Управљање раствореним кисеоником помоћу контактора мембране од полипропиленских шупљих влакана утиче на старење вина

контакт:tina.xiang@wecistanche.com

Апстрактан

Позадина: Бројне енолошке праксе могу изазвати вишак раствореног кисеоника у вину, чиме се краткорочно или дугорочно одређују сензорни и хроматски дефекти. Због тога је неопходно управљати вишком кисеоника пре флаширања. Методе: У овом истраживању, управљање садржајем раствореног кисеоника помоћу апарата за контактор са мембраном од полипропиленских шупљих влакана обављено је у два вина из различитих сорти грожђа (Аљанико и Фалангина). Вина су анализирана након 11-месечног одлежавања. Садржај антоцијанина и ацеталдехида је процењен помоћу ХПЛЦ. Поред тога, другифенолниједињења и хроматске карактеристике анализиране су спектрофотометријским методама. НМР и ХР ЕСИМС анализе су спроведене да би се проценио број проантоцијанина и полимерних пигмената. Резултати: После 11 месеци одлежавања, у оба вина, уочено је смањење слободног и укупног СО2 у односу на почетне вредности. У винима са највишим нивоом раствореног кисеоника примећен је значајнији губитак. Нису откривене значајне разлике у погледу параметара боје. У црвеном вину са највећим садржајем кисеоника, масивно формирање полимерапигментиа примећени су реактивни танини БСА, за разлику од вина са нижим нивоом кисеоника. Закључак: Студија је показала да се мембрански контактор може показати као успешан алат за управљање раствореним кисеоником у винима како би се спречило њихово оксидативно кварење.

Кључне речи: оксидација; мембрански контактор; вино; полимерни пигменти

кликните да бисте добили више информација

1. Представљање

Вино је хемијски динамичан систем, па чак и након ферментације, његов састав наставља да се развија током складиштења. Ове промене после ферментације се називају старењем, али треба направити разлику између промена које се дешавају током фазе сазревања (нпр. складиштење вина у великим количинама у резервоару или бурету), када је интервенција винара још увек дозвољена, и оних које узимају место у фази одлежавања након што се вино затвори у флаше и једина могућа интервенција је ограничена на избор најприкладнијих услова складиштења.

Међу винским једињењима, феноли су они који су највише погођени старењем. Потичу од грожђа (флавоноидии нефлавоноиди) и представљају један од најважнијих параметара квалитета вина. Током винарства и старења, феноли се углавном подвргавајуоксидацијереакције, које не утичу само на сам фенолни састав већ и одређују промене у погледу сензорних карактеристика, као што су боја и опорост.

Фенолна једињења су примарни реактанти који се оксидују у присуству кисеоника и метала (Фе3 плус Цу2 плус), што доводи до каскаде хемијских трансформација које могу довести до прекомерног кварења вина [1]. Винооксидацијесастоји се од низа реакција: прво, кисеоник се редукује у водоник пероксид интеракцијом са прелазним металима, укључујући јоне гвожђа и бакра, у присуству катехолних подјединица које су оксидоване у киноне [2]. Хинони снажно реагују са нуклеофилним једињењима, као што су антиоксиданси (сумпор-диоксид, глутатион, аскорбинска киселина), пожељни испарљиви тиоли

(тј. 3-сулфанилхексанол), непожељни ароматиоли (тј. водоник сулфид), аминокиселине (тј. фенилаланин, метионин) и бројни полифеноли (углавном флавоноли). Производи ових реакција могу довести до стварања кондензованогполимерни пигменти— посебно важно код црних вина — или чак до губитка боје и сортних карактера [3]. У следећем кораку, врсте гвожђа или бакра реагују са водоник-пероксидом Фентоном реакцијом дајући хидроксилни радикал, јак оксидант, способан да реагује са свим органским састојцима пропорционално концентрацији [4]. Најзаступљеније органско једињење у вину је етанол, који се претвара у ацеталдехид након оксидације хидроксилним радикалом.

Као последицаоксидације, у црвеном вину природни антоцијански пигменти се брзо трансформишу у стабилније пигменте путем различитих типова реакција као што су реакције кондензације посредоване алдехидом са танинима и реакције цикло-адиције које доводе до стварања проантоцијана [5]. Реакције оксидације такође доприносе модификацији трпкости вина променом структуре танина као последица интра и интермолекуларних реакција посредованих кисеоником [6]. Ови „стабилизовани производи“ антоцијанин или пигментирани танини опстају много дуже у вину него у својим почетним облицима [7]. Стога су мале количине кисеоника у црном вину важне за стабилизацију боје или трпкости. Сам Пастер је, у својим студијама о вину, теоретизирао да само када је вино изложено кисеонику може развити атрибуте који га чине фино одлежаним висококвалитетним производом. Током производње вина, кисеоник игра кључну улогу у процесу ферментације. Промовише синтезу биомасе квасца и погодује звучној ферментацији. Неколико студија је показало да се ризик од застоја и споре ферментације смањује након додавања кисеоника од 10-20 мг/Л [8].

У белим винима, оксидација је обично повезана са важним променама боје. Смеђа боја је обично нежељена јер је знак оксидације у стоном белом вину. Смеђа боја може бити изазвана ензимском или хемијском оксидацијом посредованом кисеоником. Ово последње је спорије од оксидације изазване ензима. Бело вино је генерално осетљивије на О од црвеног вина. Чак и мали додаци О. белом вину могу довести до губитка ароме, посебно воћности са појавом непријатних укуса који се описују као карамела, ужегло, узгајано поврће, налик меду и кувано поврће. Хинони настали оксидацијом могу да реагују са тиолима помоћу Мицхаелове реакције адиције или да генеришу Х2О2, као што је горе наведено. Оксидативна средина кроз све фазе производње вина је у позитивној корелацији са формирањем ових производа. Током одлежавања црног вина у храстовим бурадима, оксидативни процес такође изазива стварање сотолона оксидацијом треонина или реакцијом ацеталдехида са -кетобутерном киселином. Оксидативна деградација фенилаланина и -фенилетанола у бурету такође доводи до виших концентрација фенилацеталдехида [9].

Као што је горе описано, кисеоник може имати или повољан или штетан утицај на квалитет вина. Ниво изложености вина кисеонику током производње вина или одлежавања је кључан јер може утицати на коначни производ. Синглетон [10] је проценио количину кисеоника коју бело или црвено вино може да апсорбује пре него што се појаве оксидативни дефекти. У белом вину, толеранција је око 10 засићења ваздуха за разлику од црвеног вина, које може да толерише више од 30 засићења ваздуха (180 мЛО2/Л). Такође је препоручио око 10 засићења за побољшање квалитета црног вина.

Управљање кисеоником током фаза винификације и складиштења је, стога, важно и њиме се мора руковати у складу са стеченим знањима како би се избегла појава оксидативних карактера. Након производње вина, вино се обично подвргава низу поступака стабилизације као што су декантирање, хлађење и филтрација који могу утврдити неконтролисани улаз кисеоника. Поред тога, нове методе винификације које користе резервоаре од нерђајућег челика и системе који омогућавају контролисано снабдевање кисеоником (микрооксигенација) су сада уобичајене. Чак и када су уложени специфични напори да се произведу вина која су што отпорнија на даљи унос кисеоника, сав неконтролисани растворени кисеоник у вину може да одреди даљи развој оксидационих својстава након флаширања. У том контексту, употреба мембранског контактора за управљање кисеоником у вину пре флаширања може бити успешна стратегија за добијање најбољих могућих вина.

Мембрански контактори су међу најчешће коришћеним индустријским системима, а ова технологија се показала корисном у низу примена течности/течности и гаса/течности у ферментацији, фармацеутским производима, третману отпадних вода, хиралним сепарацијама, производњи полупроводника, карбонизацији пића, екстракцији металних јона , екстракција протеина, уклањање ВОЦ из отпадног гаса, осмотска дестилација и декохолизација вина [11,12]. То је уређај који постиже пренос масе гас/течност или течност/течност без дисперзије једне фазе унутар друге. Иако је технологија мембранског контактора уведена као средство за управљање гасовима у винима [13,14], до сада се неколико студија бавило ефикасношћу његове примене пре флаширања како би се регулисала еволуција белог и црвеног вина током старења у боци.

У овој студији је извршена делимична деоксигенација на два моносортна вина: Аљаницо и Фалангина. Ефекат уклањања кисеоника на неколико параметара вина као што су садржај слободног и везаног СО2 и ацеталдехида је процењен након 1л месеца одлежавања у боци. За црно вино је такође процењен утицај на хроматске карактеристике и главна фенолна једињења.

2. Резултати и дискусија

У овој студији, два комерцијална вина (Аглианицо (Р) и Фалангхина(В)) су подвргнута процесу деоксигенације коришћењем технологије мембранског контактора да би се добила три вина са смањеним нивоом раствореног кисеоника (висок (Х), средњи (М), и ниско (Л) за свако вино) пре фазе флаширања. После 11 месеци старења флаше, ефекти на сумпор диоксид, ацеталдехид, хроматске карактеристике,полимерни пигменти, ВРФ, БСА-танини и укупни фенолни су процењени.

2.1. Сумпор-диоксид

Концентрација слободног и укупног СО2 праћена је након 11 месеци одлежавања у вину Аглианицо (Табела 1). За све узорке уочен је губитак СО2 у односу на време пуњења (слободни СО, 18 мг/Л, тот СО, 43 мг/Л), а највећи пад вредности укупног СО2 забележен је код вина са вишим садржај кисеоника при флаширању (РХО2 и РМО2), како се очекивало.

Током процеса старења, најзаступљенији облици слободног СО2 на пХ вредности вина, бисулфитни јон (ХСО, у равнотежи са молекулским СО,), троше се реакцијом са водоник пероксидом и неколико електрофилних компоненти вина, као што су оне произведене каскадом оксидације, укључујући хинон и ацеталдехид [15]. У окружењу винарије, уобичајена је пракса да се мери такозвани „слободни СО“, који је збир молекулског СО и бисулфитног јона. Ово последње једињење може да формира ковалентне адукте са електрофилима, зване СО2 везива, који се могу класификовати као слаби или јаки на основу константе дисоцијације формираних сулфитних адуката. Ови сулфитни адукти се називају везани СО, а збир

слободног и везаног СО даје "укупни СО". Слободни и везани СО су у равнотежи један са другим у вину. Штавише, током оксидације, равнотежом између ова два облика СО2 и потрошњом слободног СО2, комбиновани облик се ослобађа да би се успоставила равнотежа. Код свих третираних црних вина, вредности слободног СО2 испод 3,84 мг/Л су откривене након 11 месеци одлежавања у боци. Ове вредности су знатно испод границе квантификације званичних метода анализе слободног СО2 [16]; стога је исправније сматрати занемарљивом вредност слободног СО, док су вредности укупног СО биле ниже у узорцима флашираним са већим садржајем раствореног кисеоника (РХО2). Промена између слободног и комбинованог старења вина може бити разлог зашто је у винима откривен пад нивоа укупног СО2 како се растворени кисеоник при флаширању повећава. Осим потрошње СО2 услед реакција оксидације, део се може изгубити и током старења услед реакција сумпор-диоксида са флаванолима. Механизам формирања 4/ß-сулфонираних производа је још увек неизвестан. Претпоставља се да мономерни 4ß-сулфонирани деривати настају киселином катализованом деполимеризацијом проантоцијанидина [17].

Концентрације слободног и укупног СО2 (Табела 1) праћене су након 11 месеци одлежавања у белом вину чије је понашање било исто као и у црном вину. Даље, у овом случају је детектован губитак слободног и укупног СО2 у односу на почетне вредности (слободни СО,26 мг/Л и укупни СО, 89 мг/Л). Поред тога, вина са већим садржајем кисеоника на флаширање (ВХО2) је показало мањи садржај слободног и укупног СО2.

Ацеталдехид, настао металом катализованом оксидацијом етанола током оксидације вина, био је виши на 11 месеци старења у узорку СЗО, у односу на узорак ВМО и ВЛО, како се и очекивало с обзиром на нижи садржај слободног и укупног СО, у СЗО, узорци (табела 2). Пошто је тежински однос између ацеталдехида и сумпор диоксида 1,4/1 (1,4 мг СО2 утрошеног на 1 мг ЦХ3ЦХО), могли бисмо проценити да је количина ацеталдехида у узорку ВХО у потпуности комбинована са СО, (50 мг ацеталдехида у комбинацији са 70 мг СО2) и с обзиром на занемарљиве нивое слободног сумпор-диоксида након 11 месеци старења, очекује се да даља изложеност кисеонику може довести до појаве слободног ацеталдехида.

У црним винима концентрација ацеталдехида се не разликује међу анализираним узорцима. Ово је вероватно због чињенице да, у присуству антоцијана и веће концентрације флаванола, ацеталдехид учествује у бројним реакцијама са овим фенолима током старења. Као што је објашњено у наставку, најважнија реакција која укључује ацеталдехид, антоцијанине и флавоноле је формирање етил-премошћених једињења [18,19] и етил-везаних олигомера, који могу даље да реагују са додатним ацеталдехидом, антоцијанинима и флавонолима да би створили пиран прстенасте или друге структуре полимерног типа. На крају крајева, ови производи могу да промене сензорне атрибуте вина [20] утичући на неке кључне карактеристике вина као што су боја, укус и трпкост.

2.2. Утицај на пигменте и хроматске карактере

Подаци о садржају мономерних антоцијанина у третираним црвеним винима након 11 месеци одлежавања у боци показују (табела 3 и додатни материјали, слика С1) губитак малвидин-3-глукозида у узорку РХО2 са вишом концентрацијом кисеоника него у РМО2 и РЛО2. Конзистентно, међу винима су откривене разлике у погледу укупних антоцијана (Слика 1). Вино са ниском концентрацијом кисеоника при флаширању је показало већу концентрацију укупних нативних антоцијана у односу на она са већом концентрацијом раствореног кисеоника. Ефекат третмана мембранског контактора на различите класе пигмента, утврђен Харбертсон методом, укључивао је очекивано значајно ниску концентрацију СПП (кратких полимерних пигмената) у узорцима РЛО, у поређењу са узорцима РХО2 и РМО2 који су показали највећи пораст ових важних стабилна једињења (табела 4). ЛПП (дуги полимерни пигменти) нису се значајно разликовали у свим узорцима. Полимерни пигменти (СПП и ЛПП) се дефинишу као пигменти отпорни на бисулфитно бељење. Настају реакцијом између антоцијана и танина током старења вина [21], што доводи до стабилизације боје током времена. Главна разлика између ове две класе пигмената је у томе што, за разлику од СПП, ЛПП има тенденцију таложења са протеином [22]. Како црвено вино стари, обично се примећује веће формирање ЛПП у односу на СПП. Дакле, промене откривене за СПП а не за ЛПП могу одражавати рано оксидативно стање Аглианицо вина након 11 месеци старења. Учешће нативних антоцијанина у реакцијама које дају нове полимерне пигменте је у складу са смањењем укупних нативних антоцијанина приказаним у (Табела 4), и са сличним ефектима уоченим у црвеним винима током микро-оксигенације [23].

Како вино стари и кроз различите изложености кисеонику, ови полимерни пигменти постају од пресудног значаја за боју вина и мале количине ацеталдехида могу да реагују са антоцијанинима да би произвеле нове стабилне црвене пигменте [19,24]. Чињеница да значајне разлике у погледу интензитета боје и нијансе нису откривене (Табела 5) вероватно је, као што је већ примећено за ЛПП, последица релативно кратког времена старења.

2.3. Утицај на пигменте црвеног вина: НМР и ХР ЕСИМС анализе

У циљу разумевања молекуларне основе уочених промена у винима третираним различитим нивоима кисеоника, узорци РХО2, РМО2 и РЛО су подвргнути НМР анализи, као што је описано у одељку 3. Пажљива инспекција добијени Х-НМР спектри три узорка нису открили никакву уочљиву разлику између три упоређена вина (Слика С2 допунских материјала). Стога смо одлучили да иста вина истражимо помоћу ХР ЕСИМС с обзиром на суштинску већу осетљивост технике у поређењу са НМР спектроскопијом. Три вина су фракционисана помоћу ХПЛЦ/Вис коришћењем Ц-18 колоне. За свако вино су добијене три фракције: прва фракција је сакупљена од 15 до 25 мин (фракција 1), друга од 25 до 30 мин (фракција 2) и, на крају, трећа фракција (фракција 3) од 30 мин до краја хроматографског циклуса. У складу са подацима објављеним у литератури [25], очекивало се да ће се у првој фракцији појавити неацетиловани антоцијанини, док је у другој фракцији требало да се прикупи потенцијални пираноанто-цијанин. Три добијене фракције (1-3) за свако од три анализирана вина (РХО,, РМО и РЛО,) су подвргнуте потпуној скенирању ХР ЕСИМС анализи у режиму позитивних јона. Кршење 1 свих вина, детектовали смо јонски пик који је приписан малвидин-3-О-глукозиду (493,1332;△=-1.648; одговара Ц23Х2сО12 плус), док су јонски врхови повезани са другим уобичајеним антоцијанини вина су, када су откривени, представљали грешке изнад 10 ппм и нису се сматрали поузданим (Допунски материјали Слика С3). У погледу фракција 2 и 3 РМО2 и РЛО, показало се да се у основи преклапају један са другим, док масени спектри фракција 2 и 3 РХО, вино је показало неке занимљиве особености. Тачније, у РХО, у фракцији 2 примећен је пик јона са центром на м/з517.1317(△=-4.569; што одговара Ц25Х25О12). Овај пик је приписан Витисину Б (Допунски материјали Слика С4) [26]. У масеном спектру фракције 3 РХО, два јонска пика на м/з809.2294(△=0.827; што одговара Ца0Х4О18) (Допунски материјали Слика С5) и 1029.2871(△=-0.065 ; који одговара ЦсХ53О25) (додатни материјали слика С6), респективно. Ови јонски пикови су индикативни за појаву полимерних пигмената. Пик на м/з 809 приписан је димерима премоштеним етилиденом који се састоји од једне малвидин-3-О-глукозидне јединице и једног (епи)катехинског дела[27И, а пик на м/з1029 је приписан етилиден- премоштени димер састављен од две јединице малвидин-3-О-глукозида, од којих се једна јавља у облику флавилијума, а друга у облику псеудо базе [28,29].

Витис у Б и пигменти премоштени етилиденом (м/з 809 и 1029) су резултат хемијске реакције између ацеталдехида и антоцијана или флаван{3}}ола. Ацеталдехид може деловати или као нуклеофил на свом алфа положају или као електрофил на карбонилној функцији. Реакција између нуклеофилног ацеталдехида и електрофилног Ц4 положаја антоцијанина доводи до формирања Витисина Б, прилично стабилног једињења класификованог као пираноантоцијанин. Насупрот томе, када ацеталдехид делује као електрофил тако што је подвргнут нуклеофилном нападу Ц8, ау мањој мери чак и Ц6 позиција било флаван-3-ола или антоцијана, формирају се димери премоштени етилиденом. Није изненађујуће да смо Витисин Б и црвене пигменте приметили само у вину РХО2, јер такви производи, као што је горе речено, настају реакцијом ацеталдехида са антоцијанинима и флаван{10}олима, а ацеталдехид је углавном молекул који настаје као резултат оксидативног процеса којем вина пролазе током времена путем излагања атмосферском кисеонику. Дакле, веће количине ацеталдехида су свакако присутне у РХО, него у РМО и РЛО, винима за које се чини да су заштићена од кисеоника до

2.4. Утицај на ВРФ, БСА-танине и укупне феноле

Иако су убрзо након третмана мембранским контактором нивои укупних фенола били слични међу третираним винима, након 11 месеци одлежавања у боци, број укупних фенола је био већи у узорку са већим концентрацијама кисеоника при флаширању, као што је приказано у табели 6. Ово би вероватно могло бити због улоге коју кисеоник игра у формирању фенолних једињења која су реактивнија на гвожђе и у варијацији молекуларне структуре мономерних и полимерних фенолних структура као што је већ приказано у винима која су подвргнута различитом уносу кисеоника током старења [6]. Ово потврђује тренд уочен у табели 6 за БСА-реактивне на танине и флаване реактивне на ванилин и у табели 4 за СПП који је показао статистичку разлику након 11 месеци старења.

већој мери од РХО2.

Концентрације танина реактивних на БСА-протеине одређиване су Хабертсоновом методом у РХО, РМО и РЛО. Током старења уочено је повећање нивоа танина реактивних на БСА у РХО2, што је у складу са могућом полимеризацијом танинских структура [27 ]. Заиста, Харбертсон [30] је показао да се преципитација БСА повећала као функција повећања степена полимеризације (или величине) од тримера до октамера. Као последица тога, свака промена у саставу и величини танина може утицати на њихову способност да реагују са БСА. Оксидација танина изазива стварање интрамолекуларних, као и интермолекулских веза између флавоноида. Ово последње узрокује да се полимери издужују и да постану реактивнији на протеине пљувачке [31]. Ове врсте реакција заправо могу да модификују структуру танина, а тиме и водоничне везе и хидрофобне интеракције са протеинима [32].

Како је опорост узрокована агрегацијом изазваном танином и таложењем пљувачних протеина [33], повећање БСА-танина у РХО2 сугерише да промене

подвргнути танинима помоћу ових реакција током старења могу допринети модификацији перцепције трпкости.

Ванилин-реактивни флавани (ВРФ) могу уместо тога пружити додатне информације у вези са величином кондензованих танина. У ствари, ванилин реагује са А прстеном флаванола на било којој позицији 6 или 8, али такође ацеталдехид реагује са истим позицијама А прстена флаванола. Због тога се смањење ВРФ може сматрати индиректном мером оксидативне полимеризације флаванола која је повезана са реакцијама изазваним ацеталдехидом и које укључују танине и антоцијанине [34].

У нашем истраживању примећена је нешто нижа концентрација ВРФ у узорку РМО2. Недостатак јасног тренда у функцији количине кисеоника могао би бити последица чињенице да ови молекули такође могу бити подвргнути хидролитичком цепању у присуству кисеоника новим молекуларним преуређењем са формирањем нових интра и интермолекуларних веза [6].

3. Материјали и методе

3.1. Вина

Коришћена су два комерцијална црвена вина Аглианицо и бела фалангина произведена у јужној Италији у винарији Цантина дел Табурно. Детаљи узорака заједно са неким основним параметрима приказани су у Табели 7. Основни параметри су одређени према ОИВ компендијуму међународних метода анализе вина и мошта (2007).

3.2. Управљање кисеоником у вину

Индустријски систем ИСИОКС (Тебалди срл) опремљен мембранским контактором гас-течност (Ликуи-Цел9, Трансверсе-флов, Соутх Лакес Др. Цхарлотте, НЦ, САД, одсечен 50 г/мол) и центрифугалном пумпом од нерђајућег челика је био коришћени. Мембрана обезбеђује фиксиран и добро одређен интерфејс за пренос масе гас/течност без преласка једне фазе у другу. Структура мембранског контактора (хидрофобна шупља влакна) је направљена од полипропилена (ПП) и нуди веома велику контактну површину (гас/течност) од 20 м²2.

Процес деоксигенације се састоји од континуираних циклуса у којима се Н, вакуум или комбинација прва два процеса (мешавина) која циркулише на једној површини полипропиленске мембране постепено обогаћује кисеоником који потиче из вина које циркулише на другој страни мембране. Покретачка сила процеса је разлика у парцијалном притиску кисеоника кроз мембрану. Током процеса, вино непрекидно циркулише из затвореног резервоара до апарата за деоксигенацију.

Да би се постигао потребан ниво кисеоника, садржај кисеоника у вину је праћен кроз све процесе до постизања циљног нивоа.

Контрола процеса је вршена праћењем О, нивоа у винима коришћењем рачунара уграђеног са веома једноставном програмском логиком и специфичним сензорима, који прате температуру и садржај кисеоника (луминисценцијски систем, Хацх Ланге, опсег мерења {{{{2} }}} до 20 мг/ЛО, резолуција: 0,01 мг/Л О2, тачност:0-5мг/ЛО2±0,1). За контролу улазног и излазног притиска коришћени су електронски прекидачи притиска, као и притисак гаса у процесу и ниво било каквог вакуума.

Различити третмани деоксигенације примењени су на вино како би се добили различити узорци са различитим садржајем кисеоника. Количина кисеоника у белом вину је била бело Високо О2, ВХО2=2.7 мг/Л, бело Средње О2, ВМО2=1 мг/Л, бело Ниско О2, ВЛО2= 0. 25 мг/Л.

Количина кисеоника у црном вину била је редом црвено високо О, РХО,=1 мг/Л, црвено средње О2, РМО2=0.5 мг/Л, црвено ниско О2, РЛО2=0 .2 мг/Л. Оба сета вина су филтрирана на 1 μм пре убризгавања у машину, са циљем да се избегне појава прљања и влажења мембране [35].

3.3. Флаширање узорака и старење

Након третмана, вина су флаширана и све боце су затворене коришћењем Номацорц коекструдираних синтетичких затварача (Номацорц СА, Тхимистер Цлермонт, Белгија) изаберите зелени 100, који омогућавају кисеонику да прође кроз чеп у контролисан начин (0,4 мг О2 после 3 месеца, 0,7 мг О, после 6 месеци, 1,2 мг О, после 12 месеци и 1,1 мг О, годину дана након прве године старења). Боце су одлежане 11 месеци на 15 степени.

3.4. Методе анализе

3.4.1. Одређивање ацеталдехида течном хроматографијом високих перформанси

Анализе ацеталдехида су изведене дериватизацијом експерименталног узорка вина и ХПЛЦ.

Анализа деривата је била следећа: узорак вина од 100 μЛ је стављен у бочицу, а затим је додато 20 μЛ свеже припремљеног 1,120 мг/Л СО, раствора, 20 μЛ 25 процената сумпорне киселине (Царло Ерба реагенс 96 процената) и 140 μЛ /Л2,4-динитрофенилхидразин реагенс. После мешања, раствор је остављен да реагује 15 минута на 65 степени, а затим је одмах охлађен на собну температуру [36].

Коришћен је ХПЛЦ апарат Схимадзу ЛЦ1{12}} АДВП (Схимадзу Италија, Милано, Италија) опремљен СЦЛ-10АВП системским контролером, две ЛЦ-10АДВП пумпе за креирање потребног градијента растварача , СПД-М 10 АВП детектор и комплетан систем за убризгавање Рхеодине модел 7725 (Рхеодине, Котати, Калифорнија, САД). Раздвајање је изведено на Ватерс Спхерисорб колони (Ц 18, супстрат честица силицијум диоксида, ОДС2 250×4,6 мм, пречник честица 5 ум, величина пора 80 А) опремљеној заштитном колоном. Оптимална ефикасност сепарације је добијена коришћењем брзине протока од 0,75 мЛ/мин, температуре колоне од 35 степени; растварачи мобилне фазе били су: (А) 0,5 процената мравље киселине (Сигма Алдрицх веће или једнако 95 процената) у води милли-К (Сигма Алдрицх) и (Б) ацетонитрил (Сигма Алдрицх веће или једнако 99,9 процената) ; Протокол елуирања градијента је био: 35 процената Б до 60 процената Б(т=8мин), 60 процената Б до 90 процената Б(т=13мин), 90 процената Б до 95 процената Б(т{{29 }} мин,2-мин задржавање), 95 процената Б до 35 процената Б（т=17 мин, 4-мин задржавање）, укупно време рада, 21 мин, ињекције узорака 50μЛ и детекција је извршена праћењем сигнала апсорбанције на 365 нм.

The calibration curves were made up by injecting 5 solutions(in triplicate) containing their respective standards covering the range of linearity 10-120mg/L and were characterized by a correlation coefficient (R7)>0.976. Изведене су три аналитичке реплике за сваку експерименталну реплику.

3.4.2. Анализе антоцијанина течном хроматографијом високих перформанси

Анализе нативних антоцијанина су обављене помоћу ХПЛЦ Схимадзу ЛЦ10 АДВП апарата (Схимадзу Италија, Милано, Италија) опремљеног СЦЛ-10АВП системским контролером, две ЛЦ-10АДВП пумпе за стварање потребног градијента растварача, детектор СПД-М 10 АВП, и систем за убризгавање пун Рхеодине модел7725 (Рхеодине, Цотати, ЦА, УСА). Према методи описаној у ОИВ Цомпендиум оф Интернатионал Метходс оф Аналисис оф Вине анд Мустс [37].

ХПЛЦ растварачи су били следећи: растварач А: вода милли-О (Сигма-Алдрицх, Милано, Италија)/мравља киселина (Сигма-Алдрицх већи или једнак 95 процената)/ацетонитрил (СигмаАлдрицх већи или једнак 99,9 процената) (87:10:3)/в; растварач Б: вода/мравља киселина/ацетонитрил (40:10:50)о/в. Градијент је био: услови нултог времена 94 процента А и 6 процената Б; након 15 минута, пумпе су подешене на 70 процената А и 30 процената Б, на 30 минута на 50 процената А и 50 процената Б, на 35 минута на 40 процената А и 60 процената Б, на 41 мин, на крају анализе, на 94 процента А и 6 процената Б. Време поновне еквилибрације од 5 минута је примењено пре узастопне анализе како је известио [38]. Колона коришћена за анализе је била вода

Колона кугле сфере (Ц 18, супстрат силицијумских честица, ОДС2 250 ×4,6 мм, пречник честица 5 μм, величина пора 80) ​​са предколоницом. Количина од 50 μЛ калибрационих стандарда или вина је убризгана на колону. Детектовани су сигнали апсорбанције на 520 нм. Осетљивост детектора је била 0,01 јединица апсорпције пуне скале (АУФС). Сви узорци су филтрирани кроз 0,45 ум Дурапоре мембранске филтере (Миллипоре-Иреланд) у стаклене бочице и одмах убризгани у ХПЛЦ систем.

Калибрациона крива је добијена убризгавањем 5 раствора (у три примерка) који садрже растуће концентрације малвидин{1}}моноглукозида (Ектрасинтхесе, Лион, Француска). Калибрација је окарактерисана коефицијентом корелације (Р')=0.996. Опсег линеарности калибрационе криве био је 2-200 мг/Л. Прецизност коришћене методе тестирана је са шест поновљених анализа узорка црног вина који садржи 118,4 мг/Л укупних мономерних антоцијана. Коефицијент варијације је укључен између 1,1 процената (за малвидин 3-моноглукозид) и 9,1 процената (за малвидин 3-(6ИИ-кумароил)-глукозид) и показао је добру поновљивост ХПЛЦ анализе. Концентрације мономерних антоцијанина изражене су као мг/Л малвидин{16}}моноглукозида.

Фракционисање вина РЛО2, РМО2 и РХО2 изведено је према ОИВ методи анализе коришћењем истог ХПЛЦ Схимадзу ЛЦ10 АДВП као што је горе наведено. Изведене су три аналитичке реплике за сваку експерименталну реплику.

3.4.3. Масена спектрометрија високе резолуције електроспрејом (ХР ЕСИМС) анализе црних вина

ХПЛЦ-одвајање црних вина спроведено као што је горе описано дало је три фракције за свако вино. Прва фракција је сакупљена од 15 до 25 мин (фракција 1), друга од 25 до 30 мин (фракција 2), а трећа фракција (фракција 3) од 30 мин до краја хроматографије. трчање (45 мин). Свака сакупљена фракција је осушена, растворена у метанолу и анализирана помоћу ХР-ЕСИМС у континуираном убризгавању протока у режиму позитивних јона. ХР ЕСИМС експерименти су изведени на Агилент 1260 Инфинити ИⅡ ХПЛЦ кватернарном систему спојеном на линеарну замку јона ЛТКОрбитрап КСЛ хибридну Фуријеову трансформацију МС (ФТМС) инструмент опремљен са ЕСИ ИОН МАКС извором (Тхермо-Фисхер). Коришћена су следећа подешавања извора (опсег масе м/з 100-2000): напон прскања 4,5 кВ, температура капиларе 300 степени, капиларни напон 15 В, гас омотача 20 и помоћни гас 21 (произвољне јединице), напон цевног сочива 140 В, и 25 процената енергије судара. Прорачун елементарних формула је спроведен коришћењем софтвера Ксцалибур в 2.0.7 са ограничењем толеранције масе од 5 ппм.

3.4.4. НМР експерименти

Количина од 2 мЛ сваког узорка вина (РХО2, РМО2 и РЛО2) је лиофилизована и растворена у 700 μЛ ЦДОД(6Х 3.31;5ц49.0ппм). НМР експерименти су изведени на спектрометру Вариан Унити Инова 700 опремљеном са 13Ц Енханцед ХЦН хладном сондом и коришћењем Схигеми 5 мм НМР цеви. Коришћена је Х-НМР стандардна Вариан импулсна секвенца.

3.4.5.Стандардне хемијске анализе и спектрофотометријска мерења

Према „ОИВ Цомпендиум оф Интернатионал Вине анд Мост Аналисис оф Вине анд Мост Аналисис 2007“[37], стандардна хемијска анализа (јачина алкохола израчуната по запремини, редукујући шећер, укупна киселост, пХ, испарљива киселост, јабучна киселост и укупна сува материја ) је измерено.

Спектрофотометријске анализе вршене су спектрофотометром Јенваи 7305. Хроматске карактеристике, интензитет боје и нијанса одређивани су према ОИВ методама [37]. Интензитет боје је одређен као збир абс 420 нм, абс 520 нм и абс 620 нм, а нијанса као однос абс 420 нм/абс 520 нм.

БСА-реактивне танине, кратке полимерне пигменте (СПП), велике полимерне пигменте (ЛПП) и укупне феноле су одредили Харбертсон ет ал. тест [22]. Кратки полимерни пигменти (СПП) и велики полимерни пигменти (ЛПП) добијени су комбиновањем анализе супернатанта добијеног након преципитације протеина коришћењем говеђег серумског албумина БСА

(Сигма-Алдрицх) са бисулфитним бељењем пигмената у вину. Комплекс БСА-танина у пелету је поново растворен, додат гвожђе хлорид и очитан на 510 нм. Укупни феноли су квантификовани очитавањем узорка на 510 нм на следећи начин∶ 50 μЛ вина је додато у 825 μЛ пуфера Ц и очитано на спектрофотометру као слепи раствор. Након додавања 125 μЛ гвожђе хлорида, узорак је поново очитан да би се квантификовала количина фенола који реагује на гвожђе.

Ванилин-реактивни флавани (ВРФ) одређени су према Гамбути ет ал. [39]. Укратко, 750 μЛ раствора ванилина (4 процента у метанолу) додато је у 125 μЛ разблаженог вина и, након 5 минута, додато је 375 μЛ концентроване хлороводоничне киселине. После 15-мин инкубације смеше на 20 степени, апсорбанца је одређена на 500 нм и очитана у односу на слепи раствор у коме је коришћен чисти метанол уместо раствора ванилина. Концентрације су израчунате као (плус)-катехин (мг/Л).

3.4.6. Статистичка анализа

Квантитативни подаци су упоређени коришћењем Тукијевог поступка најмањих разлика, све варијансе су резултирале хомогено. Када варијансе нису биле хомогене, подаци су анализирани коришћењем Крускал-Волисовог теста. Када су резултати Крускал-Волисовог теста били значајни (стр<0.05), the="" significance="" of="" between-group="" differences="" was="" determined="" by="" the="" bonferroni-dunn="" test="" (5%="" significance="" level).="" these="" analyses="" were="" performed="" using="" xlstat(version="" 2013.6.04;="" addinsoft,="" paris,="" france).="" all="" data="" are="" means="" of="" three="">

4. Закључци

Резултати добијени у овој студији потврдили су да различити садржаји кисеоника у флашираном вину утичу на старење и оксидацију вина.

Управљање кисеоником у вину Аглианицо помоћу колектора мембране од шупљих влакана од полипропилена утврдило је, после 11 месеци одлежавања, нижи садржај слободног и укупног СО2 у узорку са вишим нивоом раствореног кисеоника. Исто понашање уочено је и код вина Фалангина са повећањем ацеталдехида у узорку са вишим нивоима кисеоника.

Што се тиче фенолних једињења, већи губитак укупних нативних антоцијана уочен је у црвеним винима. Њихов садржај је био већи у вину са мањом концентрацијом кисеоника. Међутим, губитак укупних нативних антоцијана није утицао на параметре боје вина, као што су интензитет и тон боје.

БСА-реактивни танини и ванилин-реактивни флавани били су нижи у узорцима који садрже средњи и низак ниво кисеоника у односу на узорке са већим садржајем кисеоника. То је због чињенице да кисеоник, учествујући у реакцијама оксидације, учествује у формирању полимерних пигмената. Као што се и очекивало, у црним винима са највећим садржајем раствореног кисеоника након третмана мембранским контактором, Витисин Б, етилиден-премошћени димери и ацеталдехид били су у већој количини у односу на вина која су третирана са мањим садржајем кисеоника у фази пре флаширања. .

У закључку, деоксигенација вина од стране извођача мембрана могла би бити погодна техника за винску индустрију како би се спречиле све оне оксидативне појаве које би могле да промене коначни квалитет црних и белих вина које утичу на садржај сумпор-диоксида и ацеталдехида (посебно у белим винима). . Ипак, енолози морају узети у обзир да смањење садржаја кисеоника може утицати на стабилност боје црних вина.

Додатни материјали: Следећи материјали су доступни на мрежи. Слика С1: Увећања Х-НМР спектра вина РХО, РМО2 и РЛО, регистрована у ЦД: ОД. Слика С2: Структура малвидин 3-О-глукозида и релативни ХР ЕСИМС у режиму позитивних јона. Слика С3: Структура Витисина Б и релативног ХР ЕСИМС у режиму позитивних јона. Слика С4: Структура димера премошћеног етилиденом који се састоји од једне јединице малвидин 3-О-глукозида (доле) и једне јединице (епи)катехина (горе) са релативним ХР ЕСИМС у режиму позитивних јона. Слика С5: Структура димера премошћеног етилиденом који се састоји од две јединице малвидин 3-О-глукозида, од којих је она на дну у облику флавилијума, а она на врху у свом псеудо базном облику, заједно са релативни ХР ЕСИМС у режиму позитивних јона.

Референце

1. Ватерхоусе, АЛ; Лаурие, ВФ Оксидација винских фенола: критичка процена и хипотезе. Сам. Ј. Енол. Витић. 2006, 57, 306–313.

2. Данилевицз, ЈЦ Механизам аутооксидације полифенола и учешће сулфита у вину: кључна улога гвожђа. Сам. Ј. Енол. Витић. 2011, 62, 319–328. [ЦроссРеф]

3. Николантонаки, М.; Ватерхоусе, АЛ Метода за квантификацију стопа реакције кинона са нуклеофилима релевантним за вино: кључ за разумевање оксидативног губитка сортних тиола. Ј. Агриц. Фоод Цхем. 2012, 60, 8484–8491. [ЦроссРеф] [ПубМед]

4. Елиас, РЈ; Андерсен, МЛ; Скибстед, ЛХ; Ватерхоусе, АЛ Идентификација интермедијера слободних радикала у оксидованом вину коришћењем хватања спина електрон парамагнетном резонанцом. Ј. Агриц. Фоод Цхем. 2009, 57, 4359–4365. [ЦроссРеф] [ПубМед]

5. Оливеира, ЦМ; Ферреира, АЦС; Де Фреитас, В.; Силва, АМ Механизми оксидације који се јављају у винима. Фоод Рес. Инт. 2011, 44, 1115–1126. [ЦроссРеф]

6. Моулс, Л.; Фулцранд, Х. УПЛЦ-ЕСИ-МС студија оксидационих маркера који се ослобађају деполимеризацијом танина: ка бољој карактеризацији еволуције танина у односу на обраду хране и пића. Ј. Масс Спецтром. 2012, 47, 1450–1457. [ЦроссРеф] [ПубМед]

7. Ватерхоусе, АЛ Вине фенолицс. Анн. НИ Ацад. Сци. 2002, 957, 21–36. [ЦроссРеф]

8. Росенфелд, Е.; Сцхаеффер, Ј.; Беаувоир, Б.; Салмон, ЈМ Изолација и својства про митохондрија из ћелија квасца анаеробне стационарне фазе. Антоние Ван Лееувенхоек 2004, 85, 9–21. [ЦроссРеф]

9. Јараута, И.; Цацхо, Ј.; Ферреира, В. Истовремени феномени који доприносе формирању ароме вина током одлежавања у храстовом дрвету: аналитичка студија. Ј. Агриц. Фоод Цхем. 2005, 53, 4166–4177. [ЦроссРеф]

10. Синглтон, ВЛ; Троусдале, Е.; Заиа, Ј. Оксидација вина. 1. Млада бела вина повремено изложена ваздуху. Сам. Ј. Енол. Витић. 1979, 30, 49–54.