Аптамер апликације у неуронауци, део 1

Апстракт:

Као преовлађујући узрок инвалидитета, неуролошке болести су добиле велику пажњу глобалне здравствене заједнице.

Нервни систем је важан део људског тела. Одговоран је за људску перцепцију, размишљање, кретање, психологију и емоције. Међутим, неки људи могу имати неуролошке проблеме који утичу на њихово памћење. Болести нервног система се односе на патолошке промене у централном нервном систему и периферном нервном систему, као што су мождани удар, Паркинсонова болест, Алцхајмерова болест итд. Ове болести ће утицати на памћење, али их сви можемо превазићи активним методама. Побољшајте га.

Први је мождани удар. Према статистикама, милиони људи сваке године су погођени можданим ударом, а један од најчешћих симптома је губитак памћења. Мождани удар је веома штетан за тело јер утиче на делове мозга који снабдевају кисеоником и крвљу. Међутим, мождани удар можемо спречити вежбањем и променом навика у исхрани. На пример, правилно вежбање, одржавање нормалне тежине и здрава исхрана могу ефикасно смањити ризик од можданог удара и тако одржати боље памћење.

Следећа је Паркинсонова болест. Ово је болест поремећаја кретања узрокована смрћу неурона. Поред кретања, Паркинсонова болест може утицати и на памћење. Студије показују да већина пацијената развија когнитивно оштећење, укључујући губитак памћења. Међутим, пацијенти могу предузети различите мере како би одложили напредовање болести, као што је редовно стручно лечење и рехабилитациона обука. Имати хобије као што су слушање музике, читање и учење нових вештина такође може бити од користи у опуштању мозга и опоравку памћења.

Коначно, ту је Алцхајмерова болест. То је болест која узрокује когнитивно оштећење, а губитак памћења је један од најочигледнијих и најчешћих симптома. Међутим, Алцхајмерова болест је такође болест која се може опоравити. Истраживања показују да вежбање, здрава исхрана, учење нових вештина и волонтирање могу помоћи у успоравању напредовања болести и побољшању памћења.

Увек треба да задржимо позитиван став и да користимо активне методе за превенцију и лечење неуролошких болести како бисмо побољшали наше памћење. Чак и ако смо погођени, можемо предузети различите мере да побољшамо своју отпорност и способност да се боримо против болести. Све док истрајемо, наћи ћемо бољи, здравији пут за превенцију и лечење губитка памћења. Види се да морамо побољшати памћење, а цистанцхе десертицола може значајно побољшати памћење јер је цистанцхе десертицола традиционални кинески медицински материјал који има много јединствених ефеката, од којих је једно побољшање памћења. Ефикасност Цистанцхе десертицола потиче од вишеструких активних састојака које садржи, укључујући танинску киселину, полисахариде, флавоноидне гликозиде, итд. Ови састојци могу унапредити здравље мозга на различите начине.

Кликните на Знај да бисте побољшали краткорочно памћење

Преко милијарду људи пати од једног од следећих неуролошких поремећаја: деменције, епилепсије, можданог удара, мигрене, менингитиса, Алцхајмерове болести, Паркинсонове болести, мултипле склерозе, амиотрофичне латералне склерозе, Хантингтонове болести, прионитиса или тумора мозга. Могућности дијагнозе и лечења су ограничене за многе од ових болести.

Аптамери, будући да су мали и неимуногени молекули нуклеинске киселине који се лако хемијски модификују, нуде потенцијалне дијагностичке и терапеутске примене да задовоље ове потребе.

Овај преглед обухвата пионирске студије у примени аптамера, које обећавају будућу дијагностику и лечење неуролошких поремећаја који представљају све страшније здравствене изазове широм света.

Кључне речи: аптамер; неуронаука; неуролошке болести; неуролошки поремећаји; неуротоксини; рак.

1. Увод

Аптамери су једноланчани ДНК, РНК или синтетички КСНА молекули који се могу савијати у јединствене тродимензионалне (3Д) структуре помоћу којих везују своје циљне молекуле са високом специфичношћу и афинитетом [1,2].

Приступ одабиру аптамера постигнут је 1990. године у три одвојене групе [3–5]. Метода је сада позната као систематска еволуција лиганада експоненцијалним обогаћивањем (СЕЛЕКС). Од тада, многи аптамери су одабрани за употребу у областима основне науке, а све већи број аптамера је недовољно развијен за примену у терапији, дијагностици и имиџингу [6–10].

СЕЛЕКС метода симулира Дарвинову еволуцију ин витро. Укључује неколико кругова селекције, а после сваке рунде се врши експоненцијална амплификација „најбољих“ олигонуклеотида (олиго).

Једна рунда традиционалног СЕЛЕКС-а укључује три корака по редоследу (1) инкубирање жељеног циљног молекула са скупом олигоа са централним регионом од 20–60 нуклеотида рандомизоване секвенце окруженим терминалним регионима константне секвенце који ће бити шаблони за касније ланчане реакције полимеразе (ПЦР). ), (2) ухватити олиго у групи који успешно везују циљ и (3) амплифицирати ухваћене олиго помоћу ПЦР или реверзне транскрипције-ПЦР (рт-ПЦР), у зависности од типа олига, ДНК или РНК.

Укључени су и кругови контра-селекције, у којима се скуп нуклеинских киселина преноси преко празне потпорне матрице, без жељене мете или преко потпорне матрице са једним или више других молекула који могу бити структурно повезани са циљним молекулом.

У контра-селекцији, олигои који не везују носећу матрицу или структурно сродне молекуле се хватају и настављају кроз више кругова СЕЛЕКС-а.

Контраселекција се врши у многе сврхе, као што је елиминисање олигоа који ступају у интеракцију са (1) носећом матриксом, (2) аналозима или молекулима који су структурно повезани са метом, или (3) молекулима присутним у високим концентрацијама у биолошкој матрици (као што је серум или екстракт ткива) у којој ће изабрани аптамер функционисати.

Главни циљ контра-селекције је повећање специфичности аптамера за жељену мету у односу на друге потенцијалне молекуларне конкуренте. Поред конвенционалног СЕЛЕКС-а, недавно развијени СЕЛЕКС за пребацивање структуре постаје популаран [11–13].

У овом приступу, од олигоса се тражи да промене своје структуре када ступе у интеракцију са метом, да би се одвојили од комплементарне секвенце хватања. Ово осигурава да одабрани аптамери мењају структуру након везивања лиганда. Развијене су и друге алтернативне СЕЛЕКС методе укључујући ЦЕ-СЕЛЕКС, Целл-СЕЛЕКС и ин виво СЕЛЕКС, као што је сажето приказано у табели 1.

Сасвим је могуће комбиновати различите СЕЛЕКС процедуре да би се развиле још сложеније технике. Након што СЕЛЕКС одабере аптамере, они се даље модификују да би побољшали своје специфичности и афинитете помоћу неколико приступа који се, у целини, могу назвати сазревањем.

Постоји неколико разлога за одабир и сазревање аптамера. Прво, на структуре аптамера и интеракције аптамера и циља утичу температура и компоненте пуфера, укључујући јоне, јонску снагу и пХ.

Дакле, једна од најважнијих тачака у дизајну СЕЛЕКС-а је да се опонаша окружење (биолошка матрица или састав соли/пуфера) током селекције у којој је пронађена молекуларна мета аптамера и доћи ће до интеракције између аптамера и мете.

Одабир одговарајућих пуферских састава и температура инкубације обезбедиће оптималне перформансе изабраних аптамера у условима у којима ће се примењивати [4,30–32].

Друго, стабилност аптамера би можда требало да се побољша, пошто су ДНК и РНК аптамери потенцијалне мете за нападе нуклеазе. Ово је посебно случај за РНК, због 20ОХ групе, коју рибонуклеазе користе у електрофилном нападу фосфата окоснице нуклеинске киселине за хидролизу.

Дакле, РНК је лабилнија на високе температуре и пХ од ДНК. Аптамери се могу сазрети хемијским модификацијама после селекције да би се превазишла ова осетљивост. Међутим, такве модификације могу довести до тога да аптамер изгуби специфичност и/или афинитет.

Због тога је обично боље укључити модификоване нуклеотиде током СЕЛЕКС-а. Многе могуће модификације аптамера су наведене у табели 2.

Могу се одабрати аптамери који селективно везују већину вируса, ћелија, бактерија, протеина, токсина и пептида са високим афинитетима [45–48]. Могу се користити неколико пута без приметног ометања активности. Другим речима, могу се одвојити од својих мета за даљу употребу.

Насупрот томе, антитела се могу користити само неколико пута пре него што изгубе функционалност. Аптамери нуклеинске киселине такође могу сазрети да буду стабилнији од антитела и ензима, посебно на вишим температурама [2].

Штавише, када је ова секвенца аптамера позната, његова хемијска синтеза и пречишћавање до хомогености су високо поновљиви и јефтини. Ова својства дају аптамерима потенцијал да замене антитела као компоненте сенсинг јединица [49].

Флексибилност структура аптамера и њихова способност да „маскирају“ регионе аптамерне секвенце комплементарним олигосом пружају опције за сигнализацију које омогућавају уградњу аптамера у многе сензорске платформе, које се не могу лако прилагодити антителима. Ова својства мотивишу развој биосензора заснованог на аптамеру [50–52].

Развијање нових алата за дијагнозу је једно од најистакнутијих области у пољу биосензора, са многим истраживачима који желе да створе лаке, ефикасне и јефтиније методе за постизање ране дијагнозе и прецизне медицине.

Укључивање аптамера у биосензоре (назване "аптасензори") укорењено је 1990-их.

Рани пример аптамера као елемената за биопрепознавање је оптички биосензор који је користио флуоресцентно обележене аптамере против хумане неутрофилне еластазе у хомогеном тесту [53].

Од тада су пријављени многи типови дизајна аптасензора, већина са аптамерима на чврстим носачима, као и са електрохемијским, оптичким, механичким и акустичним сигналима [45,54–56]. Неки примери су разматрани касније у овом чланку.

Аптамери су такође примењени у терапији. Модификације које резултирају продуженим полуживотом и побољшаном фармакокинетиком чине неке аптамере добрим опцијама за клиничку примену. У поређењу са антителима, аптамери су много мање имуногени, а њихова дејства могу бити инхибирана реверзним комплементарним олигонуклеотидима (Мунзар ет ал., 2019).

Ове важне карактеристике препоручују аптамере за развој као терапеутике. Мацуген (пегаптаниб натријум), који селективно препознаје фактор раста васкуларног ендотела (ВЕГФ), био је први аптамер који је одобрен као терапеутски агенс (Тобин, 2006).

Од тада, неколико аптамера је достигло различите фазе клиничких испитивања у којима се тестирају за лечење медицинских стања као што су карцином малих ћелија плућа, поремећај повезан са вон Виллебрандфактором, ангиоми и карциноми бубрежних ћелија [51,57–60].

Друга потенцијална терапијска примена аптамера укључује системе за испоруку [61,62]. Да би се постигли ефикасни резултати у овим системима, аптамери би требало да препознају протеине ћелијске површине у њиховим нативним облицима.

Целл-СЕЛЕКС је развијен да селектује против протеина на површини ћелије које је често тешко пречистити у њиховим природним облицима [63]. Аптамер који препознаје протеин површине ћелије може да кооптира рецептор да интернализује терет везан за аптамер. Овим методом се могу одабрати аптамери за рецепторе који су примарно експримирани на једном типу ћелије који може бити циљан ин виво [57].

На пример, развијени су анти-ПСМА (простата-специфиц мембранеантиген) аптамери за испоруку сиРНК туморима код мишева или култивисаних ћелија [62,64–66].

У неуронауци, употреба аптамера је до сада била ограничена, иако има веома широк спектар потенцијалних примена. Аптамери су пријављени као могуће опције лечења неуродегенеративних болести које резултирају губитком структуре и функције централног нервног система (ЦНС), укључујући Алцхајмерову болест (АД), Паркинсонову болест (ПД), Кројцфелд-Јакобову болест, болести моторних неурона и Хантингтонову болест. болест (ХД) (Слика 1). Тренутно се око 50 милиона људи у свету суочава са деменцијом, за коју су глобални трошкови здравствене заштите близу билион америчких долара годишње.

То чини деменције једним од највећих медицинских и економских проблема нашег друштва [67]. Такође, према Уједињеним нацијама и Свјетској здравственој организацији, процјењује се да ће се свјетска популација старија од 65 година удвостручити до 2050.

Стога ће неуродегенеративне болести зависне од старости захтевати све веће трошкове за дијагностику и лечење [67].

Ови критични захтеви за методама за олакшавање ране дијагнозе и нове терапијске примене могу бити испуњени помоћу аптамера, који би такође могли бити решења за неке од основних компликација [68,69].

Аптамери се развијају за примену у технологијама снимања мозга (МРИ, ПЕТ, итд.), визуализацији неуротрансмитера, дијагнози и терапији за туморе мозга и друге болести повезане са мозгом. У многим од ових приступа, аптамери су означени радиотрасерима, као што је флуор-18 за ПЕТ снимање [70]. У овом прегледу ћемо разговарати о достигнућима и изазовима примене аптамера на снимање мозга и неуронске болести.

2. Молекуларна детекција

2.1. Детекција неуротоксина
Неуротоксини су хемијски разнолика група фармаколошки активних једињења. Они испољавају јасно биолошко дејство на нервни систем организама, али се разликују по својој хемијској структури и механизмима деловања.

Они мењају акционе потенцијале и ометају пренос нервних импулса. Да би се правилно проценили њихови ризици по људско здравље и утицај на животну средину, неопходно је користити довољно осетљиве технике за њихову тачну идентификацију.

Аптамери нуклеинске киселине су коришћени за валидацију присуства ових токсина у води и биолошким узорцима са високом осетљивошћу и селективношћу [71]. Објављене су студије које демонстрирају тачну идентификацију ботулинум неуротоксина (ботулинум А, Е), сакситоксина, бревотоксина, параквата и тетродотоксина помоћу аптасензора.

Ботулински неуротоксини (БоНТ) су међу најсмртоноснијим неуротоксинима и потенцијално би се могли користити као агенси биотероризма. Да би се одговорило на кључну потребу за осетљивим, ефикасним системом детекције у реалном времену за БоНТ, коришћен је СЕЛЕКС базиран на сол-гелу за изолацију ДНК аптамера против ботулинум неуротоксина типа Е (БоНТ-Е) [47].

Секвенце аптамеркандидата, након петог круга, анализиране су секвенцирањем следеће генерације (НГС) и окарактерисани су високофреквентни аптамери. У овим породицама аптамера, аптамерБТ5.6 је показао висок афинитет, од 53 нМ Кд, за БоНТ-Е и био је имобилизован на графеноксидној платформи. Овај сензор је приказао 0.83 нМ границу детекције (ЛоД) за БоНТ-Е.

Бревотоксини (БТКС) и сакситоксини су морски неуротоксини који узрокују неуролошко тровање шкољкама (НСП). БТКС се одликују високом токсичношћу и брзим почетком НСП. Техничке потешкоће у вези са њиховом анализом подстакле су истраживаче да траже алтернативне, ефикасне и јефтине методе детекције ових јаких неуротоксина.

За ову сврху развијен је електрохемијски аптасензор за детекцију БТКС-2, за који су ови изабрани ДНК аптамери окарактерисани коришћењем спектроскопије електрохемијске импедансе (ЕИС) и флуоресценције.

Аптамер БТ10, са афинитетом од 42 нМ за БТКС-2, уграђен је у конкурентни импедиметријски биосензор без етикете који је показао границу детекције од 95 пМ БТКС-2.

Овај аптасензор је био у стању да открије БТКС-2 у екстракту шкољке са шиљцима са поузданим одговором у присуству матрице шкољки [72]. Као друга класа морских неуротоксина, сакситоксин је окарактерисан за јавноздравствени значај.

Нове студије су морале бити развијене као погодне алтернативе због техничких и етичких питања тренутно примењених система. Да би се одговорило на ову потребу, развијен је компетитивни аптасензор оптичке биослојне интерферометрије без етикете. Биосензор има границу детекције од 1,66 нМ за сакситоксин, са високим степеном селективности и осетљивости, добром стабилношћу и способношћу брзе детекције [73].

Слично морским токсинима, неуротоксини који се ослобађају након уједа змије спадају међу најмоћније и смртоносне токсине. Нажалост, конвенционална дијагностика угриза змије заснована на тестовима коагулације крви и клиничким симптомима не може пружити тачну дијагнозу. Такође, варијације перформанси антитела зависне од серије компликују њихову употребу у дијагностици.

Скраћена верзија -Ток-ФЛ аптамера високог афинитета, првобитно одабрана против бунгаротоксина Бунгарус мултицинцтус (-Ток-Т2) са већим афинитетом (Кд=2.8 нМ) од родитељског -Ток-ФЛ (18 нМ), примењен је у формату теста аптамера везаног за ензиме.

У овој поставци, -Ток-Т2 аптамер је могао да открије -токсин у само 2 нг сировог отрова, што је показало његов потенцијал за откривање отрова Бунгарус цаерулеус [74].

2.2. Детекција неуротрансмитера

Да би се истражиле функционалне сложености мозга, може се користити праћење неуротрансмитера и сигналних путева. Неуротрансмитери су неопходни за пренос информација између ћелија и играју кључну улогу у неуролошким поремећајима као што су епилепсија, Паркинсонова болест (ПД) и Алцхајмерова болест (АД).

У неколико студија, аптамери специфични за допамин, епинефрин или серотонин су коришћени за развој биосензора заснованих на аптамеру за детекцију неуротрансмитера, ин виво и ин витро [75].

Неуротрансмитер катехоламина, допамин (ДА) регулише аспекте људског метаболизма и функције кардиоваскуларног и бубрежног система. Показало се да су неколико неуродегенеративних болести, посебно ПД, директно повезане са абнормалним метаболизмом ДА [76].

Стога је развој високо осетљивих и селективних биосензора за одређивање ДА важан у биолошким системима. Први РНК аптамер против ДА, допа2, везао је ДА са афинитетом представљеним са Кд=2.8 нМ [77].

Користећи овај аптамер, електрохемијска аптасенсорбована аптасенсорбована без етикета на композитном филму графен-полианилин успешно је детектовала присуство нехуманог серума ДА, са ЛоД од 1,98 пМ [78]. У новијој студији, други ДА аптасензор је развијен састављен од ДНК аптамера као сензора и композита колаген графен оксида коже амура (ГЦСЦ-ГО) као претварача.

Композит је припремљен ултразвучном обрадом и окарактерисан инфрацрвеном (ИР) и Рамановом спектроскопијом, атомском форцемикроскопијом и ЕИС. Овај систем је укључивао имобилизацију аптамера на колаген праћену диференцијалном пулсном волтаметријом.

Иако је аптасензор показао већи ЛоД од 0.75 нМ, у поређењу са ранијим сензором са 2 пМ, показао је високу селективност за сувише блиско повезана једињења ДА и прецизно измерио ДА у присуству 10% серума [79].

За анализу различитих молекула са слободном ознаком, високом осетљивошћу и селективношћу, недавно је објављен микрокантилеверски сензор са аптамерима. Сензор се састоји од низа од 12 микрокантилевера модификованих тиолованим ДА аптамерима и користи златне честице (АуНП) коњуговане са делом ДНК који је комплементаран ДАаптамеру на површини микрокантилевера.

Првобитно хибридизовани са ДА аптамером, коњугати АуНП-ДНК се ослобађају када аптамер веже ДА, што повећава површински стрес низа за око 15 пута и повећава отклон.

Систем има линеарни одзив у опсегу од 0.5 до 4 µМ ДА са ЛоД од 77 нМ. Његова специфичност је демонстрирана са 12 структурних и функционалних аналога укључујући Л-ДОПА, од којих ниједан није иницирао отклоне [80].

For more information:1950477648nn@gmail.com