаграђених покушаја у једном дану на идентичан начин као што је раније коришћен за тог пацова.

2.9|Хистологија

2.9.1|Перфузија и сакупљање ткива

3 дана пре ретенционог теста, појединачни пацови су упознати са празним чистим кавезом 90 минута у мрачној и тихој просторији. Одмах након последњег испитивања у ретенционом тесту, пацов је стављен у кавез у познатој мрачној тихој просторији 90 минута пре перфузије.

Пацови су дубоко анестезирани натријум пентобарбиталом (125 мг/кг) и транскардијално перфузирани физиолошким раствором праћеним параформалдехидом [4% ПФА у 0.1 М фосфатном пуферу (ПБ)] да би се фиксирао мозак. Мозак је накнадно фиксиран у 4% ПФА, након чега је уследило најмање 48 х у дуготрајном раствору (20% глицерола у 0.1 М ПБ). Коронални пресеци 40- μм су сакупљени коришћењем микротома за замрзавање (Тхермо Фисхер, УК) и чувани у раствору крио-протектора (30% глицерол, 30% етилен гликол у 0,1 М ПБ) на 20 Ц до обраде за имунохистохемију.

Коронални пресеци су сакупљени у две одвојене серије. Прва серија је обухватила узастопне делове у пет криопијала за имунохистохемију (тј. један од пет). Ова серија је укључивала предњи блок секција од префронталног кортекса до септалне области (приближно {{0}}}.7 до 0,6 мм од Брегме) и задњи блок од медиодорзалног таламуса (приближно 3,5 мм од Брегме) до каудалног ретроспленијални кортекс.

Друга серија је обухватила узастопне делове за верификацију лезија. Ови делови су сакупљени у четири криопијале од непосредно предњег од АТН до задњег медиодорзалног таламуса (приближно 0.6 до 3,5 мм од Брегме).

2.9.2|Неу-Н бојење и верификација АТН лезија

Слободно плутајући делови широм АТН региона су испрани (3 10 мин) у 0.1 М физиолошком раствору пуферованом фосфатом са Тритон-Кс (0,2%; ПБСТк) пре инкубације у пуферу за блокирање ендогене пероксидазе током 30 мин [1% водоник пероксид (Х2О2), 50% метанол (ЦХ3ОХ) у 2% ПБСТк].

Секције су инкубиране преко ноћи на 4 Ц инанти-НеуН примарном антителу (1:5000; моноклонални-МоусеЦат# МАБ377; Миллипоре, Калифорнија САД) у ПБСТк са 1% нормалног козјег серума (НГС; Лифе Тецхнологиес, ​​НЗ).

Вишак пуфера за антитела је уклоњен са ПБСТк, а затим је уследила инкубација у биотинилованом козјем анти-мишјем секундарном антителу (1:1000 Цат# БП-9200-50: ВецторЛабораториес, Цалифорниа УСА) преко ноћи на 4°Ц у ПБСТк и 1% НГС. Секције су стављене у ЕктрАвидин (коњугован са пероксидазом; 1:1000; Сигма, НСВ Аустралија), ПБСТк и 1% НГС током 2 х на собној температури.

Да би се уклонио вишак ЕктрАвидина и Тритон Кс{{0}}, секције су испране у ПБС, ПБ, а затим Трис пуферу (пХ 7,4 у дестилованој Х20) да би се делови припремили за визуелизацију свеже припремљеног диаминобензидина ( ДАБ 0,05%; Сигма, у 0,01% Х2О2 у Трис пуферу).

ДАБ реакција (приближно 5 мин) је заустављена коришћењем Трис пуфера (1 10 мин испирања), а делови су стављени у ПБ на 4 Ц преко ноћи пре него што су монтирани на желатинизована стакла и остављени да се осуше. Стакалца су дехидрирана кроз алкохол (70%-100%) пре него што су очишћена инксиленом и монтирана са ДПКС (06522; Сигма-Алдрицх) и покровним стакалцем.

Број Неу-Н-позитивних ћелија у АТН коришћен је за одређивање обима лезије. Ово је користило пресеке са леве и десне хемисфере за сваки од четири 40- μм пресека широм АТН и области квантификоване помоћу ИмагеЈ (НИХ, САД). НеуН-позитивно бојење ћелија је фотографисано на 5 објектива на ЛеицаДМ6 Б усправном микроскопу и ДФЦ7000Т камери (Леица Мицросистемс, Немачка).

Аутоматско пребројавање ћелија је добијено преко ИмагеЈ (софтвер за анализу слика, Национални институт за здравље, НИХ, САД). Област која окружује неуроне у АТН региону је ручно изабрана и слике су конвертоване у {{0}}битну сиву скалу, позадина је одузета (котрљајући=40), конвертована у маску и примењена је функција вододелнице, и све неуронске ћелије изнад прага (праг 'МакЕнтропи', кружност 0.5–1.0) су избројане.

Праг детекције је био исти за све секције. Аутоматизована НеуН обојена језгра ћелија су пребројана код девет лажних пацова (пет у групи лажних трагова и четири у групи лажних трагова) да би се изразио број ћелија у АТН.

Аутоматски број НеуН обојених језгара поштеђених ћелија код свих пацова са АТН лезијом је упоређен у односу на просечни број НеуН ћелија посматраних код лажних пацова. Прихватљиве лезије су дефинисане као достизање критеријума од 50% губитка ћелија у АТН, са минимално 25% по хемисфери. Ово је у складу са критеријумима АТН-лезије у претходним студијама (Митцхелл & Далримпле-Алфорд, 2005, 2006; Перриет ал., 2018).

2.9.3|Зиф268 имунохистохемија

Слободно плутајући делови су обрађени на сличан начин као и за НеуН, али су инкубирани у зечјем поликлонском Зиф268 примарном антителу (Егр-1; 1:1000 Цат# сц-110; Санта ЦрузБиотецхнологи, УСА) током 72 х на 4 Ц у ПБСТк са 1% НГС, након чега следи инкубација у биотинилованом козјем антизечјем секундарном антителу (1:1000: Вецтор ЛабораториесБА-1000) преко ноћи у ПБСТк и 1% НГС.

Након ДАБ визуелизације (18 мин), Зиф268-позитивно бојење ћелија у свакој области од интереса је фотографисано са 10 објективом са светлосним микроскопом (Леица, Немачка). Аутоматски број ћелија је добијен преко ИмагеЈ ( НИХ, САД) на исти начин као и НеуНпозитивне ћелије, осим што је кружност постављена на 0.65–1.0.

Бројање Зиф{0}}позитивних ћелија за све регионе користило је исти алгоритам прага, са квантификованим између два и шест делова по региону од интереса за сваког пацова. Коришћен је просечан број Зиф268-позитивних ћелија по мм2 на пресецима (са обе хемисфере) у региону од интереса.

2.10|Анализа података

АНОВА коришћењем Статистица (в13; Делл Инц.) је спроведена да би се тестирале средње разлике између четири групе пацова (Схам-Но Траце, Схам-Траце, АТН-Но Траце и АТНТраце). Фактори поновљених мерења су додавани данима (РАМ и једноставна дискриминација), блокови покушаја (задаци упарени-сарадници) и Зиф268 броји у сродним регионима или подрегионима од интереса.

АНОВА за РАМ и једноставне задатке дискриминације упоредила је четири групе да би потврдила да су две групе Схам-лезије и две АТН-лезије биле конзистентне једна са другом, али имајте на уму да није било компоненте трага у РАМ-у или једноставним задацима дискриминације. И за једноставну дискриминацију и за упарене задатке на писти, коришћена је реципрочна трансформација података о кашњењу у појединачним испитивањима да би се обезбедила хомогеност варијансе.

На било који дан тестирања, трансформисане латенције су генерисале средње кашњење за свако од шест ненаграђених покушаја и шест награђених покушаја. За једноставне задатке дискриминације, анализирали смо средњу оцену разлике у кашњењу (просек награђених суђења минус просек ненаграђених суђења), али не и награђене и ненаграђене покушаје одвојено због грешке у складиштењу података.

Све три мере кашњења биле су доступне за меморијске задатке упарених сарадника (ненаграђена испитивања, награђена испитивања и разлика у кашњењу). Да бисмо узели у обзир вишеструка поређења и да бисмо уравнотежили грешке типа И и типа ИИ, користили смо ниво значајности п < 0.02 за анализе понашања пошто су постојале три повезане мере у задатку упарени сарадник (ненаграђена испитивања, награђена испитивања и средња разлика у кашњењу).

Било је шест примарних анализа за регионе од интереса за експресију Зиф268, тако да је значај у овим анализама постављен на п < 0.01. Постхоц Невман-Кеулс (НК) тестови су проценили групне разлике у пару. Једноставна анализа главних ефеката је коришћена када су постојале значајне интеракције које укључују факторе поновљених мера.

3|РЕЗУЛТАТИ

3.1|Верификација лезије

Сви осим једног од 18 пацова са АТН лезијама испунили су априорни критеријум од 50% билатералног оштећења АТН и минимум од 25% по хемисфери. Средње обострано оштећење било је 76% у обе групе АТН-лезија (опсег: АТН-Но Траце, 61%–93%; АТН-Траце, 63%–93%; Слика 2). Искључени пацов је имао задовољавајућу лезију само на једној хемисфери (48% укупно, 75% лево и 20% десно).

Слика 2д показује да је број НеуН за АТН неуроне код пацова са АТН лезијом (М=3388, СД=2024) био знатно испод вредности пронађених код пацова са лажним лезијама (М=15, 339, СД=1065; овај број је био сличан оном који су пријавили Фрост ет ал., 2020). Осам од 17 пацова са лезијама (четири у Траце групи и четири у Но-Траце групи) није имало оштећења ни медиодорзалног таламуса (МД) нити поновних/ромбоидних (Ре/Рх) језгара, а било је релативно мало оштећења на ове структуре код преосталих девет пацова са лезијама.

Када је дошло до МД оштећења, то је било у предњим аспектима који леже поред АТН. Дакле, оштећење МД је процењено од приближно {{0}}.72 до +2.10 мм од Брегме, где се кретало од 0% до 41% губитка ћелија у целини група (медијана=21%). Када је дошло до Ре/Рх оштећења, оно је такође било у близини АТН региона, тако да је процењено на приближно 1,08 до 2,04 мм од Брегме, где се кретало од 0% до 33% (медијана=6%). Имајте на уму да ове процентуалне вредности повреде не представљају цео МД и Ре/Рхрегионе, јер су задњи региони оба језгра били нетакнути код свих пацова са АТН лезијом.

For more information:1950477648nn@gmail.com