Антиоксиданси и ензими који хидролизују скроб, инхибициона својства жуто-наранџастих хибрида кукуруза отпорних на стригу

За више информација контактирајте:tina.xiang@wecistanche.com

Апстрактан: Већина здравствених користи које потичу од житарица приписују се њиховим биоактивним једињењима. Ова студија је проценила нивое биоактивних једињења иантиоксиданси хидролизујући скробензимиинхибиторна својства шест жуто-наранџастих хибрида кукуруза отпорних на цевовод Стрига (шифровани АС1828-1, 4, 6,8, 9, 11) ин витро. Хибриди кукуруза су гајени на Међународном институту за тропску пољопривреду (ИТА), Нигерија. Биоактивна једињења (укупни феноли, танини,флавоноидинивое , и фитата, антиоксиданса (ДППХ" и АБТС капацитет чишћења и редукционе моћи) и хидролизу скробаензими(-амилазе и к-глукозидазе)инхибиторне активности хибрида кукуруза одређене су спектрофотометријом. У исто време, каротеноиди су квантификовани коришћењем ХПЛЦ система реверзне фазе. Опсези биоактивних једињења су били: 11.25-14.14 мг ГАЕ/г (укупни феноли),3.62-4.67 мг КЕ/г (укупни флавоноиди), 3.{{1{ {34}}}}.29 мг/г (танини),3.66-4.31% (фитат),8.92-12.11уг/г (укупни ксантофили),2.{{19 }}.89 уг/г (укупни -каротен) и 3.17-3.77уг/г (укупни каротеноиди провитамина А). Екстракти хибрида кукуруза уклањају ДППХ"(СЦ50: 9. 07-26.35 мг/мЛ) и АБТС*(2.{{30}}.68 ТЕАЦммол/г), редуковано Фе3 плус на Фе2 плус (0.25±0.64-0 .43±0.01 мг ГАЕ/г), и инхибиране -амилазе и -глукозидазе, са опсегом ИЦ50 од 26.28-52.55 мг/мЛ и 47.72-63.98 мг/мЛ, респективно. Међу шест клонова хибрида кукуруза, АС1828-9 је имао највише (п<0.05)levels of="" tannins="" and="" phytate="" and="" the="" strongest="">антиоксиданси инхибиторне активности ензима који хидролизују скроб. Уочене су значајне корелације између укупних фенола и следећег: АБТС*(п<0.01, r="0.757)," dpph"sc50=""><0.01,r=-0.867), reducing=""><0.05,r=0.633), α-amylase=""><0.01,r=-0.836) and="" α-glucosidase=""><0.05, r="-0.582).Hence," the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids(especially="" as1828-9)="" may="" be="" beneficial="" for="" alleviating="" oxidative="" stress="" and="" postprandial="">

Кључне речи: укупни феноли; укупни флавоноиди; танини; каротеноиди; фитатна киселина; тест инхибиције алфа-глукозидазе; тест инхибиције алфа-амилазе

1. Представљање

Обезбеђивање високо приносних, хранљивих и здравих усева за исхрану је од суштинског значаја за решавање изазова које представља потхрањеност и болести повезане са њом. Стога су различити систематски приступи, као што је узгој основних намирница отпорних на болести са побољшаним нутритивним квалитетом, коришћени у истраживачким програмима оплемењивања биљака како би се задовољиле потребе у исхрани све веће глобалне популације. Ово је постало императивније с обзиром на драстично смањење количине и квалитета глобалне понуде хране изазвано загађењем животне средине, глобалним загревањем и развојем

нови извори биогорива [1]. У подсахарској Африци се показало да кукуруз (Зеа маис Л.) доприноси сигурности хране и смањењу сиромаштва међу породицама са ниским примањима [2].

Генотипови жуто-наранџастог кукуруза су добро познати по својим одличним нутритивним и здравственим квалитетима због биоактивних једињења која садрже, укључујући каротеноиде, полифенолна једињења, фитинску киселину [3-5] и токофероле [6]. Међутим, изгледи за сигурност хране и побољшану исхрану кроз повећану производњу кукуруза у подсахарској Африци су угрожени хемипаразитном биљком, Стрига хермонтхица(Дел.)Бентх изазива губитак приноса до 100 процената под озбиљном заразом због губитка воде и хранљиве материје кроз паразитизам [7,8]. Сходно томе, С. хермонтхица представља абиотичко ограничење за производњу кукуруза у подсахарској Африци, које произилази из промене парадигме у односу на традиционални систем узгоја житарица који је укључивао продужене периоде заливања. Такав традиционални систем узгоја житарица обезбедио је да ниво банке семена Стрига у земљишту буде подношљив за биљке9]. Да би се ублажили губици у приносу и квалитету кукуруза изазвани заразом С.хермонтхица, најбоља метода сузбијања је садња генотипова кукуруза отпорних на Стрига. Ова стратегија је лако прилагодљива, посебно у комбинацији са другим праксама управљања [10].

Наша недавна студија је открила да жуто-наранџасти хибриди кукуруза отпорни на Стрига садрже каротеноиде, полифеноле и фитинску киселину [3]. Познато је да ова биоактивна једињења делују као антиоксиданси и потискују постпрандијалну хипергликемију, између осталих здравствених предности [4,5,11,12]. Међу биоактивним једињењима у зрну наранџастог кукуруза, пријављено је да антиоксиданс [13,14] и инхибиторне активности дигестивних ензима [15] зависе од фенолних једињења, која постоје углавном у везаном облику. Поред тога, познато је да фенолна једињења поседују неколико других биоактивности, као што је инхибиција ензима који конвертују ксантин оксидазу и ангиотензин 1-, који су укључени у патогенезу гихта и хипертензије зависне од ренина, респективно [11], и анти- инфламаторна, антимикробна, антиканцерогена, анти-Алцхајмерова и антиалергијска својства између осталих биолошких активности[16]. Стога, фенолна једињења из прехрамбених извора привлаче велику пажњу како научника тако и потрошача због својих користи за људско здравље [16].

Циљ овог истраживања био је да се процене нивои биоактивних једињења, као и инхибиторна својства антиоксиданса и ензима који хидролизују скроб у шест цевоводних Стрига отпорних жуто-наранџастих хибрида кукуруза ин витро. Студија је такође тестирала повезаност између биоактивних састојака иантиоксиданси инхибиторне активности ензима за хидролизу скроба код шест хибрида кукуруза жуто-наранџасте боје отпорних на цевовод Стрига.

2. Резултати и дискусија

2.1.Биоактивне компоненте у шест цевоводних хибрида кукуруза жуто-наранџасте боје отпорних на стрига

Биоактивне компоненте одређене у шест цевовода Стрига-резистентни жуто-наранџасти хибриди кукуруза (АС1828-1(АС1), АС1828-4(АС4), АС1828-6(АС6), АС{{ 8}} (АС8), АС1828-9(АС9), АС1828-11(АС11))у овој студији су укључени укупни феноли,флавоноиди, танини, каротеноиди и фитинска киселина. Нивои укупних фенола, укупних флавоноида, танина и фитинске киселине приказани су у табели 1. Укупни феноли су се кретали од 11,25 до 14,14 мг ГАЕ/г у АС4 и АС9, респективно; укупни флавоноиди су се кретали од 3,62 до 4,67 мг КЕ/г у АС11 и АС6, респективно; садржај танина се кретао од 3,64 до 6,29 мг/г у АС1 и АС9, респективно; а садржај фитинске киселине кретао се од 3,66 процената у АС6 до 4,47 процената у АС1.

Дакле, АС9 је садржао највише (стр<0.05)total phenolics="" and="" tannin="" levels,="" while="" as6="" had="" the="" highest="" total="" flavonoids="" content.="" the="" total="" phenolic="" concentrations="" detected="" in="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" are="" higher="" than="" the="" values="" previously="" reported="" in="" yellow="" maize="" hybrids,="" including="" 2.15="" mg="" gae/g[15]and="" 2.08="" mg="" gae/g[17].="" similarly,="" the="" levels="" of="" total="" flavonoids="" detected="" in="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" in="" this="" study="" are="" higher="" than="" the="" 0.93±="" 0.03="" mg="" oqe/g="" recently="" reported="" in="" provitamin="" a="" yellow="" maize="" flour="" [17].="" although="" the="" tannin="" levels="" are="" within="" the="" range(2.1-7.3="" mg/g)previously="" reported="" in="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" [3],="" the="" values="">

релативно већи од опсега кондензованих танина (33,70 до 158,55 мг/100г, што је еквивалентно 0,34 до 1,59 мг/г) пријављених у пигментисаним генотиповима кукуруза [13].

Виши нивои укупних фенола, укупних флавоноида и танина уочени у шест цевовода жуто-наранџастих хибрида кукуруза отпорних на Стрига, у односу на вредности у постојећој литератури за ове полифеноле у ​​генотиповима жутог кукуруза који нису отпорни на Стрига могу бити повезани са могућим разлике у њиховом генетском саставу [3]. Добро је познато да се биосинтеза полифенола и других биљних секундарних метаболита повећава у присуству стресора као ћелијског одбрамбеног и/или адаптивног механизма биљке да издржи неповољне услове [16,18]. Штавише, клијавост семена Стрига се стимулише производњом стриголактона (биљних хормона) у корену биљке кукуруза, које биљка ослобађа под стресом [19]. Дакле, могуће је да је особина отпорности на С. хермонтхица можда појачала биосинтезу полифенолних једињења у кукурузу да би издржала паразите. Ово је поткрепљено ранијим извештајем да је отпорност на С. хермонтхица после везивања укључивала задебљање зида биљне ћелије и акумулацију многих малих вакуола и фенолних наслага које су густо обојене унутар биљне ћелије [20].

Фенолна једињења су значајна по својој антиоксидативној активности због својих редокс својстава, која им омогућавају да делују као гаситељи синглетног кисеоника, донори водоника и редукциони агенси [21]. Поред тога, пријављено је и да фенолна једињења инактивирају дигестивне ензиме, укључујући липазу панкреаса, -амилазу и а-глукозидазу неспецифичним везивањем за појединачне ензиме [22]. Као што су раније известили Виллигер и сарадници [23], фенолна једињења поседују висок афинитет за протеине путем водоничног и хидрофобног везивања, повећавајући њихову способност да инхибирају ензиме као што су -амилаза и -глукозидаза денатурацијом протеина.

The phytic acid contents were comparable (p>0.05)међу шест цевовода жуто-наранџасти хибриди кукуруза отпорни на Стрига. Овај распон се слаже са нашим претходним извештајем о садржају фитинске киселине код жуто-наранџастих хибрида кукуруза отпорних на Стрига [3]. Фитинска киселина поседује антиоксидативно дејство, поред инхибиторног дејства на настанак камена у бубрегу [24], као и антиканцерогена својства [25]. Антиоксидативна својства биоактивних компоненти, посебно фенолних састојака (флавоноида и танина) у жуто-наранџастим хибридима кукуруза отпорних на Стрига, такође могу спречити и/или успорити оксидативну деградацију неких ендогених хранљивих материја у кукурузу који су веома склони оксидације, као што су незасићене масне киселине и витамини [16]. Штавише, биоактивне компоненте у жуто-наранџастим хибридима кукуруза отпорних на Стрига могу смањити брзину формирања неких токсичних оксидативних производа, чиме се одржава нутритивни квалитет и продужава век трајања прехрамбених производа [26] направљених од њих.

The carotenoid content in the Striga-resistant yellow-orange maize hybrids is presented in Table 2. Total β-carotene (9-cis-β-carotene + 13-cis-β-carotene + all-trans-β-carotene) ranged from 2.42 to 2.89ug/g; total xanthophylls (lutein+zeaxanthin) ranged from8.92 to 12.11l ug/g; and total provitamin A carotenoids(β-cryptoxanthin+β-carotene+α-carotene） ranged from 3.17 to 3.77 μg/g,in AS6 and AS9,respectively. There were no significant differences(p>0.05) у садржају каротеноида жуто-наранџасте боје отпорне на Стрига

хибриди кукуруза. Опсези каротеноида добијени у овој студији потврђују оне које су раније пријавили Аламу и сарадници за хибриде жутог кукуруза обогаћене провитамином А [27]. Штавише, укупни ксантофили су били веће вредности од укупних каротеноида провитамина А у жуто-наранџастим хибридима кукуруза отпорних на Стрига, што потврђује налазе Ортиза ет ал. [28].

Каротеноиди су можда допунили инхибиторне активности ензима за антиоксидацију и хидролизу скроба фенолних једињења у жуто-наранџастим хибридима кукуруза отпорних на Стрига, у складу са њиховим пријављеним биоактивностима. На пример, пријављено је да каротеноиди поседују антиоксидативну активност као главни механизам који лежи у основи њихових здравствених користи [29]. Они такође пружају заштитне ефекте против незаразних хроничних болести као што су рак[30] и кардиоваскуларне болести [31]. Такође, пријављено је да -криптоксантин значајно смањује ризик од дијабетеса типа 2 (Т2Д) и ублажава инсулинску резистенцију [32,33].

2.2. Антиоксидативна активност шест цевоводних хибрида кукуруза отпорних на жуто-наранџасту боју

Антиоксидативна активност жуто-наранџастих хибрида кукуруза отпорних на Стрига (Табела 3) је открила да је свих шест клонова цевовода показало антиоксидативну активност уклањањем слободних радикала (АБТС степен плус и ДППХ*) и редуковањем јона гвожђа (Фе3 плус) у јоне гвожђа. (Фе2 плус). Антиоксидативна активност је значајно варирала (стр<0.05) among="" the="" hybrids,="" with="" as9="" having="" the="" strongest=""><0.05) free="" radicals="" scavenging="" abilities(7.28="" teac="" mmol/g="" and="" sc50,="" 9.07±="" 0.27="" mg/ml="" for="" abts+="" and="" dpph,="" respectively)and="" ferric-reducing="" power="" (0.43="" mg="" gae/g).="" it="" is="" pertinent="" to="" recall="" that="" as9-9="" also="" had="" the="" highest="" level="" of="" total="" phenolics="" and="" tannins,="" as="" presented="" earlier="" in="" table="" 1.="" the="" dpph°scavenging="" abilities="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" obtained="" in="" this="" study="" (sc50:="" 9.07="" to="" 26.35="" mg/ml)="" are="" more="" potent="" than="" those="" reported="" by="" rodriguez-salinas="" et="" al.="" [13]="" for="" pigmented="" maize="" genotypes(ic50:="" 31="" to="" 52="" mg/ml)="" since="" a="" lower="" sc50="" or="" ic50="" is="" indicative="" of="" a="" stronger="" activity="" [34].="" however,="" vitamin="" c,="" a="" standard="" antioxidant="" with="" a="" lower="" sc50(4.63±0.28="" mg/ml),="" had="" a="" stronger="" dpph*scavenging="" activity="" than="" all="" of="" the="" six="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids.="" similarly,="" the="" abts·+="" scavenging="" activity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" (2.65-7.68="" teac="" mmol/g)is="" higher="" than="" the="" value="" (294.81±="" 2.23="" umol="" teac/g)reported="" by="" irondi="" et="" al.[17]="" for="" provitamin="" a="" yellow="" maize="" flour.="" the="" stronger="" antioxidant="" activity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" over="" the="" non-striga-resistant="" pigmented="" maize="" genotypes="" may="" be="" attributed="" to="" the="" increased="" deposition="" of="" polyphenolic="" compounds="" in="" their="" defense="" against="" s.="" hermonthica="" [20],="" which="" may="" have,="" consequently,="" enhanced="" the="" antioxidant="" capacity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="">

Способност уклањања слободних радикала и моћ редукције гвожђа код хибрида жуто-наранџастог кукуруза отпорних на Стрига сугеришу да они могу бити корисни у заштити тела од оксидативних напада изазваних слободним радикалима и реактивним врстама кисеоника. Дакле, жуто-наранџасти хибриди кукуруза отпорни на Стрига могу имати заштитни ефекат против оксидативног оштећења биомолекула у телу, укључујући нуклеинске киселине, протеине, липиде и угљене хидрате [35] и хроничне болести повезане са оксидативним стресом [36] .

2.3. Инхибиторне активности ензима који хидролизују скроб код шест цевовода отпорних на стрига отпорне биофортификоване жуто-наранџасте хибриде кукуруза

Инхибициона активност ензима за хидролизу скроба (-амилазе и -глукозидазе) шест цевовода жуто-наранџастих хибрида кукуруза отпорних на Стрига, изражена као ИЦ50 (концентрација екстракта која је инхибирала активност ензима за 50 процената), представљена је у табели 4. ИЦ50 вредности жуто-наранџастих хибрида кукуруза отпорних на Стрига на -амилазу и -глукозидазу кретале су се од 26,28 до 52,55 мг/мЛ и 47,72 до 63,98 мг/мЛ у АС9 и АС4, респективно. Тако је међу шест цевоводних Стрига отпорних жуто-наранџастих хибрида кукуруза, АС9 са најнижим ИЦ50 вредностима и за -амилазу и за -глукозидазу, показао најјачи (п<0.05)inhibitory activity="" on="" these="" two="" enzymes.="" interestingly,="" there="" was="" no="" significant="" (p="">0.05) разлика у ИЦ50 вредностима АС9 и акарбозе (стандардни антидијабетички лек) на -амилази, што указује да су инхибиторне способности АС9 и акарбозе у -амилазу биле упоредиве. Међутим, осим инхибицијске способности АС9 на -амилазу која је била упоредива са оном акарбозе, инхибиторне активности акарбозе -амилазе и -глукозидазе биле су јаче од оних код жуто-наранџастих хибрида кукуруза отпорних на Стрига. Фабила-Гарциа ет ал. [15]. Њихови налази су открили да екстракт жутог кукуруза има највећу инхибиторну активност глукозидазе, изражену у процентима (69,8 процената), међу генотиповима кукуруза. Поред тога, Иронди ет ал. [17] је недавно пријавио ИЦ50 вредности о-амилазе и -глукозидазе од 237,12±2,60 и 157,18±1,05 уг/мЛ, респективно, за провитамин А жуто кукурузно брашно. У односу на екстракт кукурузне свиле, за који је пријављено [37] да инхибира а-амилазу и -глукозидазу са просечним вредностима ИЦ50 од 218,4 и 221,4 уг/мЛ, респективно, хибриди жуто-наранџастог кукуруза отпорних на шест цевовода Стрига имали су слабији инхибиторни ефекат. на ц-амилазу и к-глукозидазу.

И ц-амилаза и о-глукозидаза учествују у варењу угљених хидрата из исхране. Док -амилаза у танком цреву хидролизује скроб -1,4 везе да би ослободила олигосахариде и дисахариде, -глукозидаза у ивици танког црева довршава варење даљом хидролизом олигосахарида и дисахарида, укључујући моносахариде који се могу апсорбовати. и фруктоза [38]. Дакле, инхибиција ова два дигестивна ензима је добро успостављен терапеутски приступ за ублажавање постпрандијалне хипергликемије у лечењу Т2Д и кључни механизам деловања

многих антидијабетичких агенаса [39], укључујући лекове, природне производе и функционалну храну. Штавише, жуто-наранџасти хибриди кукуруза отпорни на Стрига имали су значајнији инхибиторни ефекат на -амилазу него на -глукозидазу. Овај образац инхибиције ензима који хидролизују скроб има корисне терапеутске импликације и слаже се са обрасцем пријављеним у претходним студијама [17,А0]. Дакле, шест цевоводних Стрига отпорних жуто-наранџастих хибрида кукуруза, посебно АС9, могу имати неке предности у контроли постпрандијалне хипергликемије.

2.4. Корелације између биоактивних компоненти, антиоксиданса и ензима који хидролизују скроб инхибиторне активности шест цевоводних хибрида жуто-наранџастог кукуруза отпорних на стригу

Међу биоактивним компонентама, укупни феноли су значајно корелирали са АБТС плус (стр<><0.01,r=-0.867), reducing=""><0.05,r=0.633), α-amylase="" ic50=""><0.01,r=-0.836)and α-glucosidase="" ic50=""><0.05,r=-0.582) (table="" 5).="" as="" earlier="" stated,="" lower="" dpph"="" scs0="" and="" enzyme="" ics0="" values="" are="" indicative="" of="" stronger="" scavenging="" and="" inhibitory="" activities="" of="" a="" given="" sample="" on="" dpph*="" and="" enzymes,="" respectively="" [34].="" thus,="" when="" taken="" together,="" the="" negative="" correlations="" between="" total="" phenolics="" and="" dpph·sc50,="" α-amylase="" ic50="" and="" α-glucosidase="" ic50,="" as="" well="" as="" the="" positive="" correlations="" between="" total="" phenolics="" and="" abts="" scavenging="" ability="" and="" reducing="" power,="" suggest="" that="" phenolic="" compounds="" may="" have="" contributed="" majorly="" to="" the="" observed="" antioxidant="" and="" starch-hydrolyzing="" enzymes="" inhibitory="" activities="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="">

3. Материјали и методе

3.1. Хемикалије и реагенси

Тролок, кверцетин, Л-аскорбинска киселина, гална киселина, АБТС (2,2'-азино-бис-(3-етилбензтиазолин-6-сулфонска киселина)), ДППХ(2,2-дифенил) -2-пикрилхидразил), -глукозидаза из Бациллус стеаротхермопхиллус, п-нитрофенилглукопиранозид (ПНПГ), -амилаза, растворљиви скроб и акарбоза набављени су од Сигме (Сент Луис). Коришћене су аналитичке класе свих других хемикалија и растварача.

3.2. Узимање узорака

Узорци сувог семена шест жуто-наранџастих хибрида кукуруза отпорних на цевовод Стрига (шифровани АС1828-1,4,6,8,9,11) сви узгајани у Саминаки (8 степени 39'Е, 10 степен 34' Н; надморска висина 760 м; годишња количина падавина 1149 мм; температура 18.1-37.3 степен; тип земљишта, Дистриц Нитосолс) и Зариа (7 степени 45'Е, 11 степени 8'Н ; надморска висина од 622 м; годишње падавине од 1076 мм; просечна температура од 13.9-35.5 степени; тип земљишта, Ферриц Лувисолс) прикупљени су из Програма за побољшање кукуруза Међународног института за тропску пољопривреду (ИИТА), Ибадан, Нигерија. Хибриди су посађени у мају две сезоне, у рандомизованом комплетном блок дизајну у три понављања, током кишне сезоне. Узорци су млевени у брашно (величина сита 0,50 мм) са Пертен Лаборатори Хаммер Милл (3102, САД) и херметички паковани у непрозирне кесе за узорке за даље лабораторијске анализе.

3.3. Припрема 1 екстракта узорака

Да би се припремио екстракт из брашна жуто-наранџастих хибрида кукуруза отпорног на Стрига, 1 г брашна је натопљен у 10 мЛ метанола у покривеној епрувети за центрифугирање од 50 мЛ преко ноћи (12 х) уз повремено мућкање. Након тога, смеша је центрифугирана на 3000 рпм током 10 минута, а затим је супернатант (метанолни екстракт) сакупљен и чуван на -4 степену Ц до анализе [41].

3.4. Одређивање укупног садржаја фенола

Фолин-Циоцалтеу метода коју су описали Синглетон ет ал. [42] је усвојен за одређивање укупног садржаја фенола у екстракту брашна жуто-наранџастих хибрида кукуруза отпорног на Стрига, Део (300 уЛ) екстракта је стављен у епрувету (у три примерка). Након тога, додато је 1,5 мЛ Фолин-Циоцалтеу реагенса (основни Фолин-Циоцалтеу реагенс разблажен 10 пута дестилованом водом) и 1,2 мЛ раствора На2ЦО3 (7,5 процената в/в), и смеша је инкубирана у мраку 30 минута на собна температура. Након тога, очитана је апсорпција на 765 нм према слепом узорку. Укупан садржај фенола је израчунат коришћењем калибрационе криве галне киселине и изражен као еквивалент галне киселине (ГАЕ) у узорку од мг/г.

3.5. Одређивање укупног садржаја флавоноида

Протокол који су описали Кале ет ал. [43] је коришћен за одређивање укупног садржаја флавоноида у екстракту брашна жуто-наранџастих хибрида кукуруза отпорног на Стрига. Укратко, 0.5 мл екстракта је стављено у епрувете; након тога је додато 1,5 мЛ метанола,0.1 мл алуминијум хлорида (10 проценат), 0,1 мЛ 1 М калијум ацетата и 2,8 мЛ дестиловане воде. Реакциона смеша је мешана на вортексу и инкубирана на собној температури 30 мин, након чега је очитана апсорпција на 514 нм. Укупни садржај флавоноида у екстрактима је изражен као кверцетин еквивалент (КЕ) у узорку мг/г.

3.6. Одређивање садржаја танина

Садржај танина у екстрактима брашна жуто-наранџастих хибрида кукуруза отпорних на Стрига је квантификован колориметријском методом коју је претходно описао Јослин [44], уз незнатну модификацију. Део узорка (0.5 г) је диспергован у 5 мЛ 1% ХЦл у метанолу и остављен 15 мин. Након тога, смеша је центрифугирана на 3{{10}00 рпм током 10 мин. Део од 0,1 мЛ супернатанта је стављен у епрувету са 7,5 мЛ дестиловане воде, након чега је додато 0,5 мЛ Фолин-Деннис реагенса и 1 мЛ раствора На2ЦО3 (35 процената) и запремина је допуњена до 10 мЛ са 0,9 мЛ дестиловане воде После мешања, реакциона смеша је инкубирана 30 мин на собној температури, а апсорбанца је очитана на 760 нм. Садржај танина, изражен као еквивалент танинске киселине (ТАЕ) у узорку мг/г, израчунат је из стандардне криве танинске киселине.

3.7. Квантификација садржаја каротеноида у узорку

Садржај каротеноида у брашну жуто-наранџастих хибрида кукуруза отпорног на Стрига одређен је применом методе коју су описали Хове и Танумихардјо [45]. Каротеноиди су екстраховани из брашна мешањем 0.6 г узорка са 6 мЛ етанола (који садржи 0.1 проценат бутилованог хидроксил толуена). Смеша је стављена у водено купатило на 85 степени у трајању од 5 минута. Затим је мешајуће уље у смеши сапонификовано калијум хидроксидом (80 процената в/в) на 85 степени у воденом купатилу током 5 минута. Суспензија је затим мешана помоћу вортекс машине и враћена у водено купатило на још 5 мин. Одмах је пребачен у купатило са ледом и додато је 3 мЛ хладне дејонизоване воде. Садржај каротеноида из смеше је одвојен три пута узастопно са 3 мЛ н-хексана центрифугирањем на 1000 рпм током 10 с. Горњи слој смеше је стављен у епрувету концентратора од 50 мЛ. Комбинована хексанска фракција је испрана три пута дејонизованом водом, вортексирана и центрифугирана 10 с на 1000 рпм. Фракција н-хексана је осушена коришћењем ТурбоВап (ЛИВ) концентратора под гасом азота током 25 мин. Осушени екстракт је реконституисан са метанол/дихлорометаном (1 мЛ, 50:50 в/в), а аликвот од 100 μЛ је убризган у ХПЛЦ систем да би се квантификовали каротеноиди. ХПЛЦ систем (Ватер Цорпоратион, Милфорд, МА, САД) се састојао од заштитне колоне, Ц30 ИМЦ каротеноидне колоне (4,6×250 мм, 3 μМ), бинарне ХПЛЦ пумпе (Ватерс 626), ауто-самплера (Ватерс 717) и детектор низа фотодиода (Ватерс 2996). Систем је радио са софтвером Емповер 1 (Ватерс Цорпоратион). Мобилна фаза се састојала од растварача А, који садржи метанол:вода (92:8 в/в) са 10 ммол/Л амонијум ацетата, и растварача Б, који садржи 100 процената метил терцијарног-бутил етра. Градијентно елуирање је изведено при брзини протока од 1 мЛ/мин под следећим условима: 29 мин линеарног градијента од 83 процената до 59 процената А; 6 мин линеарног градијента од 59 процената до 30 процената А; 1 мин задржавања на 30 проценат А;4 мин линеарног градијента од 30 процената до 83 процента А и 4-мин задржавање на 83 процента. Хроматограми каротеноида су генерисани на 450 нм, а специфични каротеноиди су идентификовани и квантификовани коришћењем методе екстерних стандарда на основу калибрационе криве из чистих стандарда и поређења апсорпционог спектра и ко-елуације са стандардним каротеноидима.

3.8. Одређивање садржаја фитинске киселине

За одређивање садржаја фитинске киселине у брашну коришћена је метода Вхеелер и Феррел [46]. Екстракција је урађена механичким мућкањем мешавине од 1 г брашна и 25 мЛ 3 процента трихлоросирћетне киселине (ТЦА) током 1 х, а суспензија је центрифугирана 15 минута на 3500 о/мин. Аликвот од 10 мЛ супернатанта је помешан са 4 мЛ раствора гвожђе хлорида, и смеша је загревана у кључалом воденом купатилу 45 мин. Добијена суспензија је центрифугирана на 3500 рпм током 15 минута и супернатант је пажљиво декантован. Након тога, талог је два пута испран дисперговањем у 25 мЛ 3 процента ТЦА, загревањем у кључалом воденом купатилу 10 мин и центрифугиран на 3500 рпм током 10 мин. Запремина преципитата је доведена до 30 мЛ са дестилованом водом, а смеша је загревана у кључалом воденом купатилу 30 мин. Врућа суспензија је филтрирана уз помоћ Вхатман филтер папира (бр. 2), а талог је испран са 60 мЛ вреле дестиловане воде да би се обезбедила потпуна филтрација. Затим је преципитат задржан на филтер папиру растворен са 40 мЛ вруће 3,2 М ХНО3 у одмерној тиквици од 100 мЛ. Аликвот од 0,5 мЛ је пребачен у епрувету за центрифугирање и разблажен са 7 мЛ дестиловане воде, након чега је додато 2 мЛ 1,5 М КСЦН, а запремина је доведена до 10 мЛ са 0,5 мЛ дестиловане воде. Апсорпција је очитана (унутар 1 мин) на 480 нм. Садржај фитинске киселине у брашну је израчунат коришћењем атомског односа Фе/П од 4:6.

3.9. 2,2-азинобис(3-етил-бензотиазолин-6-сулфонска киселина) радикал катјона (АБТС· плус )СцаОенгинг тест/

Способност екстракта брашна жуто-наранџастих хибрида кукуруза отпорних на Стрига да уклоне АБТС" испитана је усвајањем процедуре коју је известио Реет ал. [47]. АБТС* плус радни реагенс је припремљен темељним мешањем једнаке запремине водених раствора воденог раствора. АБТС плус (7 милимола/Л) и К2С2Ос (2,45 милимола/Л) и инкубирање смеше

у тамном орману на собној температури 16 х. Након тога, апсорбанца реагенса је подешена на 0.70±0.02 са етанолом (95 процената) на 734 нм. Затим је 0,2 мл екстракта и 2,0 мл АБТС* реагенса стављено у епрувету, добро измешано и инкубирано на собној температури 15 минута у тамном стању. Коначно, апсорбанца је очитана на УВ-Висибле спектрофотометру (Милтон Рои Цомпани, САД) на 734 нм. АБТСе плус способност чишћења екстракта брашна је касније израчуната из Тролок стандардне криве и изражена је као Тролок еквивалентни антиоксидативни капацитет (ТЕАЦ).

3.10. 2,2-дифенил-2-пикрилхидразил радикал (ДППХ") тест чишћења

Протокол који су пријавили Цервато ет ал. [48] ​​је коришћен за одређивање способности екстраката брашна да уклањају ДППХ", користећи витамин Ц (аскорбинску киселину) као референтни антиоксиданс. Укратко, реакциона смеша која садржи 1.0 мЛ различитих концентрација (8, 16 , 24, 32 мг/мЛ) екстракта (или витамина Ц) и 3.0 мл раствора ДППХ степена (60 μМ) је инкубирано на собној температури у тамном стању 30 минута. Након тога, апсорбанција је очитана на 517 нм, а ДППХ "способност чишћења (проценти) екстраката је израчуната и изражена као концентрација екстракта која је уклонила 50 процената ДППХ" (СЦ50).

3.11. Тест смањења снаге

Способност екстраката брашна да редукују Фе3 плус у Фе2 плус тестирана је усвајањем протокола који је описао Оиаизу [49]. Укратко, мешавина екстракта (2,5 мЛ), 200 мМ натријум-фосфатног пуфера (пХ 6,6) (2,5 мЛ) и 1% калијум-ферицијанида (2,5 мЛ) је инкубирана на 50 степени 20 минута , након чега је додато 2,5 мЛ 10% трихлоросирћетне киселине. Затим је смеша центрифугирана на 650 × г током 10 минута. Део од 2,5 мЛ супернатанта је стављен у епрувету, а додато је 2,5 мЛ дестиловане воде и 1 мЛ 0,1 процентног гвожђехлорида и темељно измешано, а апсорбанца је очитана на 700 нм. Коначно, израчуната је редукциона моћ екстраката и изражена у милиграмском еквиваленту галне киселине по граму узорка.

3.12. Тест инхибиције алфа-амилазе

Тест инхибиције алфа-амилазе је спроведен усвајањем процедуре коју су описали Квон ет ал. [50]. Свињски панкреас -амилаза (ЕЦ3.2.1.1) и растворљиви скроб (супстрат) су коришћени у овом тесту. Различита разблажења екстраката брашна, укупно 500μЛ и 500μЛ 0.02 М натријум-фосфатног пуфера (пХ6,9 са 0,006 М НаЦл) који садржи 0,5 мг/мЛ раствора -амилазе су помешани и инкубирани на 37 степени 10 мин. Затим је додато 500 μЛ 1 процентног раствора скроба у 0,02 М натријум-фосфатном пуферу и реакциона смеша је инкубирана на 37 степени током 15 минута. Након тога, хидролиза скроба катализована -амилазом прекинута је додавањем 1,0 мЛ ДНСА реагенса за боју (1 проценат 35-динитро салицилне киселине и 12 процената натријум калијум тартрата у 0,4 М НаОХ). Реакциона смеша је касније инкубирана 5 мин у кључалом воденом купатилу, охлађена на собну температуру и разблажена са 10 мЛ дестиловане воде. Апсорбанција смеше је очитана на 540 нм. У експеримент је укључен референтни тест који је искључио екстракт брашна. Након тога, проценат инхибиције -амилазе је израчунат на следећи начин:

(А540Р - А540С)× 100 посто инхибиција =А540Р

где је А540Р очитавање апсорбанције референце; А540С је очитавање апсорбанције узорка.

3.13. Тест инхибиције алфа-глукозидазе

Alpha-glucosidase inhibitory activity of the flours extracts was conducted by adopting the procedure reported by Kim et al. [39], using Bacillus stearothermophillus α-glucosidase (EC3.2.1.20) and para-nitrophenylglucopyranoside (PNPG) as the substrate. Five (5)units of an aliquot of α-glucosidase were incubated with 20 μg/mL of the extract for 15 min. The hydrolytic reaction was initiated by adding 3 mM PNPG prepared in 20 mM phosphate buffer, pH6.9, which served as a substrate. The hydrolytic reaction was allowed to proceed for 20 min at37°C, after which 2 mL of 0.1 M Na>ЦО: је додат да би се реакција прекинула. У експеримент је укључен референтни тест без екстракта брашна. Апсорбанца жутог п-нитрофенола ослобођеног из хидролизе ПНПГ катализоване -глукозидазом очитана је на 400 нм и проценат инхибиције о-глукозидазе је израчунат на следећи начин:

(А400Р - А400С)× 100 посто инхибиција =А400Р

где је А400Р очитавање апсорбанције референце; А400С је очитавање апсорбанције узорка.

3.14. Анализа података

Подаци добијени у овој студији (из трипликатних одређивања) изражени су као средње вредности ± стандардна девијација (СД). Коришћењем СПСС статистичког софтверског пакета (16. верзија) извршена је једносмерна анализа варијансе (АНОВА) на подацима, а средње вредности су упоређене коришћењем Тукеи-овог пост хоц теста на п.<0.05. the="" associations="" between="" the="" bioactive="" components,="" the="" antioxidant,="" and="" the="" starch-hydrolyzing="" enzymes="" inhibitory="" activities="" were="" calculated="" using="" the="" pearson="" correlation="" test.="" column="" representations="" of="" the="" mean="" values="" were="" done="" using="" graphpad="" prism="" (5th="">

4. Закључци

Шест цевоводних Стрига отпорних жуто-наранџастих хибрида кукуруза садржало је важне биоактивне састојке (укупне феноле, укупне флавоноиде, танине, фитинску киселину и каротеноиде). Њихови екстракти су показали јаку антиоксидативну активност и инхибирали ензиме за хидролизу скроба (-амилазу и -глукозидазу). Међу жуто-наранџастим хибридима кукуруза отпорним на Стрига, АС1828-9 је имао најснажнију антиоксидативну активност и инхибиторну активност ензима који хидролизује скроб. Уочене су значајне корелације између укупног садржаја фенола и АБТС* плус, ДППХ степена способности чишћења, редукционе моћи, инхибиторне активности -амилазе и -глукозидазе код хибрида жуто-наранџастог кукуруза отпорних на Стрига. Инхибициона активност ензима антиоксиданса и ензима који хидролизују скроб сугеришу да хибриди жуто-наранџастог кукуруза отпорни на Стрига (посебно АС1828-9) могу бити корисни у превенцији и/или ублажавању оксидативног стреса и постпрандијалне хипергликемије.