Анти-инфламаторни принципи из иглица Пинус Таиваненсис Хаиата и Ин Силицо студије о њиховим потенцијалним ефектима против старења

Апстрактан:ПинусЧај од игле је веома популаран у источним земљама као што су Јапан, Русија, Кореја и Кина. За чај од борових иглица се тврди да је значајанефекти против старења,али никакви јасни докази то нису подржали до сада. У овој студији, петнаест неописаних једињења (1–5), као и седамдесет и два позната једињења, пречишћени су и окарактерисани из биоактивне фракције метанолних екстракатаП. таиваненсисигле.

Најбољи Цистанцхе производи од биљака против старења

Већина изолата је испитана на њиховуантиинфламаторна биоактивностпрема моделу ћелијских неутрофила и шест једињења (45, 47, 48, 49, 50, и51) изложена азначајна инхибиција стварања супероксид ањонаи ослобађање еластазе са ИЦ50 вредностима у распону од 3,3± 0.9 до 8.3± 0.8 µМ. Овеантиинфламаторни састојцибили су подвргнути рачунарству за спајање како би се проценио њихов афинитет везивања на рецептор грелина, који је играо важну улогу у регулисању метаболизма, саефекти против старења. Једињења49, 50, и51 формирао стабилан комплекс са рецептором грелина путем водоничних веза и различитих врста интеракција.

1. Представљање

Пинусрод (Пинацеае), који се састоји од више од 100 врста и углавном је распрострањен на северној хемисфери, углавном су зимзелено дрвеће, док су нека грмља [1]. Борово дрво је лагано и често се користи за намештај. Међутим, у древним књигама традиционалне кинеске медицине забележени су различити фармаколошки ефекти иглица на изданке бора. У „Канону биљне фондације божанског мужа“ борове иглице су подстакле раст косе, продужиле живот и утажиле жеђ. У "Таипинг Схенгхуи Фанг" забележено је да се борове иглице могу кувати са алкохолом и да показују ефекат против старења. Данас се борове иглице прерађују као чај и популарне су у Азији. У Кореји, састојци одП. денсифлорачај од игле као и њенантиоксидативне и антибактеријске биоактивности су опширно истраживане [2,3]. Од раног прошлог века, идентификовано је више од седам стотина једињењаПинус игле. Већина објављене литературе односи се на етерично уље одП. денсифлфлора[4,5], П. халепенсис[6,7], П. нигра[4,8], иП. силвестрис[4,9]. Окарактерисане компоненте одПинусиглице су углавном бензеноиди, дитерпеноиди, флавоноиди, лигнани, монотерпеноиди и сесквитерпеноиди [10]. Игле одП. денсифлораиП. моррисоницоласу пријављени због њихове антиоксидативне биоактивности [11–14]. Поред тога, етилацетатни екстракт иглица одП. моррисоницолаинхибирао експресију протеина и мРНК НО иiНОС у РАВ 264.7 макрофагу изазваном ЛПС-ом, који показује значајну антиинфламаторну биоактивност [13]. Суперкритични течни екстракт одП. денсифлораигле су показале инхибиторни ефекат на ЛПС-индуковану производњу НО тако што су смањиле експресијуiНОС и смањење експресије ИЛ-6 и ИЛ-1 и активација СТАТ1 и СТАТ3 протеина у макрофагима изазвана ЛПС [15]. Етанолни екстракт одП. тхунбергииигле су показале значајан антиинфламаторни ефекат на макрофаге и потиснуле едем уха изазван арахидонском киселином и инхибирали ензимску активност мијелопероксидазе [16]. Штавише, ферментисаниП. моррисоницолаигле су показале своје одличне антиоксидативне и антиинфламаторне биоактивности модулацијом НФ-κБ сигнални пут [17]. 

Грелин је пептидни хормон који се састоји од двадесет осам аминокиселина и првобитно је откривен у желуцу [18,19]. То је ендогени лиганд за секретагог хормона раста (ГХСР), који је члан -грана у класи А ГПЦРс (Г протеински спојени рецептори) [18,19]. Грелин је једини пептидни хормон који изазива глад и подстиче апетит [20]. Многе студије сугеришу да грелин игра важну улогу у регулисању метаболизма, енергетског баланса, памћења, кардиоваскуларних и гастроинтестиналних функција у људском телу.21–23]. Грелин је такође укључен у различите физиолошке и патофизиолошке механизме у људском телу као што је старење [24,25], а може бити повезано са антиинфламаторном активношћу [26,27]. Године 2014., наша група је први пут идентификовала јединствене ацилиране флфлавоноидне тетра гликозиде назване теагрелини у Цхин-схин оолонг чају и показала њихову промотивну активност у ослобађању хормона раста (ГХ) [28]. Два друга слична једињења су пречишћена у Схи-јих-цхуен оолонг чају и њихова биоактивност на рецептору грелина је такође верификована [29]. Четири теагрелина су изазвала глад кроз исти регулаторни пут као и грелин. Без ограничења на чај, једињења са сличном структуром или биоактивношћу као теагрелини су такође истражена уПолигонум мултифлорум(Хес хоуву) [30], Гинко билоба[31], Морус алба[32], иЦистанцхе тубулоса [33]. Ови резултати нас подржавају у потрази за природним принципима против старења тако што ћемо испитати једињења слична грелину у чају која поседују антиинфламаторне ефекте. Поред директног вршења промотивне активности у ослобађању хормона раста у ћелијским моделима, молекуларно моделирање неких потенцијалних једињења било би ефикасније у истраживању могућих кандидата [34]. Рачунске методе су примењене на развој и евалуацију фармаколошких хипотеза. Молекуларно спајање је једна од најчешће коришћених техника и предвиђа конформацију и афинитет везивања лиганда за активни џеп са великом прецизношћу [35,36]. Методе спајања ефикасно претражују просторе високе димензије ради могуће интеракције и користе функцију бодовања која правилно рангира кандидате [37]. 

У 2018, три једињења су пречишћена од иглицаП. моррисоницолаи показивао је значајну вазорелаксантну активност, а међу овим састојцима, један је био са структуром налик на грелин у чају [38]. на Тајвану,П. таиваненсисиглице се обично суше и пеку, а затим прерађују као чај због њихове чувене биоактивности.П. таиваненсисХаиата је једна од аутохтоних и ендемских врста на Тајвану. Такође се назива тајвански црвени бор или хуангшан бор. У везику су две иглице дуге 8–11 цм и благо круте и праве, а расте по целом острву од малих до великих надморских висина и често чине чисту шуму [39]. У прелиминарном испитивању, етилацетатни слој метанолних екстраката одП. таиваненсисигле су показале значајну инхибицију стварања супероксид ањона и ослобађања еластазе са ИЦ50 вредности 0.8± {{0}}.2 и 1.0± 0.1 µг/мЛ, респективно (Табела С1). Стога, у овој студији, биоактивни састојци одП. таиваненсисигле су испитане и пречишћена једињења су процењена на њихову антиинфламаторну биоактивност на моделу ћелијских неутрофила. Поред тога, изолати изП. таиваненсисигле са антиинфламаторним биоактивностима подвргнуте су доцкинг цомпутинг иистражена њихова интеракција са рецептором грелина.

2. Материјал и методе

2.1. Опште експерименталне процедуре

ултраљубичасти (УВ) спектри су добијени Хитацхи У-2001 УВ/В је спектрометром. Тхеинфрацрвени (ИР) спектри су испитивани са Јасцо ФТ/ИР{0}} спектрофотометром.1H-, 13C-, и 2Д спектри нуклеарне магнетне резонанце (НМР) су снимљени на Брукер АВ-400НМР спектрометар. Хемијски помаци су приказани уδ вредности (ппм) са тетраметилсиланомкао интерни стандард. ТхеδH иδC вредности су биле за хемијске помаке сигнала,редом. Масена спектрометрија са електроспреј јонизацијом високе резолуције (ХР-ЕСИ-МС) је биласпроведено са ЈЕОЛ ЈМС{0}} спектрометром (који ради у режиму негативних јона).

2.2. Садни материјал

Игле одП. таиваненсисприкупљени су у Пулију, Нантоу, Тајван и идентификованиПроф. Схенг-Ианг Ванг (Одсек за шумарство, Национални универзитет Цхунг-Хсинг,Таичунг, Тајван). Узорак ваучера (ПЦКуо_2016003) је депонован у хербарФакултет фармације, Национални Универзитет Ченг Кунг, Тајнан, Тајван.

2.3. Екстракција и изолација

2.4. Спектрални и физички подаци од 1–5

2.4.2. 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -дихидрокси-70 -(4-хидрокси-3-метоксифенил)пропан-80 -илокси]-2-хидроксибензоева киселина (2)Безбојни сируп; [ ]25 D плус 5,3 (c 0.1, МеОХ); УВ (МеОХ)λмак(Пријаваε) 284 (3.59), 253 (3,80) нм; ЕЦД (c 3.51 × 10−4 М, МеОХ)λмак(∆ε) 248 ( плус 1,33), 224 ( плус 1,03),214( плус 1,10) нм; ИР (уредно)νмак3425, 2927, 1541, 1384, 1271 цм−1;1Х и13Ц НМР; ХРЕСИМСm/z 349.0936 ([M − H]− израчунато за Ц17H17O8, 349.0923).

2.4.3. (13E,12R)-12-Хидроксиагатна киселина (3)

Безбојни прах; мп: 263◦Ц (дец.); [ ]25 D плус 30,8 (c 0.1, МеОХ); УВ (МеОХ)λмак(Пријаваε) 225 (сх) (3,83) нм; ИР (уредно)νмак3450, 2937, 1648, 1252 цм−1;1Х-НМР (ЦД3ОД,400 МХз) δ 0.63 (3Х, с, ЦХ3-20), 1,09 (1Х, ддд,J = 13.6, 13.6, 3.6 Хз, Х-3а), 1.21 (3Х, с, ЦХ3-18), 1.21 (1H, m, H-1a), 1.42 (1H, m, H-5), 1.51 (1H, m, H-2a), 1.59 (2H, m, H-11),1.79 (1H, m, H-1b), 1.91 (1H, m, H-2b), 1.91 (1H, m, H-6a), 1.98 (1H, m, H-7a), 2.01 (1H, m,Х-6б), 2,08 (3Х, с, ЦХ3-16), 2.12 (1H, m, H-9), 2.14 (1H, m, H-3b), 2.43 (1H, m, H-7b), 4.03 (1Х, дд,J = 9.2, 2.8 Хз, Х-12), 4.53 (1Х, с, Х-17а), 4.91 (1Х, с, Х-17б), 5.88 (1Х, бр с, Х-14);13Ц-НМР (ЦД3ОД, 100 МХз)δ 13,5 (ЦХ3-20), 14,9 (ЦХ3-16), 21.2 (C-2), 27.6 (C-6), 29.6 (ЦХ3-18), 31.5 (C-11), 39.4 (C-3), 40.0 (C-7), 40.3 (C-1), 41.2 (C-10), 45.3 (C-4), 53.1 (C-9), 57.6 (C-5), 75.5 (C-12), 106.9 (C-17), 117.8 (C-14), 150.2 (C-8), 159.5 (C-13), 167.2 (C-15), 181.5 (Ц-19); ХРЕСИМСm/z 349.2024 ([M − H]− израчунато за Ц20H29O5, 349.2015).

2.4.4. 5-Изопропил-3-оксоциклохекс-1-ен-1-карбоксилна киселина (4)

Безбојни табеларни кристал; мп: 235◦Ц (дец.); [ ]25 D плус 28,6 (c 0.3, МеОХ); УВ (МеОХ)λмак(Пријаваε) 237 (сх) (3,40) нм; ИР (уредно)νмак3456, 2925, 1635, 1395 цм-1;1Х-НМР (ЦД3ОД,400 МХз) 0,88 (3Х, д,J = 6.8 Хз, ЦХ3-9), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Хз, ЦХ3-10), 1.84 (1H, m, Х-4а), 2,02 (1Х, м, Х-4б), 2,09 (1Х, м, Х-5), 2,31 (1Х, хепт,J = 6.8 Хз, Х-8), 2.50 (1Х, дддд,J = 19.2, 9.2, 4.8, 2.4 Хз, Х-6а), 2.70 (1Х, дддд,J = 19.2, 5.2, 5.2, 1.2 Хз, Х-6б), 6.32 (1Х, дд,J = 2.4, 1,2 Хз, Х-2);13Ц-НМР (ЦД3ОД, 100 МХз)δ 19.0 (C-9), 20.9 (C-10), 24.3 (C-4), 27.0 (Ц-6), 27,1 (Ц-8), 53,7 (Ц-5), 128,7 (Ц-2), 160,6 (Ц-1), 174,8 (Ц-7), 205.7 (Ц-3); ХРЕСИМСm/z 181.0855 ([M − H]− израчунато за Ц10H13O3, 181.0865).

2.4.5. стираксинолна киселина (5)

Безбојни сируп; УВ (МеОХ)λмак(Пријаваε) 308 (2,89), 237 (сх) (3,37), 222 (сх) (3,70) нм;ИР (уредно)νмак3421, 2926, 1572, 1395, 1268 цм-1;1Х-НМР (ЦД3ОД, 400 МХз) 1,82 (2Х, тт,J {{0}}.0, 6.8 Хз, Х-8), 2.61 (2Х, т,J {{0}}.0 Хз, Х-7), 3,56 (2Х, т,J = 6.8 Хз, Х-9), 3.83 (3Х, с, ОЦХ3-3), 6.86 (1H, d, J = 2.4 Хз, Х-4), 7,31 (1Х, д,J = 2.4 Хз, Х-6);13Ц-НМР (ЦД3ОД,100 МХз)δ 32,7 (Ц-7), 35,6 (Ц-8), 56,6 (ОЦХ3-3), 62.3 (C-9), 116.3 (C-4), 120.1 (C-1), 122.8 (Ц-6), 131,9 (Ц-5), 149,2 (Ц-3), 150,7 (Ц-2), 176,2 (Ц-10); ХРЕСИМСm/z 225.0767 ([M − H]−израчунато за Ц11H13O5, 225.0763).

2.5. Испитивање антиинфламаторне биоактивности

2.5.1. Препарат хуманих неутрофила

Студија је спроведена уз одобрење Институционалног одбора за ревизију Меморијалне болнице Цханг Гунг (ИРБ бр. 201800369А3). Узорци крви су узети од здравих људских давалаца (20 до 30 година), а неутрофили су изоловани и пречишћени према протоколима описаним раније [40]. 

2.5.2. Генерација супероксидних ањона

Мерење Тест за мерење стварања супероксид ањона био је заснован на редукцији ферицитохрома који се инхибира СОДc као што је претходно описано [40].

2.5.3. Тест ослобађања еластазе

Дегранулација азурофилних гранула је одређена мерењем ослобађања еластазе као што је претходно описано [40]. 

2.5.4. Статистичка анализа Резултати су изражени као средња вредност± стандардна грешка средње вредности (СЕМ). Израчунавање 50 процената инхибиторних концентрација (ИЦ50) је обављен коришћењем софтвера ПХАРМ/ПЦС в.4.2. Статистичка поређења су направљена између група коришћењем Студентовогt-тест. Вредности одp < 0.05 were considered to be statistically significant. 

2.6. Молецулар Доцкинг Студи

Тхеин силицоевалуација је спроведена на софтверу АутоДоцк Вина [41]. Кристална структура рецептора грелина је окарактерисана [42], и а. ПДБ датотека је преузета из Протеин Датабанк (ПДБ ИД: 6КО5). 3Д структуре лиганада су конструисане у програму Цхем3Д. Спроведен је додатак водоника, Гастеигерово мерење наелектрисања за атоме протеина и избор флексибилних торзија за лиганде од АутодоцкТоолс (АДТ вер. 1.5.6). Величина мреже је пројектована на 18,5 А× 18.5 Å × 18,5 А и центар мреже на димензијама (к, и, и з, респективно): 9,7, –19,2, 14,6. Енергија афинитета везивања је дата као резултати пристајања и приказана у кцал/мол. Најбољом интеракцијом сматрала се само најбоља поза. Визуелизација најбољих интеракција при повезивању анализирана је у клијенту Биовиа Дисцовери Студио 2020 [43].